Preparação de amostras, Imaging, and Analysis Protocolos para Faca de ponta microscopia de varredura

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a preparação de espécimes biológicos para seccionamento e imagem sob o microscópio de varredura de ponta de faca, ou KESM, e a visualização dos dados da pilha de imagens resultantes. Isso é feito primeiro fixando, colorindo e incorporando o tecido para prepará-lo para imagens sob o KESM. A segunda etapa do procedimento é configurar o KESM e realizar seccionamentos e imagens usando o software de controle automatizado.

As imagens resultantes são então registradas e cortadas com redução de ruído. A etapa final é carregar e explorar os conjuntos de dados em um atlas baseado na web e um software de visualização 3D. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o nível de todo o cérebro, organização neuronal e vascular em resolução submicrométrica.

A principal vantagem dessa técnica sobre os Mesos existentes, como a eletromicroscopia de varredura de base de bloco serial, é que ela pode obter imagens de volumes muito maiores, embora em uma resolução mais baixa. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da conectômica e da neurociência em geral. Esse método pode fornecer informações sobre a organização estrutural do cérebro e também pode ser aplicado a outros sistemas de órgãos, como pulmão e rim.

Para iniciar este procedimento, o cérebro do camundongo dissecado é colocado em um frasco de vidro contendo a solução de Golgi Cox. Coloque o frasco de vidro em uma caixa leve e hermética em temperatura ambiente por 10 a 16 semanas. Uma etapa de fixação separada não é necessária, pois a solução de Golgi Cox funciona como um fixador.

Após 10 a 16 semanas, enxágue o cérebro em água deionizada durante a noite no escuro no dia seguinte, mergulhe o cérebro lavado em solução de hidróxido de amônio a 5% em água deionizada por sete a 10 dias no escuro em temperatura ambiente. Após sete a 10 dias, enxágue o cérebro novamente em água deionizada em temperatura ambiente por quatro horas. Em seguida, desidrate o cérebro por meio de uma série graduada de álcoois etílicos, deixando-o em cada solução por 24 horas, 50% de etanol e 70% de etanol a quatro graus Celsius e 85% de etanol.

Três trocas de etanol a 95% e quatro a cinco trocas de etanol a 100% à temperatura ambiente. Em seguida, coloque o cérebro desidratado em acetona e faça três a quatro mudanças cada por um dia. Depois disso, coloque o cérebro durante a noite na geladeira em cada uma dessas misturas de acetona aita com uma proporção de aite para acetona de um para dois, um para um e dois para um.

Finalmente, coloque o cérebro em 100% aite na geladeira, faça três mudanças de cada vez durante a noite. O cérebro tratado é então incorporado em 100% aite e aquecido a 60 graus Celsius por três dias. Finalmente, o bloco de amostra curado é montado no anel de amostra de metal, usando-o epóxi e as laterais do bloco aparadas conforme necessário para iniciar este procedimento.

Confirme se o mouse está profundamente anestesiado e não responde a um beliscão no dedo do pé. Em seguida, perfundiu o camundongo cordialmente usando solução salina tamponada com fosfato à temperatura ambiente, seguida de paraformaldeído tamponado com fosfato a 4% frio. Em seguida, perfunda o mouse com uma solução de 0,1% de thi e tinga em água deionizada.

Depois disso, coloque o corpo em uma geladeira de quatro graus Celsius por 24 horas. Após 24 horas, retire o cérebro da panturrilha e coloque numa solução fresca de 0,1% de tionina. Deixe o cérebro a quatro graus Celsius por sete dias.

Após sete dias, detenha e desidrate o cérebro por meio de uma série graduada de álcoois etílicos. Durante um período de seis semanas, três a cinco dias em etanol a 50%, sete a 10 dias em etanol a 70%, cerca de duas semanas cada em etanol a 85 e 95% e o restante do tempo em etanol a 100%. Após três trocas de acetona à temperatura ambiente, o cérebro é embutido em plástico erudito em um forno a 60 graus Celsius.

Para iniciar o procedimento de coloração da rede vascular com tinta nanquim, confirme pela falta do reflexo de retirada do dedo do pé que o camundongo está profundamente anestesiado. Em seguida, perfunda o camundongo cordialmente usando solução salina tamponada com fosfato à temperatura ambiente, seguida de formina tamponada 10% neutra à temperatura ambiente. A perfusão de corpo inteiro com solução salina e fixador é necessária para limpar o sangue do sistema cardiovascular e fixar os tecidos.

Em seguida, perfu o mouse com 3,0 ccs de perfusão de tinta nanquim não diluída. Com tinta nanquim é necessário preencher completamente a vasculatura do sistema cardiovascular. Após sua remoção do camundongo, o cérebro resultante é desidratado por meio de uma série de álcoois etílicos graduados e, em seguida, incorporado em plástico erudito.

Seguindo o protocolo mostrado anteriormente para configurar o KESM para imagens, ligue a câmera, o iluminador e o palco, levante a faca e a objetiva. Em seguida, instale o anel de amostra. Em seguida, abaixe a objetiva e a faca.

Meça as dimensões da amostra. Em seguida, crie um arquivo de configuração para o controlador de estágio KESM. Duas aplicações, levante a faca e o objetivo do KESM antes de inicializar o estágio.

Inicie o controlador de estágio KESM dois e inicialize o estágio. Em seguida, abaixe a faca e a objetiva e ligue a bomba. Foque a objetiva e a câmera girando o botão de foco no trem óptico e ajustando o campo de visão da câmera em relação ao fio da navalha.

Clique passo a passo para verificar as primeiras etapas da imagem e seccionamento. Em seguida, clique em ir. Para iniciar a imagem e seccionamento para processamento de imagem.

Execute o processador de pilha KESM para remover o artefato de iluminação e normalizar a intensidade do plano de fundo em todas as imagens. Repita o procedimento para todas as subpastas de dados. Para visualizar dados usando o atlas cerebral KESM, acesse este site e selecione o atlas apropriado para ir para uma profundidade diferente.

Selecione no menu suspenso a profundidade a cada etapa e clique em mais para aumentar ou menos para diminuir a profundidade Z. Outras opções incluem aumentar o zoom ou navegar usando o atlas cerebral KESM. Use o menu suspenso para ajustar o número da sobreposição e o intervalo da sobreposição para visualizar os dados usando o laboratório do VIS.

Inicie o aplicativo, crie um novo projeto. O projeto deve incluir: compor 3D a partir de arquivos 2D, definir a matriz mundial, aritmética e visualizar 3D conectado. Nessa ordem, os parâmetros apropriados devem ser definidos conforme mostrado na visualização 3D enquanto pressiona o botão direito do mouse.

Mova o mouse para ajustar as regiões de limite que podem ser cortadas. A orientação mudou, a iluminação mudou ou o fundo foi ativado ou desativado. Os resultados representativos do KESM são ilustrados pelos seguintes videoclipes mostrados primeiro são visualizações de volume de KESM, pilhas de dados de tinta Brain India inteiras para o conjunto de dados vasculares, começando com um close-up dos dados vasculares com uma largura de cerca de 100 mícrons.

Este segundo clipe de KESM, dados de tinta Brain India mostra três visualizações padrão de toda a vasculatura do cérebro do camundongo, subamostradas de dados de alta resolução com uma largura de cerca de 10 milímetros. A visão sagital, a visão coronal e a visão horizontal, bem como um fly through da seção coronal. KESM. Os dados de Golgi de camundongos de cérebro inteiro são ilustrados neste videoclipe que mostra uma sobrepassagem ao longo dos três diferentes planos de seccionamento, começando com a visão em bloco, seguida pela visão sagital, a visão coronal e a visão horizontal.

Os próximos detalhes dos dados do GoGy do camundongo de cérebro inteiro do KESM são mostrados. Este primeiro videoclipe é das células do cerebelo e purkinje. Este segundo clipe mostra o córtex e as células parametálicas.

Finalmente, KESM. Os dados do cérebro inteiro são ilustrados nesses dois videoclipes. Primeiro é mostrado um close-up dos dados NLE.

Este segundo clipe mostra três visualizações padrão de todo o cérebro do camundongo Nle dados subs amostrados de dados de alta resolução. Uma seção transversal também é mostrada para uma visão clara das estruturas internas após este desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência explorarem redes neuronais e vasculares no cérebro de camundongos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão da preparação de amostras, imagens e análise de dados para o microscópio de varredura de fio de faca.