Name: Preparação de amostras, Imaging, and Analysis Protocolos para Faca de ponta microscopia de varredura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprenda a preparar amostras cerebrais de camundongo para microscopia de varredura de ponta de faca (KESM), incluindo fixação, coloração e incorporação. Este método permite visualizar redes neuronais e vasculares em resolução submicrométrica para estudos de conectômica.

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Este projeto foi financiado pelo NIH / NINDS (# 1R01-NS54252), NSF (# 0905041, # 0079874), o Programa de Tecnologia Avançada do Texas (# ATP-000512-0146-2001, # ATP-000.512-0261-2001), Texas A &amp; M Research Foundation, Departamento de Ciência da Computação e Engenharia da Universidade Texas A &amp; M, e 3Scan. Gostaríamos de agradecer a Bernard Mesa (Micro Star Technologies) para consulta e apoio técnico para a instrumentação KESM. Partes principais do desenho e implementação do KESM foi feito por Bruce H. McCormick, que morreu em 2007.

1. Preparação de amostras: Golgi-Cox <ol><li> Este protocolo segue de perto o protocolo de Mayerich et al. 7. </li><li> O mouse C57BL/6J está profundamente anestesiados com anestesia inalatória com isoflurano e depois decapitado. </li><li> O cérebro é removido e colocado em uma solução de fixação Golgi-Cox (1% cromato de potássio, dicromato de potássio 1% e 1% de cloreto de mercúrio em água deionizada). </li><li> O cérebro é deixado na solução de Golgi-Cox no escuro, à temperatura ambiente, por 10 a 16 semanas. </li><li> Os cérebros são lavados em água deionizada durante a noite no escuro. </li><li> O cérebro lavado está imerso em solução a 5% de hidróxido de amónio em água deionizada por 7 a 10 dias no escuro à temperatura ambiente. Desta vez foi uma longa preparação para garantir a infiltração de todo o cérebro, para que o precipitado negro teve a chance de forma completamente no tecido. </li><li> O cérebro é lavado novamente em água deionizada à temperatura ambiente durante 4 horas e tgalinha desidratado através de uma série graduada de álcoois etílico: 50% e 70% na geladeira (4 ° C), e 85%, 95% (3 mudanças), e 100% (4-5 mudanças) em temperatura ambiente. O cérebro é deixado em cada solução por 24 horas. </li><li> O cérebro desidratado é então colocado em acetona (3 a 4 mudanças, cada um para um dia), seguido por uma mistura de araldite-acetona com araldite-to-acetona proporção de 1:2, 1:1, 2:1, e finalmente em 100% araldite (3 mudanças, cada vez que durante a noite), na geladeira (4 ° C). </li><li> Finalmente, o cérebro tratada é incorporado em araldite 100% e aquecido a 60 ° C durante 3 dias (cf. protocolo de incorporação, em Abbott e Sotelo 2). Se as amostras são incorporados em LR White então as amostras são transferidas da solução de etanol últimos 100% por três mudanças de LR solução Brancos que estão cada mantido no frigorífico durante a noite, que é um procedimento padrão antes da polimerização. Três mudanças são feitas para garantir a infiltração completa. A amostra é tgalinha transferidos para nova LR Branca que é polimerizado em um recipiente fechado a 60 ° C por 24 horas, que é a quantidade necessária de tempo e temperatura para a polimerização adequada. </li><li> Fig. 1 mostra um cérebro Golgi-Cox manchada embutido em Araldite. </li><li> O bloco da amostra curada é, então, montado no anel espécime de metal usando epoxy, e os lados do bloco aparadas, conforme necessário (ver fig. 2). </li></ol> 2. Preparação de amostras: Nissl <ol><li> O mouse está profundamente anestesiados com ketamina e xilazina (1,7 mg de cetamina / xilazina 0,26 mg por cada 20 gramas de peso corporal) por via intraperitoneal e então injetada perfundidos transcardially usando 50 mL de temperatura ambiente tampão fosfato (pH 7,4), seguido por 250 mL de quarto temperatura neutra a 10% tamponado (pH 7,4). e, finalmente, com 3,0 cc de tinta nanquim diluído. </li><li> Perfusão de corpo inteiro com solução salina e fixador é necessário para limpar o sangue do sistema cardiovascular e para fixar a ti ssues. Perfusão com tinta nanquim é necessário para encher completamente a vasculatura do sistema cardiovascular. </li><li> O cérebro resultante é então desidratado através de uma série de álcoois graduados etílico (25% -100%) e depois incorporados em plástico araldite seguindo o protocolo em 1,8-1,9 acima. Se LR branco é o meio de incorporação, em seguida, o protocolo em 1.10 acima é seguido. </li></ol> 4. Preparação de amostras: Espécies genéricas, órgãos genéricos <ol><li> Para o caso genérico, a fixação pode ser feito tanto com paraformaldeído% 10% formalina tamponada neutra ou 4. </li><li> Para volumes pequenos de tecido, a difusão, em vez de perfusão é recomendada para fixação e coloração. No caso de pequenos organismos ou órgãos, coloração também pode ser feito durante o processo de desidratação. </li><li> O protocolo de incorporação é o mesmo que acima, embora os tempos de infiltração de solução pode ser reduzido para órgãos ou organismos que são muito menores do cérebro do rato inteiro. </li></ol>jove_title "setup&gt; 5. KESM e imagem <ol><li> Desligue bomba, por sua vez no palco, por sua vez diante das câmeras, ligue iluminador. </li><li> Aumentar a faca e objetivo. </li><li> Instale o anel de amostra. </li><li> Dimensão medida exemplar e criar um arquivo de configuração para a aplicação Stage KESM Controller2. </li><li> Iniciar Stage KESM Controller2 e inicializar palco. </li><li> Inferior faca / objetiva, por sua vez na bomba. </li><li> Foco objetivo e câmera, girando o botão de focalização no trem óptica e ajuste de campo da câmera de vista em relação ao fio da navalha. </li><li> Pressione em [Continuar] para iniciar a imagem. </li><li> Ver Figs. 3-8. Veja 9, 7 de detalhes técnicos. </li></ol> 6. Processamento de imagem e preparação de dados <ol><li> Copie o executável KESM Processor Stack para a pasta de dados sob a pasta arquivo de configuração (00000, 00001, etc.) </li><li> Execute o processador KESM Stack para remover artefato de iluminação e normalizar a intensidade de fundo em todas asimagens. Repita o procedimento para todas as subpastas de dados. </li><li> Prepare telhas multiescala a partir do conjunto de dados e fazer o upload e configurar os arquivos no servidor web KESM Cérebro Atlas. </li><li> Ver fig. 9. </li></ol> 7. De visualização de dados e análise <ol><li> Visualização utilizando o Atlas Cerebral KESM. Ir para <a href="http://kesm.cs.tamu.edu">http://kesm.cs.tamu.edu</a> e selecione o atlas apropriado. <ol><li> Navegar como no Google Maps. </li><li> Zoom in e out como em mapas do Google. </li><li> Para ir a uma profundidade diferente, selecione o quão profundo para ir a cada passo a partir do menu pull-down, e clique em qualquer [+] ou [-] para aumentar ou diminuir a profundidade z. </li><li> Ajustar o número de sobreposição usando o menu suspenso. </li><li> Ajustar o intervalo de sobreposição usando o menu suspenso. </li><li> Ver fig. 11. </li></ol></li><li> Visualização usando MeVisLab. <ol><li> Lançamento MeVisLab. </li><li> Criar um novo projeto. </li><li> A seguir, novos módulos podem estar criando por typing no nome do módulo na caixa de comando. </li><li> Criar módulo [Compose3Dfrom2DFiles], e vá para a pasta desejada. Entra em seqüência arquivo e clique em [GetFileList]. Verifique se as imagens selecionadas podem caber na memória. Clique em [Create3D] para criar volume. </li><li> Criar módulo [SetWorldMatrix], e definir a "escala" em "Elementary transformações" x, y, z para o tamanho apropriado voxel (0,6, 0,7, 1,0 para a objetiva de 10x 0.45NA). Link [Compose3Dfrom2DFiles] para [SetWorldMatrix]. </li><li> Conjunto de Matrix e transforma em "Composição Matrix" a "Ignore", "Ignorar", "Forward". </li><li> Criar módulo [Arithmetic1] e defina o "Function" para "Inverter (Max-Img)". Link [SetWorldMatrix] para [Arithmetic1]. </li><li> Criar módulo [View3D] e ligar [Arithmetic1]. </li><li> Em View3D, enquanto o botão direito do mouse é pressionado, mova o mouse para ajustar o limite. Você pode cortar as regiões, mudança de orientação (mouse move enquanto o botão esquerdo do mouse é pressionado), iluminação mudança (renderin volume deg ou MIP), ligar / desligar de fundo, etc </li><li> Ver fig. 10. </li></ol></li></ol> 8. Resultados representativos: Aqui, apresentamos todo o cérebro de dados e detalhes. Figos. 15/12 show inteiro do cérebro India Ink, Golgi, e os dados de Nissl sets 1, 4, 3. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Cérebro de camundongo fixo, manchado, e incorporados <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Espécime incorporado cérebro do rato montado no anel de amostra. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Microscópio de varredura The Knife Edge (KESM). Uma foto da KESM é mostrado com seus principais componentes marcados: (1) de montagem faca linha de alta velocidade scan-câmera, (2) objetiva do microscópio (3), diamante e colimador de luz, (4) speCimen tanque (para imagens de imersão em água), (5) três eixos de precisão palco ao ar-rolamento (6), iluminador microscópio de luz branca (7), bomba de água (nas costas) para a remoção do tecido seccionado, (8) servidor PC para controle de estágio e de aquisição de imagem (9), base de granito, e (10) ponte de granito. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Princípios de imagem do KESM. O diretor de operação da KESM é ilustrado. O objetivo ea faca é realizada no local, enquanto a amostra aposta no posicionamento move etapa (seta com linha sólida) na resolução de 20 nm ea velocidade de deslocamento de 1-5, e fica roçando a faca de diamante (5 mm de largura para objetiva de 10X), gerando uma seção fina que flui sobre a faca (seta com linha sólida). Linha-scan de imagens é feito perto da ponta da faca. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Câmera KESM e objetiva controles de foco. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. KESM montagem faca e controles. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Foco inicial através da porta de observação. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. KESM Controlador de Fase 2 do aplicativo (screenshot). <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig9.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 9"> Figura 9. KESM processador de pilha (screenshot). <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig10.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 10"> Figura 10. MeVisLab aplicação (screenshot). <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 11"> Figura 11 KESM Cérebro Atlas:. Interface Web (screenshot). <img alt="Figura 12" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig12.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 12"> Figura 12. KESM todo o cérebro dados tinta nanquim. Visualizações volume de pilhas de dados KESM são mostradas para o conjunto de dados vascular. (A) Close-up dos dados vascular. Largura ~ 100 um. (Bd) Três vistas padrão de toda a vasculatura cerebral do rato (subsampled de dados de alta resolução). Largura ~ 10mm. <img alt="Figura 13" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig13.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 13"> Figura 13. KESM todo o cérebro dados do mouse Golgi. <img alt="Figura 14" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig14.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 14"> Figura 14. KESM detalhes Golgi dados. <img alt="Figura 15" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig15.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 15"> Figura 15. KESM todo o cérebro dados Nissl. (A) Close-up do Ndados ISSL. ~ Hum 300 3. (Bd) Três vistas padrão do conjunto de dados do mouse cérebro Nissl (subsampled de dados de alta resolução). Seção transversal mostrada para uma visão clara das estruturas internas.

<ol><li>Abbott, L. C. High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbbott%2C+LC+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22">Neuroscience Meeting Planner</a>. Program No. 504.2, Society for Neuroscience. Washington, DC. (2008).</li>
<li>Abbott, L. C., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+catecholaminergic+innervation+in+weaver+and+normal+mouse+cerebellar+cortices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices.</a> Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChoe%2C+Y+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22">Neuroscience Meeting Planner</a>. Program No. 516.3, Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).</li>
<li>Choe, Y., Han, D., Huang, P. -S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+submicrometer+scans+of+mouse+brain+microstructure%3A+Neurons+and+vasculatures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22%5BJournal%5D)">Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, Society for Neuroscience Program. Chicago, IL. (2009).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChoe%2C+Y+%22High-Throughput+Image+Reconstruction+and+Analysis%3A+Intelligent+Microscopy+Applications%22">High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications</a>. Ravi Rao, A., Cecchi, G. , Artech House. Boston, MA. 11-37 (2008).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+out+the+octopus+connectome+at+submicron+resolution+using+the+knife-edge+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope.</a> BMC Neuroscience. 11, Suppl 1. 136-136 (2010).</li>
<li>Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).</li>
<li>Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+macro-scale+Transmission+Imaging+of+Microvascular+Networks+Using+KESM%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM.</a> Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).</li>
<li>McCormick, B. H. Development of the Brain Tissue Scanner. Technical Report. , Department of Computer Science, Texas A & M University. College Station, TX. (2002).</li>
<li>Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+connectome%3A+A+structural+description+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">The human connectome: A structural description of the human brain.</a> PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).</li>
</ol>

Todd Huffman é com 3Scan, uma empresa comercial que fabrica e comercializa a tecnologia KESM (EUA patente # 6744572).

O KESM permite um levantamento submicrometer nível de grandes volumes de amostra biológica (~ 1 cm 3). Este tipo de volume é suficiente para manter toda órgãos de animais pequenos, tais como cérebro, pulmões, corações, rins, etc digitalizadas imagens de órgãos como pode fornecer informações quantitativas sem precedentes sobre a organização estrutural destes órgãos, e permitir a modelagem computacional de funcionais diversas aspectos desses órgãos, incluindo circuito e de rede dinâmica, propriedades elétricas, fluida e dinâmica de fluxo de ar, ea dinâmica muscular. O protocolo de preparação de amostras e análise pós-protocolo detalhado neste artigo são esperados para ajudar grupos de pesquisa de fora para ter acesso mais fácil ao KESM e os dados resultantes. O protocolo de operação KESM ajudará esses pesquisadores externos para apreciar os benefícios e limitações desta modalidade de imagem única.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

preparação de amostras, imaging, and analysis protocolos para faca de ponta microscopia de varredura

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Grandes avanços no alto rendimento, alta resolução, técnicas de microscopia em 3D permitiram a aquisição de grandes volumes de dados neuroanatômicos na resolução submicrometer. Um dos primeiros instrumentos tais produzir todo o cérebro de dados em escala é o microscópio de varredura Knife Edge (KESM) 7, 5, 9, desenvolvido e hospedado no laboratório dos autores. KESM tem sido usado para seção e cérebros imagem inteira do mouse em resolução submicrometer, revelando os detalhes intrincados das redes neuronais (Golgi) 1, 4, 8, as redes vascular (tinta nanquim) 1, 4 e distribuição das células do corpo (Nissl) 3 . O uso de KESM não se restringe ao mouse nem o cérebro. Conseguimos imaged o cérebro do polvo 6, pulmão do rato, e no cérebro de ratos. Estamos atualmente trabalhando em embriões de peixe zebra inteira. Dados como estes podem contribuir enormemente para a pesquisa conectonomia 10; a microcirculação e pesquisa hemodinâmica; e pesquisar por estereologia providing um. exata chão verdade Neste artigo, vamos descrever o pipeline, incluindo a preparação de amostras (fixação, coloração, e incorporação), KESM configuração e instalação, de corte e de imagem com o KESM, processamento de imagem, preparação de dados e visualização de dados e análise. A ênfase será sobre a preparação de amostras e visualização / análise de dados obtidos KESM. Esperamos que o protocolo detalhado apresentado neste artigo para ajudar a ampliar o acesso a KESM e aumentar a sua utilização.

Todo o processo de preparação de amostras de imagens do cérebro para o seccionamento serial usando o microscópio de varredura Knife Edge, para visualização e análise de dados é descrito. Esta técnica é usada atualmente para adquirir dados cérebro do rato, mas é aplicável a outros órgãos, outras espécies.

Preparação de amostras, Imaging, and Analysis Protocolos para Faca de ponta microscopia de varredura

Avanços significativos em técnicas de microscopia 3D de alta resolução e alto rendimento permitiram a aquisição de grandes volumes de dados neuroanatômicos em...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a preparação de espécimes biológicos para corte e imagem sob o microscópio de varredura por borda de lâmina, ou KESM, e a visualização dos dados resultantes da pilha de imagens. Isso é realizado primeiramente fixando, corando e embutindo o tecido para prepará-lo para a imagem sob o KESM. O segundo passo do procedimento consiste em configurar o KESM e realizar o corte e a aquisição de imagens utilizando o software de controle automatizado.As imagens resultantes são então registradas com redução de ruído e recortadas. O passo final é carregar e explorar os conjuntos de dados em um atlas baseado na web e em um software de visualização 3D. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a organização neuronal e vascular em nível de cérebro inteiro com resolução submicrométrica.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes de Mesos, como a microscopia eletrônica de varredura por bloco serial, é que ela pode imaginar volumes muito maiores, ainda que com resolução inferior. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da conectômica e da neurociência em geral. Este método pode fornecer informações sobre a organização estrutural do cérebro e também pode ser aplicado a outros sistemas orgânicos, como o pulmão e o rim.Para iniciar este procedimento, o cérebro de camundongo dissecado é colocado em um frasco de vidro contendo a solução de Golgi-Cox. Coloque o frasco de vidro em uma caixa opaca à luz, à temperatura ambiente, por 10 a 16 semanas. Um passo de fixação separado não é necessário, pois a solução de Golgi-Cox atua como um fixador.Após 10 a 16 semanas, lave o cérebro com água desionizada durante a noite, no escuro, no dia seguinte. Mergulhe o cérebro lavado em solução de hidróxido de amônio a 5% em água desionizada por sete a dez dias, no escuro e à temperatura ambiente. Após sete a dez dias, lave novamente o cérebro com água desionizada à temperatura ambiente por quatro horas. Em seguida, desidrate o cérebro por meio de uma série graduada de álcoois etílicos, mantendo-o em cada solução por 24 horas: etanol a 50% e etanol a 70% a quatro graus Celsius e etanol a 85%.Três trocas de etanol a 95% e quatro a cinco trocas de etanol a 100% à temperatura ambiente. Em seguida, coloque o cérebro desidratado em acetona e realize três a quatro trocas, cada uma por um dia. Após isso, deixe o cérebro durante a noite na geladeira em cada uma dessas misturas de aite e acetona com proporções de um para dois, um para um e dois para um.Por fim, coloque o cérebro em aite 100% na geladeira e realize três trocas, cada uma durante a noite. O cérebro tratado é então embutido em aite 100% e aquecido a 60 graus Celsius por três dias. Finalmente, o bloco do espécime curado é montado no anel metálico do espécime, utilizando epóxi, e os lados do bloco são aparados conforme necessário para iniciar este procedimento.Confirme que o camundongo está profundamente anestesiado e sem resposta ao aperto no dedo da pata. Em seguida, realize a perfusão transcardial do camundongo utilizando solução salina tamponada com fosfato na temperatura ambiente, seguida por paraformaldeído a 4% frio tamponado com fosfato. A seguir, perfunda o camundongo com uma solução de 0,1% de ti e corante em água desionizada.Após isso, coloque o corpo em uma geladeira a quatro graus Celsius por 24 horas. Após 24 horas, remova o cérebro do crânio e coloque em uma solução fresca de 0,1% de tionina. Deixe o cérebro a quatro graus Celsius por sete dias.Após sete dias, fixe e desidrate o cérebro por meio de uma série graduada de álcoois etílicos. Durante um período de seis semanas, mantenha por três a cinco dias em etanol a 50%, sete a dez dias em etanol a 70%, cerca de duas semanas em etanol a 85% e a 95%, e o restante do tempo em etanol a 100%. Após três mudanças de acetona à temperatura ambiente, o cérebro é incluído em plástico erudito em uma estufa a 60 graus Celsius.Para iniciar o procedimento de coloração da rede vascular com tinta da China, confirme, pela ausência do reflexo de retirada do dedo, que o camundongo está profundamente anestesiado. Em seguida, realize a perfusão do camundongo por via transcardial com solução salina tamponada com fosfato à temperatura ambiente, seguida por formalina tamponada neutra a 10% à temperatura ambiente. A perfusão de todo o corpo com solução salina e fixador é necessária para remover o sangue do sistema cardiovascular e fixar os tecidos.Em seguida, realize a perfusão do camundongo com 3,0 ccs de tinta da Índia não diluída. É necessário que a tinta da Índia preencha completamente a vasculatura do sistema cardiovascular. Após sua remoção do camundongo, o cérebro resultante é desidratado por meio de uma série de álcoois etílicos em concentrações crescentes e, em seguida, embutido em plástico erudito.Após seguir o protocolo mostrado anteriormente para configurar o KESM para a aquisição de imagens, ligue a câmera, o iluminador e a platina, levante a lâmina e o objetivo. Em seguida, instale o anel do espécime. Depois, abaixe o objetivo e a lâmina.Meça as dimensões do espécime. Em seguida, crie um arquivo de configuração para o controlador de estágio do KESM. Em duas aplicações, levante a lâmina e o objetivo do KESM antes de inicializar o estágio.Inicie o controlador de estágio KESM dois e inicialize o estágio. Em seguida, abaixe a lâmina e o objetivo e ligue a bomba. Foque o objetivo e a câmera girando o botão de foco no trem óptico e ajustando o campo de visão da câmera em relação à borda da lâmina.Clique, passo a passo, para verificar os primeiros passos da aquisição de imagens e do corte. Em seguida, clique em "ir". Para iniciar a aquisição de imagens e o corte para o processamento de imagens.Execute o processador de pilhas KESM para remover artefatos de iluminação e normalizar a intensidade do fundo em todas as imagens. Repita para todas as subpastas de dados. Para visualizar os dados utilizando o atlas cerebral KESM, acesse este site e selecione o atlas apropriado para acessar uma profundidade diferente.Selecione no menu suspenso a profundidade a ser alcançada em cada etapa e, em seguida, clique no sinal de mais para aumentar ou no de menos para diminuir a profundidade em Z. Outras opções incluem ampliar a imagem ou navegar utilizando o atlas cerebral KESM. Use o menu suspenso para ajustar o número de sobreposição e o intervalo de sobreposição para visualizar os dados usando o laboratório VIS.Inicie o aplicativo e crie um novo projeto. O projeto deve incluir a composição 3D a partir de arquivos 2D, definir a matriz mundial, aritmética um e visualizar 3D conectado. Nessa ordem, os parâmetros apropriados devem ser definidos conforme mostrado na visualização 3D enquanto se pressiona o botão direito do mouse.Mova o mouse para ajustar as regiões de limite que podem ser recortadas. A orientação mudou, a iluminação foi alterada ou o fundo foi ligado ou desligado. Os resultados representativos de KESM são ilustrados pelos seguintes clipes de vídeo mostrados inicialmente como visualizações volumétricas de KESM, pilhas completas de dados de tinta da Índia do cérebro inteiro para o conjunto de dados vasculares, começando com um close-up dos dados vasculares com uma largura de cerca de 100 micrômetros.Este segundo clipe de KESM, dados de tinta da Índia do cérebro inteiro, mostra três vistas padrão da vasculatura cerebral completa do camundongo, subamostradas a partir de dados de alta resolução com largura de aproximadamente 10 milímetros. A vista sagital, a vista coronal e a vista horizontal, bem como uma passagem através da seção coronal. KESM. Dados de Golgi do cérebro inteiro de camundongo são ilustrados neste clipe de vídeo, que mostra uma passagem ao longo dos três diferentes planos de secionamento, começando pela vista do bloco, seguida pela vista sagital, a vista coronal e a vista horizontal.A seguir, são apresentados mais detalhes dos dados do cérebro inteiro de camundongo GoGy obtidos por KESM. Este primeiro clipe mostra o cerebelo e as células de Purkinje. Este segundo clipe mostra o córtex e as células parametais.Por fim, KESM. Os dados completos do cérebro obtidos por NLE são ilustrados nestes dois clipes de vídeo. Primeiramente, é mostrado um close-up dos dados de NLE.Este segundo vídeo mostra três vistas padrão dos dados Nle do cérebro inteiro do camundongo, subamostrados a partir de dados de alta resolução. Também é apresentada uma seção transversal para uma visualização clara das estruturas internas após este desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de neurociência explorarem redes neuronais e vasculares no cérebro do camundongo.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão da preparação de espécimes, da obtenção de imagens e da análise de dados para o microscópio de varredura com borda de faca.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Fonte: Mukherjee, K., et. al. análise de mitocôndrias cerebrais usando microscopia eletrônica de varredura serial de face de bloco. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a preparação, imagem e análise de tecido cerebral de camundongo usando um microscópio eletrônico de varredura serial (SBFSEM) para visualizar a ultraestrutura mitocondrial, permitindo o mapeamento preciso de sua morfologia e distribuição espacial nos compartimentos neuronais axonais e dendríticos.

 Imagem de mitocôndrias neuronais usando um microscópio eletrônico de varredura serial de face de bloco

Mostrado aqui é um método para visualizar a ultraestrutura da matriz extracelular em tecidos cardíacos descelularizados.

Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido macerado para visualizar a matriz extracelular

Um método é descrito pelo qual nanopartículas de pontos quânticos (QD) podem ser usadas para estudos imunocitoquímicos correlativos de tecido de patologia humana embebido em epóxi. Empregamos QDs conjugados com fragmentos de anticorpos comerciais que são visualizados por microscopia de luz de fluorescência de campo amplo e microscopia eletrônica de transmissão.

Correlativa luz e de Microscopia Eletrônica Usando Quantum Dot Nanopartículas

Este relatório descreve um protocolo de preparação de amostras e condições específicas de imagem para a realização de tomografia eletrônica de transmissão de varredura de espécimes biológicos espessos.

Preparação e observação de amostras biológicas Grosso por Scanning Transmission Electron Tomografia

Este estudo apresenta procedimentos confiáveis e fácil de obtenção de seções ultra-finas seriais de um microorganismo sem equipamentos caros em microscopia eletrônica de transmissão.

Um método para a obtenção de seções ultra-finas Serial de microorganismos em microscopia eletrônica de transmissão

Este protocolo visa células específicas no tecido para a imagem latente em nanoescala resolução usando um microscópio eletrônico de varredura (MEV). Um grande número de seções seriais de resina-incorporado material biológico é primeiro fotografado em um microscópio de luz para identificar o alvo e então em uma maneira hierárquica na SEM.

Multimodal Imaging hierárquica das seções Serial para encontrar alvos celulares específicos dentro de grandes Volumes

Aqui nós apresentamos um protocolo para a combinação de duas técnicas de processamento de amostra, de alta pressão congelamento e processamento de amostra assistida por microondas, seguido por resina mínima incorporação para a aquisição de dados com um íon focalizado feixe microscópio eletrônico (FIB-SEM). Isso é demonstrado usando uma amostra do nervo tibial de rato e Caenorhabditis elegans.

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

Nós apresentamos um protocolo para estudar a distribuição das mitocôndria e do retículo endoplasmático em pilhas inteiras após a modificação genética usando a luz correlativa e a microscopia de elétron do volume que incluem a peroxidase 2 do ascorbato e a mancha do peroxidase do rábano, seccionamento serial de células com e sem o gene alvo na mesma seção, e imagens seriadas via microscopia eletrônica.

Mitocôndria e Reticulum endoplasmático por microscopia eletrônica de luz e volume correlativo

Aqui, apresentamos protocolos de processamento detalhados para amostras de tecidos delicados de imagem usando microscopia eletrônica de varredura (SEM). Três métodos de processamento diferentes, a saber, a secagem química do disilazana do hexametil (HMDS), a secagem simples do ar, e a secagem crítica do ponto são descritos preparando cascas de ovo rígidas, embriões em estágios adiantados do desenvolvimento, e culturas fungosas respectivamente.

Processamento de embriões, casca de ovo e cultura fúngica para microscopia eletrônica de varredura

Este protocolo descreve um método de rotina para o uso de microscopia eletrônica de varredura em bloco serial (SBF-SEM), uma poderosa técnica de imagem 3D. A aplicação bem sucedida do SBF-SEM depende de técnicas adequadas de fixação e coloração de tecidos, bem como cuidadosa consideração das configurações de imagem. Este protocolo contém considerações práticas para a totalidade deste processo.

Microscopia eletrônica de varredura de blocos de bloco serial (SBF-SEM) de amostras de tecido biológico

Introduzimos uma técnica inovadora de imagem chamada Tomografia de Interferência Óptica Multicamada (OMLIT), que permite a imagem não enviesada de todas as células em amostras cerebrais na mesoescala e pode ser integrada perfeitamente ao fluxo de trabalho de imagem da microscopia eletrônica serial de varredura baseada em fita na mesma amostra.

Um Método de Imagem Óptica Compatível com Microscopia Eletrônica de Varredura para Mapeamento Cerebral Mesoscópico de Todas as Células

Aprenda a preparar amostras cerebrais de camundongo para microscopia de varredura de ponta de faca (KESM), incluindo fixação, coloração e incorporação. Este método permite visualizar redes neuronais e vasculares em resolução submicrométrica para estudos de conectômica.

Preparação de amostras, Imaging, and Analysis Protocolos para Faca de ponta microscopia de varredura

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