Indução e Monitoramento de hipersensibilidade tardia-Type Adoptive em Ratos

Sou Christine Beaton. Sou pesquisadora assistente no laboratório de George Chen, do Departamento de Fisiologia e Biofísica da Universidade da Califórnia em Irvine. E, nos próximos dias, vou mostrar a vocês o procedimento para induzir e medir a DTH adaptativa em ratos Louis.

Portanto, este procedimento leva cinco dias e o que vou mostrar a você é como ativar linfócitos T específicos por antígeno, como então, dois dias depois, injetá-los inicialmente em ratos ingênuos. Depois de mais dois dias, desafiaremos os ratos nas orelhas com o antígeno para o qual esses linfócitos T são específicos. E, no dia seguinte, vamos medir o grau de inflamação nesses ratos.

Para obter soro para o meu cultivo de tecidos, preciso coletar o sangue. Para isso, realizo uma punção cardíaca. Coloco o indicador esquerdo sobre o plexo solar e alcanço o coração através das costelas, entre as costelas com a minha agulha, aspirando o máximo de sangue possível.

E, a partir de uma única coleta, dependendo do dia e da eficiência, podemos obter entre dois e 10 mililitros de sangue de uma determinada rata. E a razão pela qual precisamos de soro na cultura é que queremos cultivar células que são células de rato Louis em soro, ou seja, sinogênico. Assim, serão soro de rato Louis.

Em seguida, transfiro o sangue para um tubo, mas tenho o cuidado de remover a agulha da seringa para evitar hemólise, pois pretendo utilizar meu soro para a cultura de tecidos posteriormente. Agora vou remover o timo, já que o coração parou de bater e a rata está morta.

Então, primeiro pulverizo com etanol a 70% para garantir que não haja pelos flutuando e entrando no meu órgão, pois preciso dele para cultura de tecidos. E utilizo instrumentos autoclavados para realizar a dissecação. Primeiro, corto a pele.

Depois de remover a pele, corto cuidadosamente em ambos os lados da caixa torácica para garantir que não danifico o timo, que está localizado logo acima do coração. O timo pode ser visto aqui como um órgão pálido, quase branco, situado imediatamente acima do coração. Então o removo, assegurando-me de extrair todo o órgão, mas sem me preocupar muito em retirá-lo completamente limpo, pois vou limpá-lo na câmara de fluxo laminar posteriormente.

E simplesmente coloco-o em um tubo contendo PBS que suplementei com penicilina e estreptomicina. Para evitar qualquer crescimento bacteriano, agora vou preparar uma suspensão simples de células do meu citócito. E para isso, vou utilizar um filtro celular de 70 mícrons.

E vou utilizar, é claro, todo o equipamento estéril. Transfiro o timo para uma placa de Petri. E como podem ver, não está muito limpo.

O timo é o órgão esbranquiçado e há nódulos linfáticos e coágulos sanguíneos sobre ele. Portanto, vou removê-los. E vou colocar cerca de 10 mL de PBS suplementado com antibióticos no meu peneiro celular para estar pronto para receber o timo assim que for limpo.

Para limpá-lo, simplesmente removo todos os contaminantes do meu timo. Agora meu timo está quase completamente limpo, então vou pegá-lo com minha pinça e cortá-lo em pequenos pedaços com minha tesoura acima do triturador celular e colocar todos os pequenos fragmentos de timo dentro do triturador celular. E depois de terminar isso, vou usar o êmbolo de uma seringa de um mililitro, que é estéril, é claro, para preparar a suspensão simples de SU pressionando os fragmentos de timo através do triturador celular.

E as células isoladas vão passar e ficarão no meu PBS na parte externa do cell trainer. Então, agora eu pressionei minhas células através do cell trainer e você pode ver que o PBS não está mais límpido. Está cheio da minha suspensão de células isoladas, que vou transferir para um tubo de 50 ml que mantenho sobre gelo.

E vou repetir o procedimento algumas vezes, reenchendo meu filtro celular com PBS, pressionando mais com o êmbolo da minha seringa e transferindo para meu tubo, até que eu tenha entre 30 e 40 mililitros de PBS no meu tubo. E assim é como fica o filtro celular após eu terminar. Agora que coletei todas as células, vou centrifugá-las por cerca de 10 minutos a 1200 RPM.

Aqui estão as células que retirei da centrífuga e o pellet é bem grande, o que é esperado após uma única centrifugação. Agora vou me livrar do sobrenadante. O pellet, é claro, permanece no fundo do tubo. Para facilitar a suspensão, vou ressuspender o pellet enquanto ainda está quase seco.

E para isso, basta bater com o dedo com bastante força até ver que o PT está completamente desagregado e voltamos a uma suspensão de células únicas. Agora vou ressuspender minhas células no meu PBS estéril e estou adicionando cinco mililitros de PBS por timer. E como tenho apenas um timer, estou adicionando apenas cinco mililitros.

E esta é a suspensão que vou levar ao irrigador para a origem. E o nível de irrigação que utilizo é de 30 graus para garantir que as células ainda estejam vivas, mas irão morrer dentro de algumas horas. Assim, elas ainda podem processar o antígeno, mas não irão contaminar o meu cultivo.

Se observarmos os linfócitos T que desejamos ativar, veremos que eles não parecem nada saudáveis. Alguns já começaram a morrer. Eles apresentam formas estranhas e já não são mais encontrados.

Assim, essas células estão prontas para serem ativadas. Na verdade, estão extremamente necessitadas de antígeno após os sítios temporais. É extremamente importante lavá-las rapidamente, porque algumas delas terão morrido e poderão liberar compostos tóxicos na solução.

Então, adiciono e completo o tubo até 50 mililitros com minha solução de PBS. Ao mesmo tempo, vou transferir os linfócitos T que estão aguardando estimulação. Vou transferi-los para outro tubo de 50 mililitros, para que eu possa centrifugar ambos os tubos simultaneamente.

Aqui está o sangue que coletei há pouco tempo, que deixei por 10 minutos a 37 graus e depois coloquei no gelo. Como podem ver, ele coagulou completamente. Portanto, preciso do soro desse sangue.

Então, para coletá-lo na primeira etapa usando uma pipeta estéril para pasta, vou soltar o coágulo do tubo e coletar todo o líquido, que conterá o soro de meu interesse. Além disso, algumas células que não foram retidas no coágulo também serão coletadas. Esse líquido será transferido para outro tubo; durante a transferência, às vezes pequenos fragmentos do coágulo acompanham o líquido, mas isso não é um grande problema, pois de qualquer forma preciso remover as células que ainda estão nesse líquido.

Então, vou centrifugar meu tubo pequeno com o líquido dentro. Isso removerá as células e qualquer fragmento de coágulo que venha junto; agora vou centrifugar a parte líquida do sangue apenas para separar as células do soro. Assim, centrifugar por dois minutos será suficiente.

Agora o soro foi centrifugado, então vou remover o soro das células. Este não é um exemplo perfeito porque o soro deveria ser amarelado e este é avermelhado, indicando que houve hemólise. Portanto, isso não é absolutamente ideal, mas mesmo assim vou mostrar como faço a filtração.

Utilizo uma seringa com filtro adaptado de 0,2 mícron e vou filtrar meu soro para garantir que esteja estéril. No entanto, como houve hemólise, não usarei este lote de soro para minha estimulação. Em vez disso, usarei soro de rato Louis que foi congelado durante um experimento anterior.

Aqui estão os tubos das células T à esquerda e das células apresentadoras de antígeno à direita. Agora vou remover o sobrenadante de ambos os tubos. E, como anteriormente, vou desfazer os pellets batendo com o dedo para garantir que as células voltem à suspensão de células simples.

E vou fazer isso com ambos os conjuntos de células, as células T e as células apresentadoras de antígeno. Depois disso, vou suspender as células e contá-las. Em seguida, vou misturar 3 milhões das células T com 150 milhões das células apresentadoras de antígeno e colocá-las em placas de Petri de 10 centímetros de diâmetro.

E em um volume total de 10 mililitros, aqui estão dois tubos de soro. À direita está o que preparei hoje e que é avermelhado devido à hemólise, enquanto que à esquerda está um tubo que preparei há alguns dias e mantive congelado. É amarelado, não apresenta hemólise e é muito melhor.

Esse é o que vou usar para o meu cultivo celular hoje. Tenho células suficientes para estimular seis placas de Petri, então vou adicionar 30 mL de meio às células apresentadoras de antígeno e 30 mL do mesmo meio aos linfócitos T. Em seguida, no tubo das células apresentadoras de antígeno, vou adicionar o antígeno, que é a albumina.

Então, meu estoque está a um miligrama por ml, e quero uma concentração final nas minhas placas de Petri de 10 microgramas por ml. E no T-cell, vou adicionar o soro de rato Louis. Vou adicionar uma quantidade suficiente para que, no final, eu tenha 1% de soro de rato nas minhas placas de Petri.

Vou homogeneizar minha suspensão de células apresentadoras de antígeno e, em seguida, vou transferir cinco mililitros dessa suspensão celular para cada uma das minhas placas de Petri. Quando retirar sua suspensão de células apresentadoras de antígeno, você notará sempre uma pequena gota de gordura e tecido fibroso. Isso é absolutamente normal.

Está presente em todo o tempo de preparação dos locais. Não há nada com que se preocupar. Portanto, eu simplesmente me livro dele, se conseguir, ou, caso contrário, apenas o deixo na placa de Petri.

Isso não afeta minha cultura celular de forma alguma. E depois de transferir todas as APCs para as minhas placas de Petri, vou repetir o procedimento com o linfócito T. Então, vou colocar cinco mililitros de suspensão de linfócitos T em cada uma dessas placas de Petri.

Agora todas as minhas células estão nas placas de Petri e é muito importante misturá-las bem para que todas as células T tenham a oportunidade de entrar em contato com uma célula apresentadora de antígeno. Para isso, empilho minhas placas de Petri e realizo a mistura fazendo oitos invisíveis com elas. Repito esse movimento várias vezes para garantir que todas as células estejam bem homogeneizadas.

E depois de fazer toda a mistura, vou colocar essas placas em um incubador, em atmosfera úmida, a 37 graus C e 5% de CO2. As placas permaneceram no incubador por 48 horas. O meio sofreu uma leve alteração de cor, agora está mais alaranjado, e as células foram bem ativadas.

Então, examino todos os discos de Petri um por um ao microscópio. As células bem grandes são os linfócitos T ativados e as bem pequenas são as células apresentadoras de antígeno mortas. E a estimulação está muito boa, porque é possível ver que os linfócitos T estão bem grandes.

E se eu mover um pouco a placa de Petri, ops, você vê no lado esquerdo aqui, agora está no centro, há um grande aglomerado de células e essas são células em divisão ativa. Então, agora vou colocar todas as células em tubos de centrífuga para poder sedimentá-las, contá-las e, em seguida, injetar 10 milhões nelas em ratos. A estimulação foi tão boa que não preciso de todas essas células T para injetar em um único rato.

Então, o que vou fazer é usar apenas células de duas placas de Petri. Vou centrifugá-las separadamente para injetar 10 milhões nelas e manter o restante das células. Vou colocá-las em cultura para congelar em alguns dias.

E o meio de cultura é o meio regular para cultura de linfócitos T ao qual se adiciona fator de crescimento de linfócitos T e soro de cavalo. Bem, os linfócitos T são não aderentes, portanto não preciso fazer muita coisa. Apenas verifico se a maioria das células acompanha o meio.

E então, no final, o que farei é enxaguar todos os potes de Petri com meio novo para garantir que removo todas as células. Dez mililitros de meio, o mesmo que usei para a estimulação, e depois penso em cada pote de Petri, mas os linfócitos T já tinham saído na primeira vez em que retirei o meio. Assim, o meio normalmente sai do pote aqui, o que não é absolutamente necessário, mas como essas células são preciosas, não quero perder nenhuma.

Então, vou centrifugá-los. Isso removerá algumas das células mortas e, principalmente, iniciarei com essas células. E quero fornecer-lhes um meio fresco.

Então, novamente vou centrifugar a 1.500 RPM por cerca de oito minutos. E ainda mantenho o freio ativado porque estou apenas pelando as células. Então, colocamos suavemente ambas as tubos, e em um deles tenho os pequenos pellets.

Isso vem dos dois recipientes de Petri. E aqui está o pellet dos quatro recipientes de Petri. Os pellets são grandes porque não contêm apenas as células T ativadas, mas também contêm as células apresentadoras de antígeno.

Agora vou esvaziar o sobrenadante e, nas células que vou injetar aqui, vou adicionar um mililitro de meio, que é o que vou usar para injetar diretamente. E as outras células vou suspender em cem mililitros de meio de cultura com fator de crescimento de linfócitos T e soro de cavalo. Essas são as células que vou injetar.

E para essas células, vou colocá-las em dois frascos plásticos de 50 ml cada. Em cada frasco, vou adicionar 10% de fator de crescimento de linfócitos T, que é o meio RPMI. Também adiciono 10% de soro de cavalo ativado pelo calor.

Então vou adicionar a maior parte do meio de que preciso. Não pipeto para cima e para baixo porque os linfócitos T não gostam de ser pipetados em excesso. Assim, pipeto apenas a quantidade mínima absolutamente necessária, que eles toleram, e simplesmente completo o volume final; então eles estão prontos.

Eles estão prontos para ir ao incubador, verifico-os todos os dias. Provavelmente precisarei dividi-los após 24 horas, senão após 40, com certeza após 48 horas. Mas verificarei todos os dias.

Eles têm a tendência de crescer muito rapidamente em fator de crescimento de células T. Portanto, precisam ser divididos pelo menos a cada 48 horas, provavelmente antes disso. Também verificarei a cor do meio de cultura.

Agora eles estão ativados, ou seja, estão totalmente ativados. Esse é o melhor momento para injetá-los no rato. E em dois dias desafiaremos o rato na orelha.

Se esperarmos pelas células, se esperarmos alguns dias para que as células voltem ao repouso, elas têm uma rápida tendência de retornar ao local da inflamação. Agora vou colocá-las no incubador a 37 graus centígrados com 5% de CO2 e vou usar uma agulha de 25 gauge para injetar a rata. Agora que as células foram injetadas, vou deixar a rata aqui e vou desafiá-la nas orelhas em 48 horas.

Há alguns dias, injetei células T específicas para albúmina marcadas com GFP em um rato. E hoje vou desafiar o mesmo rato na orelha. Assim, na orelha direita, vou injetar albúmina.

E no ouvido esquerdo, vou apenas injetar um pouco de PBS. A dose de volin que estou injetando é de 20 microgramas em 20 microlitros. E a albumina que estou usando é uma mistura, na proporção de um para um, de albumina marcada com Texas red e albumina não marcada.

Então, esta é a mesa sobre a qual vou mostrar como farei a injeção. Tenho a mão esquerda livre, pois sou destro. Com a mão esquerda, retirei a luva para poder colocar um dedo abaixo da orelha e o outro acima, esticando a pele, a fim de visualizar exatamente onde estou com a agulha e introduzi-la entre as duas camadas da pele no espaço aéreo, que é muito fino.

Para isso, utilizo agulhas de calibre 27 para ter algo extremamente fino que possa ser inserido ali. Então, se eu virar, é possível ver claramente onde foi aplicado o Texas red e onde foi aplicado o PBS. Estamos agora 42 horas após o desafio no ano, e vou usar um micrômetro com mola para medir a espessura da orelha.

Então, vou medir ambas as orelhas, a orelha direita que foi desafiada com a albumina e a orelha esquerda que não foi desafiada. E a diferença na espessura das orelhas nos dará uma ideia da intensidade da inflamação. O que mostrei aqui é todo o procedimento para realizar uma DTH adaptativa em ratos.

Então, mostrei como ativar células T específicas por antígeno in vitro, como transferi-las adotivamente para dentro de ratos e, em seguida, como desafiar esses ratos e medir o grau de inflamação. No laboratório Chand, utilizamos rotineiramente este procedimento para testar o efeito de bloqueadores de canais de potássio na inflamação em ratos.