Isolamento de células primário do mouse trofoblasto e Ensaio invasão do trofoblasto

O objetivo geral deste procedimento é isolar células trofoblásticas placentárias primárias de camundongos para cultura de células. Também demonstraremos um uso dessas células, um ensaio de invasão de gel matri. O útero será removido da rata grávida e a placenta será dissecada.

O tecido placentário será digerido enzimaticamente para obter células individuais ou pequenos aglomerados de células, as células serão separadas em um gradiente de densidade de protocolo. A banda contendo células trofoblásticas será aspirada e a população de células resultante poderá então ser lavada e plaqueada. A seguir, demonstraremos que as células do ensaio de invasão são revestidas em uma camada de matrigel que cobre uma membrana fina.

As células invasivas serão digeridas através da camada de matrigel e passarão por poros de oito micrômetros na membrana. As células são então fixadas no lugar e a membrana removida. As células invadidas podem então ser coradas e contadas.

Olá, sou Kathleen Pennington, do Laboratório Schultz do Departamento de Ginecologia Obstétrica e Saúde da Mulher da Universidade de Missouri em Columbia, Missouri. Hoje vamos mostrar o procedimento que usamos para isolar células trofoblásticas primárias de camundongos prenhes. Em seguida, demonstraremos o ensaio de invasão que usamos para testar as células.

Usamos esses procedimentos para estudar fatores que influenciam o desenvolvimento das células trofoblásticas placentárias e sua capacidade de invadir uma matriz extracelular. Vamos começar. Primeiro, configure pares de camundongos para acasalamento em cada um dos dias seguintes.

Verifique a presença de um tampão copul. O dia em que um plugue é detectado é considerado. Dia 0.5.

A placenta pós-coist pode ser coletada no estágio desejado da gravidez. Aqui demonstraremos a dissecção de um dia, 14,5 placenta na bancada. No entanto, um microscópio pode ser necessário para visualizar os tecidos Nos estágios iniciais, localize o útero e, em seguida, corte na junção do túbulo utero.

Continue a aparar a gordura e os vasos sanguíneos que cortam o colo do útero e a outra junção dos túbulos. Para remover o útero, transfira o útero para uma placa de Petri limpa usando uma tesoura afiada. Separe cada concepto Depois de separado, transfira cada concepto para um prato limpo.

O feto fica em direção ao lado antimiométrio da placenta. A placenta fica ao longo do lado meso do útero. Use um par de pinças para segurar o útero perto da face cortada.

Puxe cuidadosamente os dois pares de pinças um do outro, rasgando a parede uterina ao longo do lado antimiometrial. Isso geralmente rompe as membranas também. Deixando um feto claramente visível no topo com a placenta vermelha abaixo e o tecido uterino branco.

Abaixo disso, use uma pinça fina para separar o cordão fetal e o tecido amniótico da placenta. Segure o tecido uterino com um par de pinças e passe o outro par entre a placenta e o tecido uterino subjacente. Neste momento, o excesso de tecido deci pode ser removido da placenta.

No entanto, algumas células deci provavelmente permanecerão. Coloque cada placenta dissecada em um tampão de dissociação gelado até que todas as dissecções estejam completas. Quando as dissecções estiverem completas frouxamente, tampe o tubo cônico contendo placenta e solução de dissociação e coloque-o em banho-maria a 37 graus Celsius por 45 a 60 minutos.

Após 10 minutos, misturar a solução de dissociação pipetando vigorosamente para cima e para baixo, monitorizar cuidadosamente o progresso da digestão. A duração adequada da etapa de dissociação da colagenase deve ser determinada a cada experimento e será aprendida. A experiência com a digestão excessiva reduzirá severamente a recuperação celular, enquanto a digestão insuficiente pode levar à redução da pureza e ao número reduzido de células.

Pare a reação quando restarem poucos pedaços de tecido não digerido. Passe a solução por um filtro de células para remover materiais não digeridos e centrifugue a 500 vezes G por cinco minutos para pellet as células da placenta. Em seguida, lave as células.

Para remover a solução de dissociação. Remover o snat e ressuspender as células em 10 ml de solução de lavagem e centrifugar a 500 vezes G durante cinco minutos. Enquanto isso, prepare a solução por chamada misturando 9,6 ml por chamada e 13,4 MLS de solução de lavagem em um tubo adequado para centrifugação de alta velocidade.

Adicione 1,1 MLS de 10 x meio, 1 99 para fazer a solução por chamada, inverta isotônico o tubo para misturar Após a centrifugação e a solução de lavagem, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular. Em dois ml's, lave a solução, adicione células à solução de protocolo e misture para criar a centrífuga gradiente em 20.000 vezes. G por 30 minutos a quatro graus Celsius, remova o tubo da centrífuga sem perturbar o gradiente.

O gradiente pode ser visualizado mais facilmente segurando o tubo na frente de uma fonte de luz. Uma faixa branca contendo principalmente detritos celulares será visível perto do topo do tubo e uma faixa de glóbulos vermelhos provavelmente será visível perto do fundo do tubo. Logo acima.

Esta é a banda trofoblástica. Aspire o meio até um pouco acima da banda do trofoblasto e descarte. Em seguida, usando uma pipeta, transfira a banda de trofoblasto para um tubo de centrifugação limpo contendo 35 ml de solução de lavagem e centrifugue a 500 vezes G por cinco minutos.

Para granular as células trofoblásticas, suspenda novamente o pellet em meio de cultura trofoblasto. Aqui as células serão cultivadas em câmaras de invasão em uma placa de seis poços. As câmaras de gel matri foram previamente lavadas de acordo com as instruções do fabricante, pipetar 0,5 a um ml de meio de cultura no poço abaixo de cada inserção.

Em seguida, adicione 1,5 vezes 10 às quintas células em uma quantidade de meio à câmara. Incubar a 37 graus Celsius e 5%CO2. Remover as câmaras de invasão da incubadora após 18 a 24 horas.

Remover o meio de cultura e enxaguar as câmaras três vezes em PBS durante cinco minutos de cada vez, de forma suave mas completa. Raspe as células e o gel principal da superfície superior da inserção. Usando um cotonete, fixe as células invadidas na superfície inferior da membrana, enchendo o poço com solução de formaldeído a 4% e incubando por cinco minutos.

Enxágüe três vezes em PBS. Manchar as células invadidas enchendo o poço com uma mancha nuclear, como dappy. Incube por 20 minutos.

Novamente, lave três vezes em PBS. Adicione uma gota de meio de montagem a uma lâmina de vidro usando uma lâmina de bisturi, remova cuidadosamente a membrana da câmara de invasão usando uma pinça. Transfira a membrana para a lâmina com as células voltadas para cima.

Coloque a membrana sobre a gota. Tomando cuidado para evitar bolhas de ar. Adicione outra gota de meio de montagem e, em seguida, lamínula.

Visualize e fotografe cuidadosamente as células invadidas na superfície da membrana. As células trofoblásticas invasivas da figura um passarão pela camada de matrigel e pelos poros da membrana que aparecem na superfície inferior da membrana. Os poros também podem ser visíveis.

O número de células invadidas pode ser contado e comparado entre os grupos de tratamento manualmente ou usando software de computador. Figura dois, além das colorações nucleares, a imunocitoquímica pode ser usada para caracterizar as células invadidas. Aqui usamos um anticorpo para citoqueratina sete para confirmar que as células são trofoblastos.

Demonstramos o isolamento de células trofoblásticas da placenta de camundongo. Em seguida, mostramos um ensaio in vitro para invasão de trofoblastos. Usando este procedimento em grande parte, mas não totalmente, a população pura de células trofoblásticas pode ser obtida.

Se for necessária uma pureza adicional, a separação magnética do grânulo ou a citometria de fluxo podem ser realizadas, como foi descrito para células trofoblásticas humanas primárias. Embora tenhamos mostrado o uso de câmaras de invasão de matri gel preparadas comercialmente, elas também podem ser preparadas adicionando matri gel a câmaras transwell não revestidas na espessura desejada. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.