Name: Isolamento de células primário do mouse trofoblasto e Ensaio invasão do trofoblasto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprenda a isolar células primárias de trofoblasto de placenta de camundongo e realizar ensaios de invasão em matrigel. Este método permite estudar o comportamento celular e a biologia placentária in vitro.

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Os autores gostariam de agradecer à equipa Serviços Criativos da Universidade de Missouri Centro de Apoio Acadêmico, que produziu este vídeo. Este trabalho foi financiado pelo Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Development Saúde e Humanos do Instituto Nacional de Saúde, subvenção número HD055231

1. Dissecção da placenta do mouse <ol><li> Configure pares de acasalamento dos ratos. </li><li> Em cada um dos dias seguintes, para verificar a presença de um tampão copulatório. O dia em que é detectada uma ficha é considerada 0,5 dias pós-coito (dpc) 7. </li><li> Placentas podem ser obtidas na fase desejada da gestação, com uma dissecção limpa do início placenta possível com o desenvolvimento da placenta madura em d 10,5. Aqui, nós demonstramos 14,5 dpc. Nos volumes indicados, 40-60 placentas de 10,5 dpc, e 10-20 placentas de 14,5 dpc produzirá uma camada de células de trofoblasto claramente visível. </li><li> Eutanásia do rato prenhe, e remover o útero, o colo do útero em corte, e ao longo da mesométrio. </li><li> Com uma tesoura afiada, corte entre cada concepto (Figura 1A). </li><li> Utilizando dois pares de pinças, segure a parede uterina no bordo de corte, e separar, a remoção do miométrio (Figura 1B) . Um par serrilhada, fórceps moderadamente finas (curvo ou reto), além de um par de fórceps muito finas (# 5, por exemplo) é recomendado. </li><li> Em frente à placenta, abra a decídua com pinças ou tesouras, expondo placenta. Agarrando o tecido uterino com um par fórceps, deslize por baixo da outra pinça para separar a placenta (Figura 1C). Se o feto, necessário separar e da placenta. Não é possível remover todo o tecido decidual por dissecção sem também perder tecido placentário, mas o tecido decidual adicional (pálido) pode ser removida da superfície da placenta suavemente por descamação com um fórceps. Contamos com o gradiente de Percoll para posterior purificação. </li><li> Coloque cada placenta dissecada em 25 ml de tampão gelada dissociação em um tubo de 50 ml cônico até que todas as dissecações estão completos. Em fases posteriores, grosseiramente picada tecido placentário com tesoura ou lâmina de barbear antes de se transferir para o buffer dissociação. </li></ol>tle "&gt; 2 Isolamento. das células trofoblásticas <ol><li> Vagamente tubo tampa cônica e coloque em banho a 37 ° C por 45-60 minutos. Misturar a solução de dissociação por pipetagem vigorosa aproximadamente a cada 10 min. O tempo de digestão total deve ser acompanhada de perto e provavelmente vai exigir alguma tentativa e erro para conseguir a recuperação celular ideal. Os tecidos devem ser capazes de ser passado através de uma pipeta de 10 ml, mas pedaços visíveis de tecido permanecerá. Overdigestion irá resultar em sobrevivência celular pobre e a eficiência de plaqueamento. A sobrevivência das células e eficiência de plaqueamento óptima ocorrerão quando aglomerados de algumas células estão presentes, e não quando a dissociação completa seja alcançada. Por outro lado, underdigestion levará a pureza reduzida após separação percoll. Quando o ponto de digestão tiver sido atingido, o tubo de colocar em gelo para parar a actividade da colagenase. </li><li> Filtrar a solução através de um filtro celular para remover os materiais não digeridos, e centrifugar @ 500 xg durante 5 minutos. </li><li> Para lavar, removasobrenadante e ressuspender as células em 10 ml de solução de lavagem. Centrifugar @ 500 xg durante 5 minutos. </li><li> Durante a centrifugação, preparar uma solução de Percoll, misturando 9,6 ml de Percoll, 13,4 ml de solução de lavagem e de 1,1 ml de meio de 10x 199 em um tubo de 50 ml, apropriado para centrifugação de alta velocidade. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 2 ml de solução de lavagem. </li><li> Adicionar células a solução de Percoll e centrifuga @ 30000 xg durante 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Retire o tubo de centrífuga, sem perturbar o gradiente. Para visualizar o gradiente tubo lugar, em frente de uma fonte de luz brilhante. Localizar a banda trofoblasto (Figura 2) e, com uma pipeta de aspiração, tendo o cuidado de não perturbar a banda de células vermelhas do sangue a seguir. Volume da banda trofoblasto será 5-8 ml. </li><li> Transferir células trofoblásticas para um tubo cónico de 50 ml. Adicionar solução de lavagem para um volume total de 45 ml. </li><li> Centrifugar @ 500 xg durante 5 minutos. Remover o sobrenadante e ressuspender em cultura medihm (NCTC-135). As células podem ser cultivadas em camada fina matrigel ou de plástico de cultura de tecidos a 37 ° C e 5% CO 2. No dia 10,5, cada placenta produz cerca de 50.000 células vivas, dos quais 80-90% são citoqueratina positivas. </li></ol> 3. Ensaio de invasão do trofoblasto <ol><li> Adicionar 1-2 ml meio de cultura (NCTC-135) para cada uma das câmaras de matrigel e incubar a 37 ° C, 5% CO 2 por 30-90 min. </li><li> Remover meio e adicionar 1,5 ml x 10 5 células isoladas de fresco em meio de 2 ml de câmara superior. Adicionar 1 ml de meio de câmara inferior para cobrir a superfície inferior da membrana. </li><li> As células de cultura em inserções durante 18-24 horas. </li><li> Células raspar e Matrigel da inserção utilizando um cotonete de espuma. </li><li> Enxaguar o topo e fundo da câmara, em 2 ml de PBS. </li><li> Fix, durante 5 min em 1 ml de paraformaldeído 4% em PBS. </li><li> Stain de enchimento da câmara inferior com 400 ul de DAPI (300 nM), e incubar durante 30 min. </li><li> Lavar três vezes brevemente em PBS. </li><li remover as membranas a partir de pastilhas com uma l afiada bisturi.><li> Adicionar uma gota de 10 ul de meio de montagem (glicerol a 50% em PBS) a deslizar. Utilizando uma pinça, colocar membrana em queda. Adicionar outra gota de 10 ul de meio, em seguida, cuidadosamente lamela. </li><li> Células fotografia e contagem. Certifique-se de orientar adequadamente a membrana (célula voltada para cima ou célula-side down) para o microscópio que está sendo usado. Imagem de J software (National Institutes of Health) inclui uma característica de contagem manual que pode ser utilizado para este fim, como pode o Adobe Photoshop ou um contador manual. </li></ol> 4. Resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Dissecção da placenta de rato. (A) O útero é removido através de corte ao longo dos ovidutos (amarelo), ao longo da superfície mesometrial, e no colo do útero (parte inferior). Conceptos individuais podem então ser separadas por corte com uma tesoura imediata. (B) O uterino parede é removido colocando duas pinças na superfície de corte do útero, e ao rasgamento ao longo do lado anti-mesometrial, perto do feto e para longe da placenta. (C) A placenta é então isolado por meio de agarramento com uma pinça deslizante e uma outra entre a placenta e tecido uterino. Cordão umbilical e outras membranas extra-embrionário pode então ser separado da placenta. <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Percoll separação das células trofoblásticas. Após a centrifugação, três bandas principais será visível, como mostrado em desenhos animados à esquerda, e uma fotografia à direita. A banda superior contém detritos celulares e os fibroblastos e será mais aparente. Uma banda (vermelho) apertado perto da parte inferior que contém as células vermelhas do sangue será visível logo abaixo da banda difusa trofoblasto. Agregados celulares provavelmente visto na banda de trofoblasto, como nos dois mostrada à esquerda da seta na fotografia. ove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Células trofoblásticas invasoras (seta branca) vai passar através da camada de matrigel e os poros da membrana, que aparece sobre a superfície inferior da membrana. Os poros também são visíveis (seta preta). O número de células na superfície da membrana inteira ou uma área de amostra representativa pode ser contado. Uma imagem em tons de cinza de coloração fluorescente DAPI nuclear foi invertido para melhorar a visualização das células. <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> As células trofoblásticas Figura 4. Podem ser identificados, e a pureza da população isolada avaliada, por imunocoloração para citoqueratina 7 (centro, magenta). As células são contrastadas com DAPI (topo, azul). Incorporada imagem de baixo,.

<ol><li>Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+placental+cell+culture+system+for+studying+the+control+of+mouse+placental+lactogen+II+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion.</a> Placenta. 8, 573-585 (1987).</li>
<li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li>
<li>Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+characterization%2C+and+in+vitro+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+human+term+placentae%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae.</a> Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).</li>
<li>Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+reaction+patterns+in+first+trimester+placenta%3A+implications+for+trophoblast+isolation+and+purity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening.</a> Placenta. 21, 733-741 (2000).</li>
<li>Librach, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((92-kD+type+IV+collagenase+mediates+invasion+of+human+cytotrophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts.</a> J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).</li>
<li>Schulz, L. C., Widmaier, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+leptin+on+mouse+trophoblast+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion.</a> Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li>
</ol>

Não temos nada a revelar.

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células trofoblásticas da placenta de rato. Depois, mostramos um ensaio in vitro para a invasão do trofoblasto. Utilizando este procedimento, uma grande parte, mas não totalmente, população pura de células trofoblásticas pode ser obtida. Se a pureza é necessária mais, separação magnética ou grânulo de citometria de fluxo pode ser realizada, como já foi descrito para as células trofoblásticas humanas primárias. O comprimento adequado do passo de dissociação com colagenase deve se...

isolamento de células primário do mouse trofoblasto e ensaio invasão do trofoblasto

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

A placenta é responsável para o transporte de nutrientes, gases e factores de crescimento para o feto, bem como a eliminação de desperdícios. Assim, defeitos de desenvolvimento da placenta ter importantes conseqüências para o feto ea mãe, e são uma das principais causas de letalidade embrionária. O principal tipo de célula da porção fetal da placenta é o trofoblasto. Primários de rato trofoblasto da placenta é uma ferramenta útil para o estudo do desenvolvimento normal e anormal da placenta, e ao contrário de linhas de células, pode ser isolado e utilizado para estudar trofoblasto em fases específicas da gravidez. Além disso, a culturas primárias de trofoblasto de ratinhos transgénicos podem ser utilizados para estudar o papel de genes específicos em células da placenta. O protocolo aqui apresentado é baseado na descrição por Thordarson et al. 1, no qual um gradiente de Percoll é usado para obter uma população de células relativamente puro trofoblasto da placenta de rato isolados. Ele é similar ao utilizar mais amplamented humano métodos para isolamento 2-3 trofoblasto célula. A pureza pode ser avaliada por coloração imunocitoquímica das células isoladas para citoqueratina 7 4. Aqui, as células isoladas são então analisadas utilizando um ensaio de invasão para avaliar a capacidade de invasão de matrigel trofoblasto in vitro 5-6. As células invadidas são analisados ​​por imunocitoquímica e coradas para contagem.

Neste protocolo, descreve-se a dissecção de placenta de rato sobre a gravidez d10.5, seguido de isolamento das células trofoblásticas, utilizando um gradiente de Percoll. Em seguida, demonstrar o uso de células isoladas, num ensaio de invasão de Matrigel.

Isolamento de células primário do mouse trofoblasto e Ensaio invasão do trofoblasto

A placenta é responsável pelo transporte de nutrientes, gases e fatores de crescimento para o feto, bem como pela eliminação de resíduos.
Dessa forma, defeitos...

O objetivo geral deste procedimento é isolar células primárias de trofoblasto placentário de camundongos para cultivo celular. Também demonstraremos um uso dessas células, um ensaio de invasão em matri gel. O útero será removido do camundongo grávido e a placenta será dissecada.O tecido placentário será digerido enzimaticamente para obter células individuais ou pequenos agregados celulares; as células serão então separadas por meio de um gradiente de densidade. A faixa contendo células trofoblásticas será aspirada e a população celular resultante poderá ser lavada e semeadas. Em seguida, demonstraremos o ensaio de invasão, no qual as células são semeadas sobre uma camada de matrigel que recobre uma membrana fina.Células invasivas digerirão a camada de matrigel e atravessarão poros de oito micrômetros na membrana. As células são então fixadas no lugar e a membrana é removida. As células invadidas podem então ser coradas e contadas.Olá, sou Kathleen Pennington do Laboratório Schultz do Departamento de Obstetrícia, Ginecologia e Saúde da Mulher da Universidade de Missouri em Columbia, Missouri. Hoje vamos mostrar o procedimento que utilizamos para isolar células trofoblásticas primárias de camundongos grávidos. Em seguida, demonstraremos o ensaio de invasão que usamos para testar essas células.Utilizamos estes procedimentos para estudar fatores que influenciam o desenvolvimento de células trofoblásticas placentárias e sua capacidade de invadir uma matriz extracelular. Vamos começar. Primeiro, monte pares de acasalamento de camundongos em cada um dos seguintes dias.Verifique a presença de um tampão copulatório. O dia em que um tampão é detectado é considerado o Dia 0,5.A placenta pós-coito pode ser coletada no estágio desejado da gestação. Aqui demonstraremos a dissecação de uma placenta de 14,5 dias na bancada. No entanto, pode ser necessário um microscópio para visualizar os tecidos em estágios mais precoces; localize o útero e, em seguida, corte na junção útero-tubária.Continue removendo a gordura e os vasos sanguíneos, cortando no colo do útero e nas demais junções dos túbulos. Para remover o útero, transfira-o para uma placa de Petri limpa usando tesoura fina. Separe cada concepto. Uma vez separado, transfira cada concepto para um recipiente limpo.O feto está posicionado voltado para o lado anti-miometrial em relação à placenta. A placenta situa-se ao longo do lado mesial do útero. Utilize um par de pinças para segurar o útero próximo à face cortada.Puxe cuidadosamente os dois pares de pin&ccedil;as em dire&ccedil;&otilde;es opostas, rasgando a parede uterina ao longo do lado anti-miometrial. Isso geralmente romper&aacute; tamb&eacute;m as membranas. Deixando um feto claramente vis&iacute;vel na parte superior, com a placenta vermelha abaixo e o tecido uterino branco.Abaixo disso, use pin&ccedil;as finas para separar o cord&atilde;o fetal e o tecido amni&oacute;tico da placenta. Segure o tecido uterino com um par de pin&ccedil;as e passe o outro par entre a placenta e o tecido uterino subjacente. Neste momento, o tecido decidual em excesso pode ser removido da placenta.No entanto, algumas células decíduas provavelmente permanecerão. Coloque cada placenta dissecada em um tampão de dissociação gelado até que todas as dissecações estejam concluídas. Quando as dissecações estiverem completas, tampe levemente o tubo cônico contendo a placenta e a solução de dissociação e coloque-o em banho-maria a 37 graus Celsius por 45 a 60 minutos.Após 10 minutos, misture a solução de dissociação pipetando vigorosamente para cima e para baixo, monitorando cuidadosamente o progresso da digestão. A duração adequada da etapa de dissociação com colagenase deve ser determinada em cada experimento e será aprendida com a experiência. Uma superdigestão reduzirá severamente a recuperação celular, enquanto uma subdigestão pode levar à redução da pureza, bem como ao menor número de células.Interrompa a reação quando restarem poucos pedaços de tecido não digerido. Passe a solução através de um filtro celular para remover materiais não digeridos e centrifugue a 500 vezes G durante cinco minutos para obter o pellet de células da placenta. Em seguida, lave as células.Para remover a solução de dissociação, remova o snat e ressuspenda as células em 10 ml de solução de lavagem. Centrifugue a 500 × g durante cinco minutos. Enquanto isso, prepare a solução per call misturando 9,6 ml de per call e 13,4 ml de solução de lavagem em um tubo adequado para centrifugação de alta velocidade.Adicione 1,1 mL de meio 10x, 1,99 para preparar a solução por célula, inverta o tubo para homogeneizar. Após a centrifugação e a solução de lavagem, remova o sobrenatante e ressuspenda o pellet celular. Em dois mL da solução de lavagem, adicione as células à solução do protocolo e homogeneize para criar o gradiente. Centrifugue a 20.000 × g durante 30 minutos a quatro graus Celsius, remova o tubo da centrífuga sem perturbar o gradiente.O gradiente pode ser visualizado mais facilmente segurando o tubo diante de uma fonte de luz. Uma faixa branca contendo principalmente detritos celulares será visível próximo ao topo do tubo e uma faixa de hemácias provavelmente será visível próximo à base do tubo. Logo acima.Esta é a faixa trofoblástica. Aspire o meio até logo acima da faixa trofoblástica e descarte. Em seguida, utilizando uma pipeta, transfira a Faixa Trofoblástica para um tubo de centrífuga limpo contendo 35 ml de solução de lavagem e centrifugue a 500 vezes G durante cinco minutos.Para o pelletar as células de trofoblasto, re-suspenda o pellet em meio de cultura para trofoblasto. Aqui, as células serão cultivadas em câmaras de invasão em uma placa de seis poços. As câmaras de matrigel foram previamente lavadas de acordo com as instruções do fabricante; pipete de 0,5 a 1 ml de meio de cultura no poço abaixo de cada inserto.Em seguida, adicione 1,5 vezes 10 à quinta células em um volume de meio ao compartimento. Incube a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Remova os compartimentos de invasão do incubador após 18 a 24 horas.Remova o meio de cultura e lave as câmaras três vezes em PBS durante cinco minutos cada vez, suavemente, mas completamente. Raspe as células e o gel principal da superfície superior do inserto. Usando um cotonete, fixe as células invadidas na superfície inferior da membrana preenchendo o poço com solução de paraformaldeído a 4% e incubando por cinco minutos.Lave três vezes com PBS. Revele as células invadidas preenchendo o poço com um corante nuclear, como dappy. Incube por 20 minutos.Novamente, lave três vezes com PBS. Adicione uma gota de meio de montagem a uma lâmina de vidro usando uma lâmina de bisturi e remova cuidadosamente a membrana da câmara de invasão com pinça. Transfira a membrana para a lâmina com as células voltadas para cima.Coloque a membrana sobre a gota, tomando cuidado para evitar bolhas de ar. Adicione outra gota de meio de montagem e, em seguida, a lamínula.Observe cuidadosamente e fotografe as células invadidas na superfície da membrana. Na figura, células trofoblásticas invasivas passarão através da camada de matrigel e dos poros da membrana, aparecendo na superfície inferior da membrana. Os poros também podem ser visíveis.O número de células invadidas pode ser contado e comparado entre grupos de tratamento manualmente ou com o uso de software de computador. A figura dois, além das colorações nucleares, pode incluir a imunocitoquímica para caracterizar as células invadidas. Aqui, utilizamos um anticorpo contra a citoceratina sete para confirmar que as células são trofoblastos.Demonstramos o isolamento de células trofoblásticas a partir da placenta de camundongo. Em seguida, mostramos um ensaio in vitro para invasão trofoblástica. Utilizando este procedimento, pode-se obter em grande parte, mas não totalmente, uma população pura de células trofoblásticas.Se for necessária maior pureza, pode-se realizar a separação por microesferas magnéticas ou citometria de fluxo, conforme descrito para células trofoblásticas humanas primárias. Embora tenhamos mostrado o uso de câmaras de invasão com matri gel preparadas comercialmente, elas também podem ser preparadas adicionando matri gel a câmaras transwell não revestidas na espessura desejada. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biology

Biologia

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