Preparação de amostras, Imaging, and Analysis Protocolos para Faca de ponta microscopia de varredura

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a preparação de espécimes biológicos para corte e imagem sob o microscópio de varredura por borda de lâmina, ou KESM, e a visualização dos dados resultantes da pilha de imagens. Isso é realizado primeiramente fixando, corando e embutindo o tecido para prepará-lo para a imagem sob o KESM. O segundo passo do procedimento consiste em configurar o KESM e realizar o corte e a aquisição de imagens utilizando o software de controle automatizado.

As imagens resultantes são então registradas com redução de ruído e recortadas. O passo final é carregar e explorar os conjuntos de dados em um atlas baseado na web e em um software de visualização 3D. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a organização neuronal e vascular em nível de cérebro inteiro com resolução submicrométrica.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes de Mesos, como a microscopia eletrônica de varredura por bloco serial, é que ela pode imaginar volumes muito maiores, ainda que com resolução inferior. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da conectômica e da neurociência em geral. Este método pode fornecer informações sobre a organização estrutural do cérebro e também pode ser aplicado a outros sistemas orgânicos, como o pulmão e o rim.

Para iniciar este procedimento, o cérebro de camundongo dissecado é colocado em um frasco de vidro contendo a solução de Golgi-Cox. Coloque o frasco de vidro em uma caixa opaca à luz, à temperatura ambiente, por 10 a 16 semanas. Um passo de fixação separado não é necessário, pois a solução de Golgi-Cox atua como um fixador.

Após 10 a 16 semanas, lave o cérebro com água desionizada durante a noite, no escuro, no dia seguinte. Mergulhe o cérebro lavado em solução de hidróxido de amônio a 5% em água desionizada por sete a dez dias, no escuro e à temperatura ambiente. Após sete a dez dias, lave novamente o cérebro com água desionizada à temperatura ambiente por quatro horas. Em seguida, desidrate o cérebro por meio de uma série graduada de álcoois etílicos, mantendo-o em cada solução por 24 horas: etanol a 50% e etanol a 70% a quatro graus Celsius e etanol a 85%.

Três trocas de etanol a 95% e quatro a cinco trocas de etanol a 100% à temperatura ambiente. Em seguida, coloque o cérebro desidratado em acetona e realize três a quatro trocas, cada uma por um dia. Após isso, deixe o cérebro durante a noite na geladeira em cada uma dessas misturas de aite e acetona com proporções de um para dois, um para um e dois para um.

Por fim, coloque o cérebro em aite 100% na geladeira e realize três trocas, cada uma durante a noite. O cérebro tratado é então embutido em aite 100% e aquecido a 60 graus Celsius por três dias. Finalmente, o bloco do espécime curado é montado no anel metálico do espécime, utilizando epóxi, e os lados do bloco são aparados conforme necessário para iniciar este procedimento.

Confirme que o camundongo está profundamente anestesiado e sem resposta ao aperto no dedo da pata. Em seguida, realize a perfusão transcardial do camundongo utilizando solução salina tamponada com fosfato na temperatura ambiente, seguida por paraformaldeído a 4% frio tamponado com fosfato. A seguir, perfunda o camundongo com uma solução de 0,1% de ti e corante em água desionizada.

Após isso, coloque o corpo em uma geladeira a quatro graus Celsius por 24 horas. Após 24 horas, remova o cérebro do crânio e coloque em uma solução fresca de 0,1% de tionina. Deixe o cérebro a quatro graus Celsius por sete dias.

Após sete dias, fixe e desidrate o cérebro por meio de uma série graduada de álcoois etílicos. Durante um período de seis semanas, mantenha por três a cinco dias em etanol a 50%, sete a dez dias em etanol a 70%, cerca de duas semanas em etanol a 85% e a 95%, e o restante do tempo em etanol a 100%. Após três mudanças de acetona à temperatura ambiente, o cérebro é incluído em plástico erudito em uma estufa a 60 graus Celsius.

Para iniciar o procedimento de coloração da rede vascular com tinta da China, confirme, pela ausência do reflexo de retirada do dedo, que o camundongo está profundamente anestesiado. Em seguida, realize a perfusão do camundongo por via transcardial com solução salina tamponada com fosfato à temperatura ambiente, seguida por formalina tamponada neutra a 10% à temperatura ambiente. A perfusão de todo o corpo com solução salina e fixador é necessária para remover o sangue do sistema cardiovascular e fixar os tecidos.

Em seguida, realize a perfusão do camundongo com 3,0 ccs de tinta da Índia não diluída. É necessário que a tinta da Índia preencha completamente a vasculatura do sistema cardiovascular. Após sua remoção do camundongo, o cérebro resultante é desidratado por meio de uma série de álcoois etílicos em concentrações crescentes e, em seguida, embutido em plástico erudito.

Após seguir o protocolo mostrado anteriormente para configurar o KESM para a aquisição de imagens, ligue a câmera, o iluminador e a platina, levante a lâmina e o objetivo. Em seguida, instale o anel do espécime. Depois, abaixe o objetivo e a lâmina.

Meça as dimensões do espécime. Em seguida, crie um arquivo de configuração para o controlador de estágio do KESM. Em duas aplicações, levante a lâmina e o objetivo do KESM antes de inicializar o estágio.

Inicie o controlador de estágio KESM dois e inicialize o estágio. Em seguida, abaixe a lâmina e o objetivo e ligue a bomba. Foque o objetivo e a câmera girando o botão de foco no trem óptico e ajustando o campo de visão da câmera em relação à borda da lâmina.

Clique, passo a passo, para verificar os primeiros passos da aquisição de imagens e do corte. Em seguida, clique em "ir". Para iniciar a aquisição de imagens e o corte para o processamento de imagens.

Execute o processador de pilhas KESM para remover artefatos de iluminação e normalizar a intensidade do fundo em todas as imagens. Repita para todas as subpastas de dados. Para visualizar os dados utilizando o atlas cerebral KESM, acesse este site e selecione o atlas apropriado para acessar uma profundidade diferente.

Selecione no menu suspenso a profundidade a ser alcançada em cada etapa e, em seguida, clique no sinal de mais para aumentar ou no de menos para diminuir a profundidade em Z. Outras opções incluem ampliar a imagem ou navegar utilizando o atlas cerebral KESM. Use o menu suspenso para ajustar o número de sobreposição e o intervalo de sobreposição para visualizar os dados usando o laboratório VIS.

Inicie o aplicativo e crie um novo projeto. O projeto deve incluir a composição 3D a partir de arquivos 2D, definir a matriz mundial, aritmética um e visualizar 3D conectado. Nessa ordem, os parâmetros apropriados devem ser definidos conforme mostrado na visualização 3D enquanto se pressiona o botão direito do mouse.

Mova o mouse para ajustar as regiões de limite que podem ser recortadas. A orientação mudou, a iluminação foi alterada ou o fundo foi ligado ou desligado. Os resultados representativos de KESM são ilustrados pelos seguintes clipes de vídeo mostrados inicialmente como visualizações volumétricas de KESM, pilhas completas de dados de tinta da Índia do cérebro inteiro para o conjunto de dados vasculares, começando com um close-up dos dados vasculares com uma largura de cerca de 100 micrômetros.

Este segundo clipe de KESM, dados de tinta da Índia do cérebro inteiro, mostra três vistas padrão da vasculatura cerebral completa do camundongo, subamostradas a partir de dados de alta resolução com largura de aproximadamente 10 milímetros. A vista sagital, a vista coronal e a vista horizontal, bem como uma passagem através da seção coronal. KESM. Dados de Golgi do cérebro inteiro de camundongo são ilustrados neste clipe de vídeo, que mostra uma passagem ao longo dos três diferentes planos de secionamento, começando pela vista do bloco, seguida pela vista sagital, a vista coronal e a vista horizontal.

A seguir, são apresentados mais detalhes dos dados do cérebro inteiro de camundongo GoGy obtidos por KESM. Este primeiro clipe mostra o cerebelo e as células de Purkinje. Este segundo clipe mostra o córtex e as células parametais.

Por fim, KESM. Os dados completos do cérebro obtidos por NLE são ilustrados nestes dois clipes de vídeo. Primeiramente, é mostrado um close-up dos dados de NLE.

Este segundo vídeo mostra três vistas padrão dos dados Nle do cérebro inteiro do camundongo, subamostrados a partir de dados de alta resolução. Também é apresentada uma seção transversal para uma visualização clara das estruturas internas após este desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de neurociência explorarem redes neuronais e vasculares no cérebro do camundongo.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão da preparação de espécimes, da obtenção de imagens e da análise de dados para o microscópio de varredura com borda de faca.