Uma técnica de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier para estudar a automontagem de peptídeos

A espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier - FTIR - ajuda a estudar a automontagem do peptídeo em estruturas supramoleculares mantidas juntas por interações não covalentes.

Comece coletando uma amostra de proteína desmontada - uma suspensão de peptídeos amilóides com a capacidade de formar uma estrutura supramolecular rica em folha beta. Colocar a amostra num instrumento FTIR equipado com um cristal ATR.

Direcione um feixe infravermelho em um ângulo crítico para o cristal; o feixe passa por ele e atinge a interface entre o cristal e a amostra. Cristais com um índice de refração maior do que a amostra causam reflexão interna do feixe.

Uma pequena fração do feixe se estende para dentro da amostra como uma onda evanescente - uma onda estacionária nos pontos de reflexão. A interação dessa onda com a amostra causa absorção da energia da onda, levando à atenuação do feixe refletido, registrado por um detector.

Dependendo da estrutura do peptídeo, a amostra é absorvida em regiões específicas do espectro infravermelho. O espectro de absorção - obtido pela transformação de Fourier do sinal - mostra um pico amplo em um número de onda específico, característico da amostra de proteína desmontada.

Incube a amostra, permitindo a automontagem, para formar fibras amilóides ricas em folhas beta. Pós-incubação, registar o espectro de absorção.

Um pico acentuado em um número de onda diferente do pico amplo anterior indica conversão em um conjunto de folha beta.

Para preparar uma solução de automontagem, dissolva 1 miligrama do pó de peptídeo liofilizado em uma mistura de acetonitrila a 20% e HEPES 10 milimolares em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, vortex a solução de montagem e deixe a amostra para montar em temperatura ambiente.

Quando o conjunto peptídico atingir a maturação, seque 8 a 10 microlitros da solução de montagem como um filme fino no cristal de diamante de reflexão total atenuado e monitore o desaparecimento de um pico de água grande e largo de 1.640 a 1.630 centímetros inversos à medida que o filme seco se forma.

Adquira espectros de fundo e infravermelho de 1.500 a 1.800 centímetros inversos, com média de 50 varreduras com resolução de 2 centímetros inversos, subtraindo as varreduras de fundo antes de cada varredura de amostra.

A assinatura infravermelha para montagem de chapas beta deve ser observada como um pico agudo entre 1.625 e 1.635 centímetros inversos.