Name: Detecção e Genogrouping de norovírus a partir de fezes das crianças, Taqman Um passo-RT-PCR (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 16 s
Description: Aprenda a detectar e genotipar norovírus em amostras fecais de crianças usando RT-PCR em tempo real com sondas TaqMan. Este método de um passo oferece alta sensibilidade e especificidade para diagnóstico virológico.

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Os autores gostariam de agradecer ao Centro Laboratório Nacional Calicivirus for Disease Control and Prevention (CDC) para a dom espécie de alguns aspectos positivos padrão e controle de Nov, e Laboratórios da Escola de Saúde Pública da Universidade Johns Hopkins para a prestação dos reagentes.

1. As amostras de fezes <ol><li> As amostras de fezes devem ser armazenadas congeladas a preservar o RNA. Para fazer uma suspensão a 10% fecal, tomar aproximadamente 0,1 g de amostra de fezes descongeladas e completar a 1 ml com PBS. </li><li> Alíquota em 200 ul para evitar repetidos ciclos de congelamento e descongelamento. Armazenar as alíquotas a -70 ° C. </li><li> Descongelar e centrifugar alíquotas a 4.000 g durante 10 min antes da utilização na extracção. </li></ol> 2. Preparação de partículas de sílica para extracção com guanidina e Sílica <ol><li> À temperatura ambiente, suspender 30 g de dióxido de silício e completar com dH2O até 250 mL. </li><li> Após 24 horas de sedimentação, remover 215 ml do sobrenadante por sucção. Adicionar de dH2O até 250 mL, e suspender o sedimento de sílica por agitação. </li><li> Após mais 24 horas, remover o sobrenadante por sucção, e ajustar o pH da suspensão de sílica para pH 2,0, utilizando ácido clorídrico (HCl). Alíquota da suspensão de sílica em bot vidroTLEs e autoclave. </li></ol> 3. Preparação de L6 tampão para extração com Guanidina e Sílica <ol><li> À temperatura ambiente, preparar L6 tampão por dissolução de 60 g de tiocianato de guanidínio (GuSCN) e 1,3 g de Triton X-100 em 50 mL de 0,1 M cloridrato de Tris, pH 6,4, e 11 mL de uma 0,2 M EDTA, a solução de pH 8,0. </li></ol> 4. Preparação do Tampão de L2 para extração com Guanidina e Sílica <ol><li> À temperatura ambiente, preparar tampão L2 por dissolução de 180 g de tiocianato de guanidínio (GuSCN) em 150 mL de 0,1 M cloridrato de Tris, pH 6,4. </li></ol> 5. Processo de Extracção <ol><li> Em cada uma extracção NoV amostra de fezes positiva, como controlo positivo, e água tratada com DEPC, como controle negativo, deve ser incluída. </li><li> Num tubo de centrífuga de micro-misturar o seguinte; 1 mL de tampão de L6, 20 uL de partículas de sílica, e adicionar 200 uL da suspensão de extracto de 10% fecal. Vortex brevemente e deixe à temperatura ambiente por 15 min. </li><li> Centrifugar a suspensão a 6000 g durante 10 s e lavar o sedimento com 1 ml de tampão de L2 duas vezes, seguido por duas lavagens com etanol a 70% e uma vez com acetona. Seca-se o sedimento em um bloco de aquecimento a 56 ° C durante 5 min. </li><li> Hidrato o RNA no pelete de sílica através da adição de 50 uL de RNase dH 2 0. Adicionar 1 mL de RNasin, mistura invertendo o tubo e incubar a 56 ° C durante 15 min. </li><li> Centrifugar durante 3 min a toda a velocidade, numa centrífuga de mesa, e recolher 40 uL do sobrenadante contendo o RNA. </li><li> Quantificar as amostras extraídas de RNA usando Nanodrop 2000 espectrofotômetro (Thermo científico). Em seguida, armazenar a -70 ° C até à sua utilização, até 6 meses. (Nota: A melhor maneira de preservar intacto o RNA total é convertê-la em cDNA). </li></ol> 6. Extração alternativa Usando o Comercial RNA Viral RNA QIAamp Kit As instruções completas são encontradas na prov livretoided com o kit QIAGEN. Resumidamente, o procedimento é como se segue: <ol><li> Pipete 560 de Tampão AVL contendo o RNA transportador para um tubo de 1,5 mL, e adicionar 140 uL da suspensão de fezes de 10%. Mix por pulso vórtex para 15 seg. Incubar a RT durante 10 min. </li><li> Adicionar 560 uL de etanol (96-100%) para a amostra e misturar por pulso vórtex durante 15 segundos, depois brevemente centrifugar. </li><li> Aplicar 630 uL desta solução a uma coluna de spin colocado num tubo de recolha de 2 mL. Centrifugar durante 1 min a 6.000 g; então colocar a coluna de spin em um tubo limpo mL 2. </li><li> Lavar a coluna contendo RNA ligados com 500 uL de tampão de AW1 e centrifugar a 6000 g durante 1 min. Coloque em uma coluna de tubo de coleta limpo 2 mL. </li><li> Lavar a coluna com 500 uL de tampão e centrifuga-se AW2 a toda a velocidade (20.000 g ou 14.000 rpm) durante 3 min. </li><li> Coluna de spin em lugar de 1,5 mL tubo limpo micro centrífuga, adicionar 40 água tratada com DEPC-tratada uL e eluir o RNA à velocidade máxima. Repita emce para um uL 80 final de ARN eluídas. </li><li> Quantificar as amostras extraídas de RNA usando Nanodrop 2000 espectrofotômetro (Thermo científico). Em seguida, armazenar a -70 ° C até à sua utilização, até 6 meses. (Nota: A melhor maneira de preservar intacto o RNA total é convertê-la em cDNA). </li></ol> 7. Detecção de norovírus no RNA extraídos por um passo de tempo real de RT-PCR com sondas específicas TaqMan Instrumento StepOnePlus Real Time PCR Systems (Applied Biosystems). Metodologia <ol><li> Limpe e Limpe todas as superfícies de trabalho, pipetas, centrífugas e com RNase AFASTADO para eliminar qualquer contaminação RNase potencial. </li><li> Pipetar o GI e GII NoV triagem mestre mistura de acordo com a Tabela 1. Sondas Primers e Taqman estão listados na Tabela 2. </li><li> Alíquota de 10 uL de master mix adequado a cada tubo de reação. </li><li> Adicionar 5 uL de amostra desconhecida não diluídoRNA, água tratada com DEPC-tratada como controle negativo, ou GI respectivamente GII controlo positivo de RNA, aos poços de reacção correspondentes. Todas as amostras devem ser executados em duplicata. Os controlos positivos e padrões com concentração de 300 ug / uL e 500 ug / uL, respectivamente, foram fornecidas pelo Laboratório Nacional Calicivirus Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC). </li><li> Centrifugar a placa de reacção em 6000 g durante 10 seg. </li><li> Na tela de propriedades do experimento; definir e selecionar um tipo de experimento para a execução. Assegure-se os reagentes TaqMan são apresentados como o tipo de reagentes, e que leitura pré-PCR e amplificação são seleccionados. </li><li> Executar 15 uL reacções usando o perfil térmico na Tabela 3. </li><li> Analisar os resultados. </li></ol> 8. Genotipagem de NoV GI e GII Usando RT-PCR convencional e Sequenciamento (Não é mencionado no vídeo, já que é um método comum e amplamente utilizado.) Instrumento. Applied Biosystems StepOne e Sistemas de Tempo StepOnePlus reais PCR com o modelo Quantitec. Metodologia <ol><li> Antes de genotipagem, o genogrupo (GI ou GII) das amostras são determinados pelo rastreio de RT-PCR acima descrito. GI NoV RNA tem de ser amplificada com a mistura mestre genotipagem GI e GII NoV o RNA com a mistura GII mestre genotipagem. </li><li> Pipetar o GI e GII NoV genotipagem mestre mistura conforme a Tabela 4. Primers GI SKF / SKR e G2 SKF / SKR estão listados na Tabela 5. </li><li> UL alíquota 45 da mistura principal apropriado para tubos de reacção de 0,2 mL. </li><li> Adicionar 5 uL de DEPC tratada com água a cada tubo de controlo negativo, e 5 uL de um pré-filtrada, Nov (GI e / ou GII) RNA positivas para o tubo de reacção correspondente. </li><li> Correr 50 uL reacções usando o perfil térmico na Tabela 6. </li><li> Enviar produtos de PCR containing, pelo menos, 100 ng / uL da região da cápside amplificado para Macrogen Companhia para a purificação e sequenciação. (9700 Grande Seneca Hwy. Rockville, MD 20850 e US $ 10 por amostra por seqüenciamento). </li></ol> 9. Os resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/3232/3232fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 1"> A Figura 1 mostra resultados representativos do Taqman Um passo-RT-PCR, quando usada para RNA de ensaio extraídos a partir de amostras de fezes de crianças diarréicas. O ciclo threshold (Ct) para uma amostra positiva foi fixado em menor ou igual a 37 Ct para GI e GII 39 para Ct. O CT-valores para os controles positivos foram encontrados para ser inferior a 27 e 18 da junção ORF1-ORF2 para GI e GII, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3232/3232fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/3232/3232fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="A Figura 2"> A Figura 2 <table border="1"><tbody><tr><td> Mix Master </td><td> Concentração final </td><td> Volume (uL) </td></tr><tr><td> H 2 0 PCR </td><td></td><td> 2,875 </td></tr><tr><td> Quantitect RT-PCR Master Mix </td><td> 1x </td><td> 6,250 </td></tr><tr><td> RT Mix </td><td> 1x </td><td> 0,125 </td></tr><tr><td> 50 mM Cog cartilha R </td><td> 1 uM </td><td> 0,250 </td></tr><tr><td> 50 primers F mM Cog </td><td> 1mM </td><td> 0,250 </td></tr><tr><td> 10 sonda Anel mM </td><td> 1 uM </td><td> 0.125/0.250 * </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 10,00 </td></tr></tbody></table> * UL 0,250 de cada sonda foi utilizada para o teste GI, enquanto 0,125 L de cada sonda foi utilizada para o teste GII. Tabela 1. Qiagen Quantitect master mix para triagem GI e GII (Trujillo et al., 2006) 7. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Geno-grupo </td><td> Usar </td><td> Sequência (5 'para 3') </td></tr><tr><td> Cog 1R </td><td> GI </td><td> Cartilha </td><td> CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C </td></tr><tr><td> Cog 1F </td><td> GI </td><td> Cartilha </td><td> CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA </td></tr><tr><td> Cog 2R </td><td> GII </td><td> Cartilha </td><td> TCG ACG TCT CCA TCA TTC ACA </td></tr><tr><td> Cog 2F </td><td> GII </td><td> Cartilha </td><td> CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG </td></tr><tr><td> Anel 1A </td><td> GI </td><td> Probe </td><td> FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1 </td></tr><tr><td> 1B Anel </td><td> GI </td><td> Probe </td><td> FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1 </td></tr><tr><td> Ring2-TP </td><td> GII </td><td> Probe </td><td> FAM-TGG GGC GAG GAT CGC AAT CT-BHQ-1 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Primer e oligonucleótidos sonda utilizada em tempo real RT-PCR quantitativo para genogrupos I, II (Kageyama et al.,2003) 8. <table border="1"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Temp (° C) </td><td> Tempo (min) </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 50 </td><td> 30:00 </td><td> síntese de cDNA </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 </td><td> 15:00 </td><td> HotStart activação polimerase Taq </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 95 </td><td> 00:15 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 60 </td><td> 01:00 </td><td> Ciclos 45x </td></tr></tbody></table> Tabela3. Perfil térmico para uma etapa Taqman em tempo real RT-PCR (Trujillo et al., 2006) 7. <table border="1"><tbody><tr><td> Mix Master </td><td> Concentração final </td><td> Volume (uL) </td></tr><tr><td> H 2 0 PCR </td><td></td><td> 29,50 </td></tr><tr><td> 5X Qiagen RT-PCR Tampão </td><td> 1x </td><td> 10,00 </td></tr><tr><td> 10 mM mistura de dNTP </td><td> 0,4 mM </td><td> 2,00 </td></tr><tr><td> Mix enzima </td><td></td><td> 2,00 </td></tr><tr><td> 40 RNasin U / uL </td><td> 20 U / uL </td><td> 0,50 </td></tr><tr><td> 10 uM SKF </td><td> 0,1 mM </td><td> 0,50 </td></tr><tr><td> 10 SKR mM </td><td> 0,1 mM </td><td> 0,50 </td></tr></tbody><tbody><tr><td></td><td></td><td> 45,00 </td></tr></tbody></table> Tabela 4. Qiagen One-Step RT-PCR master mix para genotipagem GI e GII. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Geno-grupo </td><td> Usar </td><td> Sequência (5 'para 3') </td></tr><tr><td> G1SKF </td><td> GI </td><td> Cartilha </td><td> 5'-CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA - 3 </td></tr><tr><td> G1SKR </td><td> GI </td><td> Cartilha </td><td> 5'-CCA CAR ACC CCA TTR TAC A - '3 </td></tr><tr><td> G2SKF </td><td> GII </td><td> Cartilha </td><td> 5'-GGG CNT AGG GCG ATC GCA A - 3 </td></tr><tr><td> G2SKR</td><td> GII </td><td> Cartilha </td><td> 5'-GCA CCR CCN TRH CCR TTR TA CAT-3 </td></tr></tbody></table> Primers Tabela 5. Utilizados para a amplificação da região C da Região da Cápside (Kojima et ai., 2002). 5 <table border="1"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Temp (° C) </td><td> Tempo (min) </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 30:00 </td><td> síntese de cDNA </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 96 </td><td> 15:00 </td><td> HotStart activação polimerase Taq </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 94 </td><td> 00:030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 52 </td><td> 01:00 </td><td> Ciclos 40X </td></tr><tr><td></td><td> 72 </td><td> 00:30 </td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> 72 </td><td> 10:00 </td><td> Recozimento </td></tr></tbody></table> Tabela 6. Perfil térmico para Taqman One-Step RT-PCR.

<ol><li>Medici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+epidemiology+of+Norovirus+infections+in+sporadic+cases+of+viral+gastroenteritis+among+children+in+Northern+Italy%5BTitle%5D)+AND+%22L.+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy.</a> L. Medical Virology. 78, (2006).</li>
<li>Vidal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+recombinant+Norovirus+causing+outbreaks+of+gastroenteritis+in+Santiago%2C+Chile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clinica+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile.</a> J. Clinica Microbiology. 4, (2006).</li>
<li>Xavier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+caliciviruses+associated+with+acute+infantile+gastroenteritis+in+Salvador%2C+an+urban+center+in+Northeast+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Braz.+J.+Med.+Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil.</a> Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).</li>
<li>Boom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li>
<li>Kojima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genogroup-specific+PCR+primers+for+detection+of+Norwalk-like+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses.</a> J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).</li>
<li>Mattison, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+comparison+of+two+norovirus+ORF2-based+genotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 3927-3932 (2009).</li>
<li>Trujillo, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+TaqMan+real-time+reverse+transcription-PCR+for+rapid+detection%2C+quantification%2C+and+typing+of+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).</li>
<li>Kageyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broadly+reactive+and+highly+sensitive+assay+for+Norwalk-like+viruses+on+real-time+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Usando o económico in-house método para isolar o ácido nucleico a partir de amostras de fezes, obtém-se resultados iguais como com o comercial QIAmp de RNA viral kit de Qiagen, e em conjunto com o TaqMan RT-PCR desenvolvido no nosso laboratório que pode detectar uma ampla gama de NoV genótipos pertencentes ao GI e GII genogrupo. Uma publicação recente da região C protocolo relataram taxas de genotipagem de 78% 6. Uma vez que a diversidade das cepas contemporâneas Nov tem vindo a aumentar nos anos anteriores, ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Isotiocianato de guanidina </td><td> Sigma-Adrich </td><td> G9277 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T5941 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> Sílica </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5631 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X 100 </td><td> BDH Chemicals </td><td> 14530 </td><td></td></tr><tr><td> Dietilpirocarbonato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-5758 </td><td></td></tr><tr><td> QIAamp viral RNA Mini Kit (250) </td><td> QIAGEN </td><td> 52906 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) </td><td> QIAGEN </td><td> 204443 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen Um passo de RT-PCR Kit (200) </td><td> QIAGEN </td><td> 210212 </td><td></td></tr><tr><td> Rnase Inibidor 2000 unidades </td><td> A.Biosystems </td><td> N808-0119 </td><td> 2000 unids / frasco </td></tr><tr><td> Antiaderentes Rnae-free tubos de microcentrífuga </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose 1000 </td><td> Invitrogen </td><td> 16550-100 </td><td></td></tr></tbody></table>

detecção e genogrouping de norovírus a partir de fezes das crianças, taqman um passo-rt-pcr

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Os norovírus (NoVs) são a principal causa de surtos de gastroenterite aguda esporádica em todo o mundo em seres humanos de todas as idades. Eles são importante causa de hospitalizações em crianças com impacto na saúde pública semelhante à de Rotavirus. NoVs são vírus de RNA de grande diversidade genética e há uma aparência contínua de novas estirpes. Cinco genogrupos são reconhecidos; GI e GII com seus genótipos e subtipos muitos sendo o mais importante para a infecção humana. No entanto, o diagnóstico de dois genótipos continua a ser problemática, retardando o diagnóstico e tratamento. 1, 2, 3 Para extração de RNA a partir de amostras de fezes, o método mais comumente usado é o QIAmp kit RNA Viral comercial da Qiagen. Este método combina as propriedades de ligação de uma membrana de gel de sílica, buffers que as RNases de controlo e proporcionam ligação óptimas de ARN para a coluna, juntamente com a velocidade de MicroSpin. Este método é simples, rápido e confiável e é carrIED em alguns passos que são detalhados na descrição fornecida pelo fabricante. O norovírus é apenas a segunda rotavírus como a causa mais comum de diarréia. Diagnóstico norovírus devem estar disponíveis em todos os estudos sobre a patogênese da diarréia, bem como em surtos ou casos de diarréia individuais. Actualmente no entanto diagnóstico norovírus é restrita a poucos centros devido à falta de métodos simples de diagnóstico. Este diagnóstico e tratamento atrasos 1, 2, 3. Além disso, devido aos custos de transporte e regulamentado de buffers corrosivos dentro e entre países o uso desses kits manufaturados coloca problemas logísticos. Como resultado, neste protocolo descrevemos uma alternativa, económica, método in-house que se baseia na lança inicial et al. Método 4 que utiliza as propriedades de ligação de ácidos nucleicos de partículas de sílica, juntamente com as propriedades anti-nuclease de tiocianato de guanidínio . <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Para a detecção e genogrouping (GI e GII) de isolados NoVs de amostras de fezes, vários protocolos de RT-PCR utilizando diferentes alvos têm sido desenvolvidos. O consenso é que uma RT-PCR utilizando TaqMan química seria a melhor técnica molecular para o diagnóstico, porque combina alta sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade com alto rendimento e facilidade de utilização. Descrevemos aqui um ensaio de segmentação da estrutura de leitura aberta 1 (ORF1) região de junção-ORF2; a região mais conservada do genoma NoV e, portanto, mais adequado para o diagnóstico. Para a análise genética mais uma RT-PCR convencional que tem como alvo o altamente variável N-terminal a partir de casca-a principal proteína da cápside (Região C) utilizando iniciadores originalmente descritos por Kojima et ai. 5 é detalhado. A sequenciação do produto de PCR a partir do PCR convencional permite a diferenciação de genótipos pertencentes ao GI e genogrupos GII.

Um Um passo-ensaio de RT-PCR para a detecção e identificação genogrupo de isolados Norovirus a partir de fezes de crianças, que utiliza iniciadores e sondas de TaqMan específicos para o quadro de leitura aberta 1 (ORF1)-ORF2 região de junção, a região mais conservada do genoma norovírus é descrito. A não-comercial, custo-efetivo método de extração de RNA é detalhado.

Detecção e Genogrouping de norovírus a partir de fezes das crianças, Taqman Um passo-RT-PCR

Os norovírus (NoVs) são a principal causa de surtos de gastroenterite aguda esporádica em humanos de todas as idades em todo o mundo. Eles são uma causa importante de...

Deteção de neurovírus em RNA extraído por meio de R-T-P-C-R em tempo real em um único passo com sondas TECHMAN específicas. Mas hoje vamos falar sobre neurovírus. Isso ocorre em Lima, Peru, e é um grupo da universidade e também da Johns Hopkins University.Descobriu-se que o norovírus é provavelmente uma das causas mais negligenciadas de diarreia. O nosso grupo descobriu que o norovírus é o segundo maior responsável pelas hospitalizações de crianças por diarreia, bem como pelo número populacional de casos de diarreia. Então, por que o NOROVÍRUS não foi diagnosticado anteriormente?Bem, a razão é que se trata de um vírus de RNA e não podemos cultivá-lo, sendo necessários métodos especiais de biologia molecular para o diagnóstico. Esses métodos que utilizamos são a RT-PCR, e este vídeo vai demonstrar como usar a RT-PCR para diagnosticar o neurovírus. Utilizamos um método interno de extração de RNA viral a partir de amostras de fezes, baseado no método de Ciag GUINE descrito por Boom et al. em 1989.Este método é uma alternativa ao kit comercial de RNA viral à base de cloreto de cálcio. Ambos os métodos baseiam-se nas propriedades de ligação de ácidos nucleicos de partículas de sílica. C

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O método EPA 1615 usa um filtro eletropositivo para concentrar enterovírus e norovírus em águas ambientais e potáveis. Este manuscrito descreve o procedimento de coleta de amostras para análises do Método 1615.

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água pela cultura e RT-qPCR. I. Recolha de amostras de vírus

Aqui apresentamos um procedimento para medir o total de vírus cultiváveis usando a linha de células renais Buffalo Green Monkey. O procedimento fornece uma ferramenta padronizada para medir a ocorrência de vírus infecciosos em águas ambientais e potáveis.

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Aqui apresentamos um procedimento para quantificar enterovírus e norovírus em águas ambientais e potáveis usando PCR quantitativo de transcrição reversa. A recuperação média do vírus das águas subterrâneas com este procedimento padronizado do Método EPA 1615 foi de 20% para o poliovírus e 30% para o norovírus murino.

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. Parte III. Detecção de vírus por RT-qPCR

Uma metodologia de amostragem baseada em macroespuma foi desenvolvida e avaliada para a detecção e quantificação de norovírus em superfícies duras ambientais.

Swab método de amostragem para a detecção do norovírus Humano em Surfaces

Métodos de deteção de rotina utilizando a amplificação do genoma viral são limitados pela sua incapacidade de discriminar infecciosas de partículas não-infecciosas. O objetivo deste artigo é fornecer protocolos detalhados para métodos alternativos ajudar na discriminação de partículas infecciosas norovírus usando vinculação aptamer, espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de transmissão.

Métodos de alternativas In Vitro para a determinação da integridade estrutural do capsídeo Viral

Análise de reação em cadeia de polimerase quantitativo em tempo real combinada com transcrição reversa (RT-qPCR) tem sido amplamente utilizada para medir o nível de infecções por vírus de RNA. Aqui nós apresentamos um ensaio de RT-qPCR direto, que não requer uma etapa de purificação de RNA, desenvolvida para a quantificação de vários vírus de RNA, incluindo o vírus da dengue.

Dengue vírus RNA no sobrenadante de cultura de células infectadas por reação em cadeia da polimerase em tempo real de quantitativos de medição

Este protocolo diagnostica vírus de Lago de tilápia (TiLV) em tecidos de tilápia, utilizando metodologias de RT-PCR. Todo o método é descrito de dissecção de tecidos para extração de RNA total, seguida pela síntese do cDNA e detecção de TiLV por PCR convencional ou PCR quantitativo usando dsDNA vinculando um corante fluorescente de vinculação.

Deteção de tilápia Lago vírus usando convencional RT-PCR e SYBR Green RT-qPCR

Aqui nós apresentamos dois protocolos, um para medir a taxa de crescimento específico e outro para a capacidade de ligação de celular de rotavírus usando o ensaio de placa e RT-qPCR. Esses protocolos são disponível para confirmar as diferenças de fenótipos entre cepas de rotavírus.

Ensaios para a taxa de crescimento específico e a capacidade de ligação de celular de rotavírus

Quantitativa em Tempo Real reacção em cadeia da polimerase (qPCR) é um método rápido e sensível para investigar os níveis de expressão de vários microRNA (miRNA) moléculas em amostras de tumor. Usando este método de expressão de centenas de moléculas miRNA diferentes pode ser amplificado, quantificado e analisado a partir do mesmo modelo cDNA.

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Uso de luminescência de Cerenkov Imaging (CLI) para monitorar o tratamento de câncer pré-clínico é descrito aqui. Este método tira vantagem da radiação Cerenkov (CR) e imagiologia óptica (OI) para visualizar sondas marcadas radioactivamente e, assim, fornece uma alternativa ao PET na monitorização terapêutica pré-clínica e triagem de drogas.

Luminescência de Cerenkov Imaging (CLI) para o Monitoramento Terapia de Câncer

Aprenda a detectar e genotipar norovírus em amostras fecais de crianças usando RT-PCR em tempo real com sondas TaqMan. Este método de um passo oferece alta sensibilidade e especificidade para diagnóstico virológico.

Detecção e Genogrouping de norovírus a partir de fezes das crianças, Taqman Um passo-RT-PCR

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