Avaliação longitudinal do rato Perda Hind Limb óssea após lesão medular usando Novel, In vivo Metodologia,

Este procedimento demonstra um novo método utilizado para detectar e quantificar a perda dependente do tempo na densidade óssea dos membros posteriores em camundongos após lesão medular. Isso é realizado primeiramente realizando uma lesão por transecção espinhal em um camundongo anestesiado, sob condições estéreis e aprovadas pelo comitê de ética em uso de animais. Em seguida, após um período de recuperação, o animal é reanestesiado e são obtidas imagens de raios-X da tíbia e fíbula de ambos os membros posteriores direito e esquerdo.

Isso é realizado semanalmente até 40 dias após a lesão. Em seguida, é realizada uma análise de imagem dos exames de raio X. O passo final consiste em realizar uma avaliação post mortem da densidade óssea em ossos das patas traseiras removidos cirurgicamente.

No fim, os resultados mostram como a lesão medular induz uma perda rápida e progressiva da densidade óssea nas patas traseiras do camundongo. Este novo método oferece alta resolução espacial e temporal utilizando doses mais baixas de raios X do que aquelas empregadas por outras modalidades de imagem. A osteoporose é uma condição potencialmente fatal que afeta pessoas que vivem com lesão medular.

O que estamos propondo é um novo método a ser utilizado em estudos com animais sobre lesão medular, que permite ao pesquisador acompanhar longitudinalmente, por longos períodos de tempo, a perda óssea associada à osteoporose. Isso é importante por dois motivos. Primeiro, isso proporcionará a oportunidade de estudar os mecanismos que influenciam o desenvolvimento da osteoporose.

O segundo é que ele nos fornece um meio de testar novas intervenções destinadas a prevenir ou talvez reverter o desenvolvimento de osteoporose em pacientes que vivem com lesão medular. Embora este método possa fornecer informações sobre a osteoporose induzida por lesão medular, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como a perda óssea relacionada à idade que ocorre em mulheres pós-menopausa, bem como outras reduções na densidade óssea induzidas por trauma; a inutilização de membros decorrente de imobilização, após fratura ou outro dano, pode resultar em perda óssea substancial durante o processo de cicatrização. A aplicação de imagem longitudinal de baixa dose de raios X em animais inteiros pode abrir novas perspectivas para o desenvolvimento de terapias destinadas a minimizar ou prevenir esses problemas.

Realize a cirurgia para lesão medular de acordo com os procedimentos padrão e em conformidade com as diretrizes locais do comitê institucional de cuidados e uso de animais. Em seguida, a partir do dia 10 após a cirurgia medular e continuando em intervalos de 10 dias até o dia 40, avalie os fêmures e tíbias direito e esquerdo de animais vivos anestesiados com lesão medular por transecção e controles não lesados pareados por idade, realizando a varredura com o sistema IVUS Lumina XR. Antes da varredura, inicialize o dispositivo Lumina XR para permitir que a câmera interna atinja a temperatura operacional de menos 90 graus Celsius.

Coloque um animal anestesiado sobre a plataforma dentro do Lumina xr. Em seguida, insira uma lente de alta magnificação para permitir o foco nas regiões do fêmur e da tíbia. Verifique se o sujeito está adequadamente posicionado no campo de visão.

Se necessário, abra a porta e reposicione o animal. A posição adequada do animal é mostrada aqui. Uma vez devidamente posicionado, a função de raio-x pode ser executada.

Selecione uma opção na lista suspensa de energia adequada para o animal. Em seguida, abra o painel de controle. Ative o recurso de raio-x marcando a opção raio-x e adquira a imagem de raio-x.

O fêmur e a tíbia inteiros devem estar visíveis, como mostrado aqui. Como o software de imagem viva exibe imagens de raios X transformadas por padrão, certifique-se de que as imagens de raios X brutas sejam exibidas acessando o menu de ferramentas de filtragem de correções e removendo a marca de seleção ao lado da absorção de raios X. Os dados de imagem brutos são automaticamente salvos no disco rígido.

Arquivos TIFF representativos também são salvos. Após a aquisição de imagens, o camundongo é então devolvido à sua gaiola de origem e mantido em recuperação sob observação do pesquisador. O processo é então repetido com o próximo camundongo.

Primeiro, abra o software clicando duas vezes no ícone da imagem viva na caixa de diálogo que aparece. Selecione a pasta de interesse e clique em OK. Carregue uma imagem de raio X clicando no botão procurar.

O navegador de imagens vivas exibe os dados selecionados juntamente com o id do usuário. Informações de rótulo e informações de configuração da câmera. Para abrir os dados, clique duas vezes na linha de dados. A imagem e a paleta de ferramentas são exibidas.

Os dados abertos são destacados em azul no navegador. Em seguida, clique nas ferramentas de ROI. Na paleta de ferramentas das ferramentas de ROI, abra a lista suspensa de tipo e selecione ROI de medição.

Para carregar as três ROI utilizadas neste experimento, clique no ícone quadrado e carregue os quadrados. Usando uma régua, meça o comprimento do fêmur e ajuste o comprimento dos dois quadrados para ser um oitavo do comprimento total do fêmur. Ajuste a largura dos quadrados para ser um vinte e quatro avos do comprimento total do fêmur.

Agora, com a régua, meça um oitavo da distância a partir da extremidade proximal do fêmur e posicione um retângulo de modo que ele fique centralizado nessa posição. Mova o segundo retângulo para a extremidade distal do fêmur e posicione-o de forma que fique centralizado dentro da região trabecular do joelho. Em seguida, meça o comprimento da tíbia.

Ajuste o comprimento da caixa a um oitavo do comprimento total da tíbia. Ajuste a largura a um trigésimo do comprimento total da tíbia. Por fim, posicione a caixa de modo que ela fique centralizada e a uma distância de um oitavo do comprimento total da tíbia a partir da extremidade proximal da tíbia, conforme mostrado aqui.

Em seguida, clique no ícone de medição; as medições de intensidade de ROI aparecerão na imagem de raio X e a tabela de medições de ROI será exibida. Exporte esta tabela para o local desejado como um arquivo CSV. Isso permitirá que a tabela seja aberta usando o Excel.

Repita este passo com todas as imagens salvas a serem analisadas. Por fim, consolide todos os dados em uma única planilha do Excel. A significância estatística é determinada por um teste T de Student utilizando software como o Microsoft Excel ou o software Sigma Plot 11.0; se desejado, os resultados podem ser comparados aos obtidos a partir da análise post mortem da densidade óssea utilizando absorciometria de raios X de dupla energia, seguindo protocolos padrão para este método.

A perda relativa de densidade óssea em um camundongo, tíbia e fêmur após lesão medular, quando comparada a camundongos ingênuos, pode ser detectada utilizando o método descrito acima. Esta figura mostra a perda de densidade óssea após lesão medular na tíbia proximal, aos 10, 20, 30 e 40 dias após a lesão. Em comparação com camundongos ingênuos pareados por idade, há uma diminuição significativa de 12% na densidade óssea da tíbia já após 10 dias, com perda de até 15% na densidade óssea aos 40 dias.

Aqui observamos a perda de densidade óssea após lesão medular no fêmur proximal, 10, 20, 30 e 40 dias após a lesão. Em comparação com controles ingênuos pareados por idade, observou-se uma diminuição de 7% na densidade óssea no fêmur proximal aos 40 dias pós-lesão. Este gráfico mostra a perda de densidade óssea após lesão medular no fêmur distal aos 10, 20, 30 e 40 dias após a lesão.

Em comparação com controles ingênuos idosos correspondentes, a perda de densidade óssea no fêmur distal pôde ser observada já aos 10 dias após a lesão e foi mantida ao longo do restante do experimento. Esta imagem representativa de dados de absorciometria de raios X de dupla energia mostra o conteúdo mineral ósseo e a saída de densidade mineral óssea. Os fêmures ressecados foram analisados 40 dias após a lesão medular.

Para comparar a eficácia do método demonstrado neste protocolo com outros métodos atualmente disponíveis, esta figura mostra a análise de geometria por absorciometria de raios X de dupla energia do conteúdo mineral ósseo em gramas no fêmur de camundongos com lesão medular, 40 dias após a cirurgia, em comparação com animais controle não submetidos a procedimentos. Foi observada uma perda significativa de 12% no conteúdo mineral ósseo nos camundongos com lesão medular em comparação com os animais controle.

Aqui observamos a análise de geometria de dupla energia e extra-abdômen da densidade mineral óssea em miligramas por centímetro quadrado no fêmur de camundongos com lesão medular, 40 dias após a lesão, em comparação com camundongos ingênuos pareados. A perda de densidade mineral óssea não mudou significativamente, mas seguiu uma tendência semelhante ao conteúdo mineral ósseo. Uma vez dominado, isso pode ser realizado em 20 a 30 minutos, mas lembre-se: é importante posicionar corretamente as patas traseiras.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma ideia de como realizar uma avaliação longitudinal em animais vivos da densidade óssea após lesão medular, utilizando o equipamento Caliper Instruments Lumina XR.