Detecção e Genogrouping de norovírus a partir de fezes das crianças, Taqman Um passo-RT-PCR

Deteção de neurovírus em RNA extraído por meio de R-T-P-C-R em tempo real em um único passo com sondas TECHMAN específicas. Mas hoje vamos falar sobre neurovírus. Isso ocorre em Lima, Peru, e é um grupo da universidade e também da Johns Hopkins University.

Descobriu-se que o norovírus é provavelmente uma das causas mais negligenciadas de diarreia. O nosso grupo descobriu que o norovírus é o segundo maior responsável pelas hospitalizações de crianças por diarreia, bem como pelo número populacional de casos de diarreia. Então, por que o NOROVÍRUS não foi diagnosticado anteriormente?

Bem, a razão é que se trata de um vírus de RNA e não podemos cultivá-lo, portanto são necessários métodos especiais de biologia molecular para o diagnóstico. Esses métodos que utilizamos são a RT-PCR, e este vídeo vai demonstrar como usar a RT-PCR para diagnosticar o neurovírus. Utilizamos um método interno de extração de RNA viral a partir de amostras de fezes baseado no método de Ciag GUINE ATE, boom et al. 1989.

Este método é uma alternativa ao kit comercial de RNA viral ca amp. Ambos os métodos são baseados nas propriedades de ligação de ácidos nucleicos de partículas de sílica. Combinado com as propriedades anti-nucleases da Guad Dium Bio NA, preparação da suspensão de sílica para extração de RNA.

Para preparar as partículas de sílica, pegue 30 gramas de dióxido de silício, adicione 250 mililitros de água desmineralizada e suspenda o silício agitando. Após 24 horas de sedimentação, remova 215 mililitros do sobrenadante e reconstitua por sucção com 250 mililitros de água desmineralizada e, novamente, suspenda o silício agitando. Após mais 24 horas, remova o sobrenadante por sucção e ajuste o pH da suspensão de sílica para pH 2,0 utilizando ácido clorídrico qu suspensão de sílica em frascos de vidro e extração em autoclave com g guin e sílica.

Agora analisaremos a extração de RNA viral utilizando as partículas de sílica preparadas em uma etapa anterior. Armazene a -70 graus Celsius até o uso. Para preparar uma suspensão fecal a 10%, tome aproximadamente 0,1 grama de fezes e complete com um mililitro de PBS antes da extração.

Agite suavemente as amostras com baixa carga por cinco segundos e, em seguida, centrifugue a 4.000 RPM por 10 minutos. Em cada reação, utilize uma amostra de fezes positiva para neurovírus como controle positivo e água tratada com DEPC em um tubo microcentrífuga. Misture o seguinte: um mililitro do tampão L6, 20 microlitros das partículas de sílica preparadas e 200 microlitros do extrato fecal.

Vortexie brevemente e deixe as amostras em temperatura ambiente por 15 minutos. Centrifugue por 15 segundos. Em seguida, lave o pellet duas vezes com o tampão L dois, depois duas lavagens com etanol 70% e uma lavagem com ácido on.

Seque o pellet em um bloco de aquecimento seco a 56 graus Celsius por cinco minutos. Hidrate o RNA no pellet de sílica adicionando 50 microlitros de água destilada livre de RNase. Adicione um microlitro de RNA sin vortex e deixe a 56 graus Celsius por 15 minutos.

Centrifugue por três minutos em velocidade máxima e colete o sobrenadante temporário contendo o RNA. Quantifique as amostras utilizando a técnica não drop e armazene o RNA extraído a menos 70 graus Celsius. Até o uso, extraia o RNA viral comercialmente.

Agora vamos demonstrar a extração de RNA de fezes utilizando o kit comercial Kay Amp Viral RNA. O kit contém as seguintes componentes: coluna MinPin com gel de sílica, tampão A-V-L, A-W1, A-W2, A-VE e RNA transportador. Resumidamente, o procedimento é o seguinte.

Misture uma porção do tampão A VL com RNA transportador e vórtex. Pipete a solução em tubos de 1,5 mililitro contendo 114 microlitros de suspensão fecal e misture por vórtex. Incube à temperatura ambiente por 15 minutos. Centrifugue os tubos brevemente.

Adicione etanol às amostras e misture por agitação pós-vortex por 15 segundos. Em seguida, centrifugue brevemente, aplique a solução na coluna de centrifugação em um tubo de coleta de dois minimos. Puxe o fuge.

Em seguida, coloque a coluna de centrifugação em um novo tubo de coleta. Lave a coluna com o RNA retido utilizando o tampão A W um sem portador de RAN em centrífuga. Coloque a coluna em um tubo de coleta limpo de dois mililitros e lave a coluna com o tampão.

Em uma centrífuga W2 em velocidade máxima, coloque a coluna com pino em um tubo microcentrífuga limpo de 1,5 mililitro e realize a centrifugação em velocidade máxima. Em seguida, elua o RNA utilizando o tampão A VE e armazene o RNA viral a menos 70 graus Celsius até o uso. Detecção de neurovírus no RNA extraído por PCR em tempo real em um único passo, com sondas específicas da Techman. Para preparar uma mistura para o grupo genético um de camundongo e o grupo dois de Dina, mantenha a mistura enzimática RT em gelo durante o ensaio. O kit montado contém os seguintes componentes: água para PCR, dois ovos, primers e sondas para Dina.

Grupo de primers e sonda para Dina Grupo dois. E, finalmente, o mix enzimático RT, vórtex o reagente H antes do uso, adicione água PCR ao mix mestre, dois X primers, coke G um sentido e antissentido, e sonda anel um A e um B para UniGroup. Um mix muscular e primers COG G dois para VA sentido e antissentido e sonda.

Adicione dois anéis para a mistura mestra do grupo Theo dois. E, finalmente, adicione uma enzima artix a ambas as misturas musculares do grupo INO. Vortex e aliqueote 10 microlitros da mistura muscular apropriada para os poços de reação.

Em outro compartimento, adicione cinco microlitros de RNA não diluído, cinco microlitros de RNA controle positivo G1 e G2 e cinco microlitros de controle negativo às rodas de reação correspondentes. Centrifugue brevemente por 10 segundos a 6.000 g. Na etapa um, o software exibe a configuração avançada.

E na tela de propriedades do experimento, o experimento é identificado como norovírus. O tipo de experimento é presença ou ausência na tela do alvo. Insira o nome do alvo que deseja detectar na placa de reação de PCR.

Gina, repórter do grupo um e dois com a família fam e o quencher Tamara na amostra e na tela de replicação. Insira o número de amostras e de controles positivo e negativo incluídos na placa de reação e, em seguida, selecione quais amostras ou direção do alvo serão configuradas no método de execução. Primeiro, realize uma transcrição reversa a 50 graus Celsius para a síntese de DNA complementar.

Em seguida, aumente a temperatura para 95 °C para ativar uma polimerase com início quente. Inicie o ciclo com uma duração de 95 °C, seguido por uma etapa combinada de anelamento e amplificação a 60 °C. Repita o ciclo 45 vezes e retorne à configuração da placa.

Clique em salvar um modelo e salve o experimento. Clique em iniciar execução. A tela do gráfico de amplificação permite visualizar a amplificação da amostra enquanto seu instrumento coleta os dados congelados durante uma execução, bem como o contraste do gráfico.

Fluorescência normalizada da reação e número de ciclo. Nos ciclos iniciais da PCR, há pouca alteração no sinal fluorescente. Isso define a linha de base.

Um aumento na fluorescência acima da linha de base indica a detecção do alvo acumulado. Um limiar fluorescente fixo deve ser definido acima da linha de base. O parâmetro ciclo do limiar CT é definido como o número fracionário de ciclos no qual a fluorescência ultrapassa o limiar fixo.

A tela do gráfico de amplificação é útil para identificar e examinar amplificações anormais, como aumento da fluorescência em poços de controle negativo e ausência de fluorescência detectável em um ciclo esperado. O método do kit é confiável, mas exige uma quantidade enorme de tempo e recursos. Aqui demonstramos um método igualmente confiável, que é economicamente viável e utiliza reagentes facilmente disponíveis no país, eliminando a dependência de materiais adquiridos no exterior, o que acabará por proporcionar um diagnóstico mais acessível e tratamento rápido das causas virais mais comuns de gastroenterite em crianças. Utilizando o método econômico interno para o isolamento de ácidos nucleicos, que obteve resultados semelhantes aos.

Obtido com o kit comercial da Kerogen, juntamente com o TAC MAN, R-T-P-C-R, desenvolvido em nosso laboratório. Podemos detectar uma ampla variedade de infecções por neurovírus. O ensaio mostrou-se útil para diagnóstico de rotina, pois elimina o processamento do produto pós-amplificação, reduzindo assim o tempo do ensaio.

Além do diagnóstico, o protocolo também pode ser utilizado para esclarecer a epidemiologia da infecção por neurovírus, sendo assim útil para o controle em saúde pública dessa doença.