Name: Imagem adesão leucocitária ao endotélio vascular na pressão intraluminal de alta (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Aprenda a visualizar adesão de leucócitos ao endotélio em vasos pressurizados ex vivo usando sangue total. Este método permite estudar inflamação vascular e hipertensão em artérias funcionais de roedores.

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Este estudo foi financiado em parte pelo Programa do Governo vitoriana do OIS, o National Health and Medical Research Council de bolsas da Austrália de programas e projetos (JPF Chin-Dusting) e bolsa de pós-graduação (D Michell).

1. Isolando artérias carótidas <ol><li> Euthanase10 semana de idade ratos Sprague Dawley através de CO 2 / O 2 asfixia. </li><li> Excise esquerda e direita artérias carótidas comuns com aorta e coração assegurar alongamento mínimo dos vasos. </li><li> No gelo tampão Krebs frio separado das artérias carótidas e da aorta do coração e realizar dissecção perto. </li><li> Manter os vasos isolados em Krebs no gelo antes da montagem. </li></ol> Aprox. tempo = 45 minutos 2. Escorva da câmara de navios <ol><li> Nos conectores proximal e distal da câmara de descarga de navios tampão Krebs mantida em pH fisiológico, infundindo carbogênio de gás (95% O 2, 5% CO 2) através do tampão a 37 ° C. </li><li> Garantir tubos e cânulas são liberadas completamente e estão alinhados. </li><li> Lave tampão Krebs através do P1 (proximal) e (distal) P2 transdutores. Torneiras a fim de garantir que nenhuma bolha de ar no transdutores. </li><li> Conecte os transdutores para os conectores correspondentes e, novamente, lave mais tampão Krebs garantindo que não haja bolhas de ar. Fechar as torneiras para a câmara. </li></ol> Aprox. tempo = 15 minutos 3. Pressurização da câmara de navios <ol><li> Ligue equipamentos sob pressão: servo de pressão, monitor de pressão, bomba peristáltica (Figura 1). </li><li> Com a bomba peristáltica sobre a pressão ea pressão sobre servo automática tampão Krebs executado através do tubo de 20 mmHg (dial em 1), garantindo que não haja bolhas de ar. </li><li> Conecte a tubulação para o transdutor P2 fechado. Pressão vai se tornar estável. </li><li> Abrir torneira P2 para a câmara de navio para expulsar as bolhas, em seguida, fechar. </li><li> Encha a banheira com Krebs buffer (5-7 mL). </li></ol> Aprox. tempo = 10 minutos 4. A montagem do navio <ol><li> Sob um microscópio de dissecação lugar laços de poliéster preto em cada cânula (Figura 2). </li><li> Mova cânulas e detentores cânula além e montar ¼ navio (aórtica final arco) para a cânula P1. Garantir para não rasgar o navio. </li><li> Usando uma seringa cheia de Krebs tampão suavemente lavar o excesso de sangue para fora da embarcação através de transdutor P1. Fechar P1 para a câmara. </li><li> Navio seguro para a cânula P1 com o empate de poliéster. </li><li> Mova cânulas / titulares cânula mais perto para montagem sobre a cânula P2. </li><li> Monte extremidade distal do vaso (~ ¼ do comprimento) para cânula distal. Seguro com empate de poliéster. </li></ol> Aprox. tempo = 20 minutos 5. Pressurizar o navio <ol><li> Ajustar os detentores cânula para garantir que não dobrar ou esticar no vaso. </li><li> Com P1 e P2 fechado para a câmara de mudar o servo pressão de automático para manual. Verificar a pressão servo não há uma diminuição contínua da pressão dentro de 10 segundos. Se houver, um vazamento está ocorrendo e as conexões e transdutores devem ser assegurados no lugar. </li><li> Ajustar o servo pressão de volta para P2 em seguida, abra automática para a câmara. Sob o microscópio observar o navio se dilatam quando a torneira é aberta para a câmara. </li><li> Mudar o servo pressão para manual. Novamente verificar se há diminuição contínua da pressão dentro de 10 segundos. Se houver um vazamento, então o sistema não é a pressão apertado e não é provável que seja um furo na embarcação. </li><li> Voltar para P1 aberto automática para a câmara. Na configuração manual verificar que a pressão se mantém estável. </li><li> Se nenhum vazamento, na definição de discagem manual aumentar para 2 (40 mmHg). </li><li> Ajuste automático para o navio e observar ao microscópio. Se necessário, ajuste o titular cânula para garantir que nenhum curva do vessel.Check de vazamentos sobre a configuração manual. </li><li> Repita os passos 5,6-5,7 aumentar o discagem para 3 (60 mmHg), 4 (80 mmHg) e assim por diante até que a pressão desejada seja atingida. </li></ol> Aprox. tempo = 15 - 30 mins 6. Incubando a recipiente pressurizado <ol><li> Conecte o conjunto controlador de temperatura para 37 ° C. </li><li> Com uma segunda bomba peristáltica perfundir Krebs buffer (1 mL / min) para o banho de câmara de navio. </li><li> Conectar aspirador de câmara garantindo apenas a camada superior do banho é removido. </li><li> Incubar recipiente pressurizado a 37 ° C por 1 hora com a pressão definido como automático. </li><li> Verifique a pressão não está vazando (mudar para o manual) periodicamente. </li><li> Os efeitos de várias intervenções farmacológicas podem ser observados com a simples adição do composto para o banho durante a incubação. </li></ol> Aprox. time = 1 hora 7. Irrigando o recipiente pressurizado com sangue total <ol><li> Durante a incubação obter pelo menos 7,5 mL de sangue humano inteiro / navio coletados em 40 heparina U / mL de sangue. Incubar em uma falcon 50 ml a 37 ° C. </li><li> 10 minutos antes do final de tele sangue de incubação etiqueta com VybrantDil (1:1000) por 10 minutos a 37 ° C no escuro. </li><li> Após 10 minutos, coleta de sangue em uma seringa clearing as bolhas e anexar em uma bomba de seringa com um casaco de calor a 37 ° C. </li><li> Fechar transdutor P1 para a câmara / navio e conectar seringas e tubos de resíduos. </li><li> Sangue purgar a 1000 mL / min através do tubo de resíduos para remover todas as bolhas. </li><li> P1 aberto para a câmara. O servo de pressão ajusta automaticamente para manter a pressão desejada. </li><li> Perfundir de sangue a 100 mL / min. </li><li> Usando um microscópio de fluorescência acoplado a uma câmera digital gravar dois campos do navio perfundidos por 15 segundos a 1, 3, 5, 7,5 e 10 minutos. </li><li> Integridade pós-perfusão ea função endotelial pode ser avaliada através de técnicas farmacológicas, como myograph e expressão de moléculas de adesão pode ser determinado por imunohistoquímica para validar ainda mais a resposta inflamatória. </li></ol> Aprox. tempo = 15 minutos 8. Resultados representativos: Um diagrama esquemático da instalação de câmara de pressão é mostrado na Figura 1. Com uma câmera digital acoplada a um microscópio de fluorescência resultados podem ser visualizados instantaneamente por meio de gravações de vídeo ao vivo. Imagens de vídeo representativas são vistos na Figura 3, onde os leucócitos são considerados aderentes ao endotélio se manteve parado por 10 segundos. Com gravações de vídeo em loop contínuo células aderidas pode ser contado como um campo médio por. Embora ambos baixa (Figura 3A) e alta pressão (Figura 3B) fará com que uma certa quantidade de aderência um aumento significativo na adesão de leucócitos na maior pressão intraluminal é visto e isso também é demonstrada quantitativamente (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Pressurizada vivo ex esquemática câmara navio. Um navio canulados conectado a um transdutor (P1) proximal e um distal (P2) que permite que os transdutores de pressão arterial a ser manipulado dentro do vaso. Perfusão é através do transdutor de pressão P1 e é mantida por meio de transdutor de P2. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Cannuala com laços. Laços de poliéster preto são anexados a cada cânula. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Imagens de vídeo representativas. Adesão celular dinâmico (seta vermelha), sob a fluorescência a 80 mmHg (A) e 120 mmHg (B) após 10 minutos de perfusão. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Adesão de leucócitos em ratos Sprague Dawley das artérias carótidas após 1 hora de incubação em baixa (80 mmHg) e de alta pressão (120 mmHg). *** P &lt;0,001, como analisado por 2-way ANOVA medidas repetidas com teste post hoc de Bonferroni.

<ol><li>Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+burden+of+disease+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global and regional burden of disease and risk factors.</a> Lancet. 367, 1747-1757 (2001).</li>
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<li>Ley, K., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial%2C+not+hemodynamic%2C+differences+are+responsible+for+preferential+leukocyte+rolling+in+rat+mesenteric+venules.+Circ+Res%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res.</a> 69, 1034-1041 (1991).</li>
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<li>Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+levels+of+soluble+P-selectin+mediate+adhesion+of+leukocytes+to+the+endothelium+through+Mac-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation.</a> Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).</li>
<li>Eberth, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+pulsatility+in+hypertensive+carotid+artery+growth+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling.</a> J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).</li>
<li>Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+activates+an+endothelial+potassium+channel+to+release+an+endogenous+nitrovasodilator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator.</a> J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).</li>
</ol>

O protocolo do estudo foi aprovado pelo Medical Research e Alfred Delegacia Educação animais Comitê de Ética e da Comissão de Ética Alfred Hospital.

Este é um método modificado para estudar a adesão de leucócitos ao endotélio intacto em vasos sanguíneos isolados, em condições pressurizadas em tempo real. Perfusão da câmara de navio só permite uma validação rápida de pró-inflamatórias linhagens de camundongos e grandes vasos de ratos. Manipulação de pressão permitindo que permite interações célula dinâmica a ser observado a partir de baixo a muito altas pressões intraluminais, assim, melhor imitar-ing fisiológicos e condições fisiopatológicas. Diâmetro dos vasos também pode ser medida usando um programa de imagens de células-suficiente e, portanto, o fluxo de cisalhamento e velocidade pode ser determinada e, portanto, manipulados. Com as suas capacidades de myograph, intervenções farmacológicas colocado no banho acrescentar uma outra dimensão para as condições experimentais possível com esse modelo permite estudos de vias mecanicista e sinalização. Enquanto preservação endotelial não pode ser confirmado durante a manipulação de pressão, as respostas a ACh e PE podem ser conduzidas de perfusão pós 9. Deve-se notar que essa configuração demonstra os efeitos da pressão intraluminal em célula a célula não interações dos efeitos do fluxo sangüíneo pulsátil nem sistólica ou diastólica. Além disso, enquanto as alterações de pressão aguda sobre a adesão de leucócitos foram observados, esta configuração pode ser também utilizada para analisar os efeitos da pressão crônica (ou seja, aumentando os tempos de incubação e utilizando um modelo animal crônica de pressão). Sprague Dawley artérias carótidas comuns são demonstradas neste conjunto para cima, mas outras linhagens e espécies podem ser usadas com ajustes apropriados para o tamanho da cânula. De fato, é importante notar que a idade eo peso dos animais afetam o tamanho do navio e, portanto, que a criação precisa ser individualizado para cada navio. Dissecção próxima e cuidadosa do tecido conjuntivo pode melhorar a visualização de leucócitos imensamente.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente / equipamentos </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Microscópio </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td> SteREO Descoberta V.20 </td><td></td></tr><tr><td> PHD bomba de seringa 2000 </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 70-2016 </td><td></td></tr><tr><td> Câmera Digital e controlador </td><td> Hamamatsu ORCA-ER </td><td> C4742-95 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescência Sistema de Iluminação </td><td> Lumen Dynamics </td><td> X-Cite 120 </td><td></td></tr><tr><td> Câmara navio </td><td> Vivendo Instrumentação Sistemas </td><td> CH/1/SH </td><td></td></tr><tr><td> Controlador de pressão Servo e bomba peristáltica </td><td> Vivendo Instrumentação Sistemas </td><td> PS - 200 </td><td></td></tr><tr><td> Monitor de Pressão de perfusão </td><td> Vivendo Instrumentação Sistemas </td><td> PM - 4 </td><td></td></tr><tr><td> 2 x Transdutor de Pressão </td><td> Vivendo Instrumentação Sistemas </td><td> PT - F </td><td></td></tr><tr><td> Controlador de temperatura </td><td> Vivendo Instrumentação Sistemas </td><td> TC-01 </td><td></td></tr><tr><td> Bomba peristáltica </td><td> Instech Laboratories, Inc </td><td> P720 </td><td></td></tr><tr><td> VybrantDil solução da célula-rotulagem </td><td> Invitrogen </td><td> V-22885 </td><td> Use 1:1000 </td></tr></tbody></table>

imagem adesão leucocitária ao endotélio vascular na pressão intraluminal de alta

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Hipertensão, em todo o mundo é relatado para ser em aproximadamente um quarto da população e é o principal fator de risco para mortalidade no mundo biomédico. Na vasculatura hipertensão está associada com disfunção endotelial e aumento da inflamação levando à aterosclerose e várias doenças, tais como doença renal crônica 2, 3 derrame e insuficiência cardíaca 4. Um passo inicial na inflamação vascular levando a aterogênese é a cascata de adesão que envolve o rolamento, tethering, a adesão ea transmigração de leucócitos subseqüentes através do endotélio. Recrutamento e acúmulo de leucócitos ao endotélio é mediada por uma regulação alta de moléculas de adesão, como a molécula de adesão celular vascular-1 (VCAM-1), molécula de adesão celular intracelular-1 (ICAM-1) e E-selectina, bem como aumentos nos citocinas e quimiocinas libertação e uma regulação alta de espécies reativas de oxigênio 5. Os métodos in vitro, tais como testes de aderência estática ajudar a determinar os mecanismos envolvidos na adesão célula a célula, bem como a análise de moléculas de adesão celular. Métodos utilizados nos anteriores estudos in vitro demonstraram que aumentos agudos de pressão sobre o endotélio pode levar a adesão de monócitos, um upregulation de moléculas de adesão e de marcadores inflamatórios 6 no entanto, semelhante a muitos ensaios in vitro, esses achados não foram realizados em tempo real sob condições de fluxo fisiológico, nem com sangue total. Portanto, em ensaios in vivo são cada vez mais utilizados em modelos animais para demonstrar inflamação vascular eo desenvolvimento de placa. Microscopia intravital é agora amplamente utilizados para avaliar a adesão de leucócitos, migração, rolamento e transmigração 7-9. Ao combinar os efeitos da pressão sobre os leucócitos para a adesão endotelial estudos in vivo são menos extensas. Um desses estudos examina os efeitos em tempo real do fluxo e cisalhamento sobre o crescimento arterial e marcadores inflamatórios remodelação, mas só foram avaliados através de imuno-histoquímica 10. Aqui apresentamos um modelo para a gravação de adesão leucocitária em tempo real no intacta vasos sanguíneos sob pressão de perfusão utilizando sangue total. A metodologia é uma modificação de um navio vivo ex-modelo de perfusão câmara 9, que permite a análise em tempo real das interações leucócito-endotélio adesivo em vasos intactos. Nossa modificação permite a manipulação da pressão intraluminal até 200 mmHg permitindo estudo não somente sob condições de fluxo fisiológico, mas também condições de pressão. Enquanto os sistemas Miografia pressão tenham sido previamente demonstrado para observar parede do vaso e do lúmen diâmetro 11, bem como a contração este vaso é a primeira vez demonstrando interações leucócito-endotélio em tempo real. Aqui nós demonstrar a técnica usando artérias carótidas de ratos colhidos e canulada a uma câmara de fluxo custom-made acoplado a um microscópio de fluorescência. A câmara de embarcação está equipada com uma lamela grande fundo permitindo uma lente objetiva de grande diâmetro, com distância de trabalho de curto para a imagem do navio. Além disso, agonista selecionados e / ou antagonistas podem ser utilizados para investigar os mecanismos que controlam a adesão celular. Vantagens deste método sobre microscopia intravital não incluem o envolvimento de cirurgia invasiva e, portanto, um maior rendimento pode ser obtido. Este método também permite o uso de tratamento inibidor localizada ao navio desejado enquanto intravital só permite o tratamento sistêmico inibidor.

Este é um método para visualizar a adesão de leucócitos ao endotélio em vasos pressurizados colhidas. A técnica permite estudar de adesão vascular sob fluxo de cisalhamento com diferentes pressões intraluminal até 200 mmHg, assim, imitam-ing as condições fisiopatológicos da pressão arterial elevada.

Imagem adesão leucocitária ao endotélio vascular na pressão intraluminal de alta

Em todo o mundo, relata-se que a hipertensão afeta aproximadamente um quarto da população, sendo o principal fator de risco biomédico para a mortalidade mundial. ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a adesão de leucócitos ao endotélio em vasos colhidos sob pressão. Isso é realizado primeiramente isolando-se uma artéria carótida de um rato ou camundongo. Em seguida, o vaso é montado em uma câmara pressurizada.O vaso é então pressurizado e incubado por uma hora em uma pressão desejada. Por fim, sangue total marcado é perfundido através do vaso pressurizado. Em última instância, podem ser obtidos resultados que mostram em tempo real a adesão de leucócitos ao endotélio por meio de uma câmara vascular ex vivo personalizada, acoplada a uma bomba peristáltica e a um microscópio fluorescente.Assim, a principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como os ensaios de adesão estática, é que a adesão de leucócitos pode ser observada em artérias funcionais intactas utilizando sangue total. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no estudo da hipertensão, como o efeito da alta pressão intraluminal sobre a inflamação e como ela pode contribuir para a aterosclerose. Após isolar artérias carótidas de ratos Sprague-Dawley com 10 semanas de idade e preparar e pressurizar a câmara de perfusão, monte o vaso sob um microscópio estereoscópico colocando primeiro laços pretos de poliéster em cada cânula, mova o vaso para o banho e, em seguida, monte um quarto do vaso na cânula P1.Tenha cuidado para não rasgar o vaso usando uma seringa cheia com tampão de Krebs. Lave suavemente o excesso de sangue do vaso através do transdutor P um. Feche o P um em direção à câmara.Com o laço de poliéster, fixe o vaso à cânula P um. Aproxime as cânulas e os suportes das cânulas para montá-las na cânula P dois. Monte a extremidade distal do vaso na cânula P dois.Fixe-o com um prendedor de poliéster para iniciar a pressurização do vaso. Ajuste os suportes da cânula para garantir que não haja curvatura ou alongamento no vaso com P um e P dois fechados para a câmara. Alterne o servo de pressão de automático para manual.Verifique o servo de pressão para confirmar que não há queda de pressão dentro de 10 segundos. Uma diminuição na pressão indica a presença de um vazamento, e as conexões e o transdutor precisam ser fixados adequadamente para garantir que estejam hermeticamente fechados à pressão. Ajuste o servo de pressão novamente para o modo automático, então abra P dois para a câmara sob o microscópio e observe a dilatação do vaso.Quando a torneira estiver aberta para a câmara. Alterne o servo de pressão para manual. Novamente, verifique se há alguma diminuição na pressão.Se uma queda na pressão continuar, então o sistema não está estanque à pressão e provavelmente há um orifício no vaso. Volte para o modo automático e abra P um para a câmara. Na configuração manual, verifique se a pressão permanece estável.Se estiver estável, aumente o ajuste para dois, o que pressuriza o vaso até 40 milímetros de mercúrio. Alterne para o modo automático e observe o vaso sob o microscópio. Se necessário, ajuste o suporte da cânula para garantir que não haja curvatura no vaso na configuração manual.Verifique os vazamentos. Em seguida, aumente os incrementos do controle gradualmente, alternando para automático intercaladamente, para observar o vaso ao microscópio até que a pressão desejada seja alcançada. Após atingir a pressão desejada, transfira a câmara para o microscópio estereoscópico.Conecte o controlador de temperatura ajustado a 37 graus Celsius. Em seguida, conecte a bomba peristáltica e o aspirador para manter o tampão de Krebs no banho fresco. Incube o vaso pressurizado a 37 graus Celsius por uma hora.Verifique periodicamente vazamentos. Rotule 7,5 mililitros de sangue coletado previamente com corante vivo no escuro. Em seguida, incube por 10 minutos a 37 graus Celsius.Colete o sangue em uma seringa, removendo quaisquer bolhas, e fixe-a em uma bomba de seringa com jaqueta aquecida ajustada a 37 graus Celsius. Feche o transdutor P um em direção à câmara e conecte a seringa e a tubulação de descarte. Purgue o sangue a 1000 microlitros por minuto através da tubulação de descarte para remover quaisquer bolhas de ar; abra P um em direção à câmara.O servo de pressão ajustará automaticamente para manter a pressão desejada, perfundindo o sangue a 100 microlitros por minuto; utilizando um microscópio fluorescente acoplado a uma câmera digital, registre dois campos do vaso perfundido durante 15 segundos em diversos pontos temporais. Imagens representativas de leucócitos são mostradas aqui, nas quais os leucócitos são considerados aderidos ao endotélio se permanecerem estacionários por 10 segundos. Com gravações em vídeo em loop contínuo, as células podem ser contadas como uma média por campo, enquanto tanto a pressão baixa quanto a alta causarão algum grau de adesão.Observa-se um aumento significativo do aion de leucócitos na pressão intraluminal mais elevada. Isso é demonstrado quantitativamente neste gráfico, onde um maior número de células por campo adere a 120 em comparação com 80 milímetros de mercúrio de pressão. Após este procedimento, outros métodos, como PCR e imunohistoquímica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a expressão gênica e proteica das moléculas de adesão.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui, descrevemos um método não invasivo de dois fótons abordagem microscopia (2P) para estudo de leucócitos homing na pata do rato. Discutimos os aspectos técnicos de nossa preparação tissular e andar o leitor através de um experimento típico de configuração inicial para coleta de execução e de dados.

Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo</em

Nós descrevemos um protocolo de brightfield microscopia intravital para medir a dinâmica interações neutrófilos-célula endotelial durante o recrutamento de neutrófilos em resposta à fonte de um chemoattractant neutrófilos in vivo. Neutrófilos rastejando intraluminal, a migração transendotelial e quimiotaxia em tecido muscular do rato cremaster são visualizados com o tempo decorrido, fotografia, vídeo e rastreados com ImageJ.

Rastreamento Crawling neutrófilos Intraluminal, migração transendotelial e Quimiotaxia em tecido por Microscopia intravital Vídeo

Este vídeo demonstra um ensaio baseado em fluxo laminar para caracterizar a interação de leucócitos e parceiros celulares, como células endoteliais. Este método fornece informações dinâmicas sobre adesão, desadesão e transmigração de leucócitos quando perfundidos sobre uma camada intacta e confluente de células vasculares.

Um ensaio baseado em fluxo laminar para estudar as interações entre leucócitos e células endoteliais

Recrutamento de leucócitos para o fígado ocorre dentro dos canais especializados dos sinusóides hepáticos, que são revestidas por células endoteliais sinusoidais hepáticas únicas. Microscopia de contraste de fase de recrutamento de leucócitos através do endotélio sinusoidal hepática humana em condições de tensão de cisalhamento fisiológico pode facilitar a elucidação dos mecanismos moleculares que estão na base deste processo.

Um fluxo de Adesão Ensaio para o Estudo de Recrutamento de leucócitos para hepáticas humanas senoidais endotélio sob condições de estresse de cisalhamento

Os leucócitos atravessam a monocamada endotelial utilizando o paracelular ou o percurso intracelular. Foi desenvolvido um ensaio simples para seguir a distribuição de juncional endógeno VE-caderina e PECAM-1 durante a migração transendotelial de leucócitos sob fluxo fisiológico para discriminar entre as duas vias de transmigração.

Imagens em tempo real de endoteliais junções célula-célula durante Neutrophil Transmigração Sob Fisiológica Fluxo

Aqui, nós apresentamos um protocolo que permite ao investigador para avaliar a dinâmica de recrutamento de leucócitos ex vivo, ligando uma câmara revestida com moléculas de adesão endoteliais derivados de para o sistema circulatório de um rato. Este método oferece vantagens significativas, uma vez que permite a avaliação de leucócitos em condições biológicas relativos.

Avaliando interação leucócito-endotélio em condições de fluxo em um Ex Vivo Autoperfused Microflow Câmara Assay

Esta aplicação simplificada de microscopia intravital de veias mesentérias em camundongos pode ser usada em diferentes modelos de inflamação para observar as interações leucócitos-endoteliais e plaquetas-leucócitos.

Interações Intravital Microscopia de leucócito-endothelial e plaquetas-leucócitos em mesenterial Veias Ratos

Este manuscrito descreve o uso de camundongos transgênicos repórter e vias de administração diferentes de corantes fluorescentes em angiotensina II induzida por hipertensão usando microscopia intravital de vídeo dos vasos sanguíneos para avaliar a ativação de células do sistema imunológico e suas capacidade de rolar e aderir ao endotélio.

Visualizando leucócitos rolamento e adesão em angiotensina II-infundido ratos: técnicas e armadilhas

Leucócitos, avidamente, interagir com células vasculares e plaquetas após lesão de parede do vaso ou durante a inflamação. Aqui, descrevemos um simples ensaio baseado em fluxo laminar para caracterizar os mecanismos moleculares que fundamentam as interações entre os leucócitos e os seus parceiros de celulares.

Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes

Este protocolo passo a passo fornece uma descrição detalhada da instalação experimental e análise de dados para a avaliação das respostas inflamatórias em hiPSC-ECs e a análise da adesão de leucócitos sob fluxo fisiológico.

Microfluidic ensaio para a avaliação da adesão de leucócitos ao humano Induced Pluripotent células-tronco derivadas de células endoteliais (ECs-hiPSC)

Neste protocolo, um ensaio biomimético de microfluido, que pode reproduzir um ambiente microvascular fisiologicamente relevante e reproduzir toda a cascata de adesão/migração leucócito, é empregado para estudar interações células leucócitos-endoteliais em doenças inflamatórias.

Um sistema microfisiológico para estudar a interação das células leucócitos-endoteliais durante a inflamação

Aprenda a visualizar adesão de leucócitos ao endotélio em vasos pressurizados ex vivo usando sangue total. Este método permite estudar inflamação vascular e hipertensão em artérias funcionais de roedores.

Imagem adesão leucocitária ao endotélio vascular na pressão intraluminal de alta

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