Avaliação longitudinal do rato Perda Hind Limb óssea após lesão medular usando Novel, In vivo Metodologia,

Este procedimento demonstra um novo método utilizado para detectar e quantificar a perda dependente do tempo da densidade óssea das patas traseiras em camundongos após lesão medular. Isso é realizado primeiramente executando uma lesão por transecção espinhal em um camundongo anestesiado sob condições estéreis e aprovadas pelo comitê de ética em experimentação animal. Em seguida, após um período de recuperação, o animal é reanestesiado e imagens de raios X são obtidas da tíbia e da fíbula de ambas as patas traseiras, direita e esquerda.

Isso é realizado semanalmente até 40 dias após a lesão. Em seguida, é realizada uma análise de imagem dos exames de raio X. O passo final é realizar uma avaliação post mortem da densidade óssea em ossos das patas traseiras removidos cirurgicamente.

No fim, os resultados demonstram como a lesão medular induz uma perda rápida e progressiva da densidade óssea nas patas traseiras do camundongo. Este método inovador oferece alta resolução espacial e temporal utilizando doses mais baixas de raios X do que aquelas empregadas por outras modalidades de imagem. A osteoporose é uma condição potencialmente fatal que afeta indivíduos com lesão medular.

O que estamos propondo é um novo método a ser utilizado em estudos com animais sobre lesão da medula espinhal, que permite ao pesquisador acompanhar longitudinalmente, por longos períodos de tempo, a perda óssea associada à osteoporose. Isso é importante por dois motivos. Primeiro, isso proporcionará a oportunidade de estudar os mecanismos que influenciam o desenvolvimento da osteoporose.

O segundo ponto é que ele nos fornece um meio de testar novas intervenções destinadas a prevenir ou talvez reverter o desenvolvimento de osteoporose em pacientes com lesão medular. Embora este método possa fornecer informações sobre a osteoporose induzida por lesão medular, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como a perda óssea relacionada à idade que ocorre em mulheres pós-menopausa, bem como outras reduções induzidas por trauma na densidade óssea. A desutilização de membros decorrente de imobilização, após fratura ou outro dano, pode resultar em perda óssea substancial durante o processo de cicatrização. A aplicação de imagem longitudinal com baixa dose de raios-X em animais inteiros pode abrir novas possibilidades para o desenvolvimento de terapias destinadas a minimizar ou prevenir esses problemas.

Realize a cirurgia para lesão medular de acordo com os procedimentos sander e em conformidade com as diretrizes locais do comitê institucional de cuidados e uso de animais. Em seguida, a partir do dia 10, após a cirurgia medular, e continuando em intervalos de 10 dias até o dia 40, avalie os fêmures e tíbias direito e esquerdo de animais vivos anestesiados com lesão medular por transecção e controles não lesionados pareados por idade, realizando a varredura com o sistema IVUS Lumina XR. Antes da varredura, inicialize o dispositivo Lumina XR para permitir que a câmera interna atinja a temperatura operacional de menos 90 graus Celsius.

Coloque um animal anestesiado sobre a plataforma dentro do Lumina xr. Em seguida, insira uma lente de alta magnificação para permitir o foco nas regiões do fêmur e da tíbia. Verifique se o sujeito está adequadamente posicionado no campo de visão.

Se necessário, abra a porta e reposicione o animal. A posição adequada do animal é mostrada aqui. Uma vez devidamente posicionado, a função de raio-x pode ser executada.

Selecione na lista suspensa de energia a opção adequada para o animal. Em seguida, abra o painel de controle. Habilite o recurso de raio-x marcando a opção raio-x e adquira a imagem de raio-x.

O fêmur e a tíbia inteiros devem estar visíveis, como mostrado aqui. Como o software de imagem viva exibe imagens de raios X transformadas por padrão, certifique-se de que as imagens de raios X brutas sejam exibidas acessando o menu de ferramentas de filtragem de correções e removendo a marca de seleção ao lado da absorção de raios X. Os dados de imagem brutos são automaticamente salvos no disco rígido.

Arquivos TIFF representativos também são salvos. Após a aquisição de imagens, o camundongo é devolvido à sua gaiola original e mantido em observação pelo pesquisador para recuperação. O processo é então repetido com o próximo camundongo.

Primeiro, abra o software clicando duas vezes no ícone da imagem viva na caixa de diálogo que aparece. Selecione a pasta de interesse e clique em OK. Carregue uma imagem de raio X clicando no botão procurar.

O navegador de imagens vivas exibe os dados selecionados juntamente com o id do usuário. Informações de rótulo e informações de configuração da câmera. Para abrir os dados, clique duas vezes na linha de dados. A imagem e a paleta de ferramentas são exibidas.

Os dados abertos são destacados em azul no navegador. Em seguida, clique nas ferramentas de ROI. Na paleta de ferramentas das ferramentas de ROI, abra a lista suspensa de tipo e selecione ROI de medição.

Para carregar as três ROI utilizadas neste experimento, clique no ícone quadrado e carregue os quadrados. Usando uma régua, meça o comprimento do fêmur e ajuste o comprimento dos dois quadrados para ser um oitavo do comprimento total do fêmur. Ajuste a largura dos quadrados para ser um vinte e quatro avos do comprimento total do fêmur.

Agora, com a régua, meça um oitavo da distância a partir da extremidade proximal do fêmur e posicione um retângulo de modo que ele fique centralizado nessa posição. Mova o segundo retângulo para a extremidade distal do fêmur e posicione-o de forma que fique centralizado dentro da região trabecular do joelho. Em seguida, meça o comprimento da tíbia.

Ajuste o comprimento da caixa para um oitavo do comprimento total da tíbia. Ajuste a largura para um trinta avos do comprimento total da tíbia. Por fim, posicione a caixa de modo que ela fique centralizada e a uma distância equivalente a um oitavo do comprimento total da tíbia, a partir da extremidade proximal da tíbia, conforme mostrado aqui.

Em seguida, clique no ícone de medição; as medições de intensidade de ROI aparecerão na imagem de raio X e a tabela de medições de ROI será exibida. Exporte esta tabela para o local desejado como um arquivo CSV. Isso permitirá que a tabela seja aberta usando o Excel.

Repita este passo com todas as imagens salvas a serem analisadas. Por fim, consolide todos os dados em uma única planilha do Excel. A significância estatística é determinada por um teste T de Student utilizando software como o Microsoft Excel ou o software Sigma Plot 11.0; se desejado, os resultados podem ser comparados aos obtidos a partir da análise post mortem da densidade óssea utilizando absorciometria de raios X de dupla energia, seguindo protocolos padrão para este método.

A perda relativa de densidade óssea em um camundongo, tíbia e fêmur após lesão medular, quando comparada a camundongos ingênuos, pode ser detectada utilizando o método descrito acima. Esta figura mostra a perda de densidade óssea após lesão medular na tíbia proximal, aos 10, 20, 30 e 40 dias após a lesão. Em comparação com controles ingênuos pareados por idade, observa-se uma diminuição significativa de 12% na densidade óssea da tíbia já após 10 dias, com perda de até 15% na densidade óssea aos 40 dias.

Aqui observamos a perda de densidade óssea após lesão medular no fêmur proximal, 10, 20, 30 e 40 dias após a lesão. Em comparação com controles ingênuos pareados por idade, observou-se uma diminuição de 7% na densidade óssea no fêmur proximal aos 40 dias pós-lesão. Este gráfico mostra a perda de densidade óssea após lesão medular no fêmur distal aos 10, 20, 30 e 40 dias após a lesão.

Em comparação com controles ingênuos idosos correspondentes, a perda de densidade óssea no fêmur distal pôde ser observada já aos 10 dias após a lesão e foi mantida ao longo do restante do experimento. Esta imagem representativa de dados de absorciometria de raios X de dupla energia mostra o conteúdo mineral ósseo e a saída de densidade mineral óssea. Os fêmures ressecados foram analisados 40 dias após a lesão medular.

Para comparar a eficácia do método demonstrado neste protocolo com outros métodos atualmente disponíveis, esta figura mostra a análise de geometria por absorciometria de raios X de dupla energia do conteúdo mineral ósseo em gramas no fêmur de camundongos com lesão medular, 40 dias após a cirurgia, em comparação com animais controle não submetidos a procedimentos. Foi observada uma perda significativa de 12% no conteúdo mineral ósseo nos camundongos com lesão medular em comparação com os animais controle.

Aqui observamos a análise de geometria de dupla energia e extra abor da densidade mineral óssea em miligramas por centímetro quadrado no fêmur de camundongos com lesão medular, 40 dias após a lesão, em comparação com camundongos ingênuos pareados com H. A perda de densidade mineral óssea não mudou significativamente, mas seguiu uma tendência semelhante ao conteúdo mineral ósseo após dominado. Isso pode ser realizado em 20 a 30 minutos, mas lembre-se: é importante posicionar adequadamente as patas traseiras.

Após observar este vídeo, você deverá ter uma ideia de como realizar uma avaliação longitudinal em animais vivos da densidade óssea após lesão medular, utilizando o dispositivo Caliper Instruments Lumina XR.