Name: Indução e Monitoramento de hipersensibilidade tardia-Type Adoptive em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 6 s
Description: Aprenda a induzir hipersensibilidade tardia do tipo adotivo em ratos Lewis, ativando células T de memória efetora específicas de antígeno e monitorando a resposta inflamatória nas orelhas. Este método permite estudar respostas imunes mediadas por células T em modelo animal.

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Agradecemos ao Dr. Alexander Flugel (Martinsried, Alemanha) para fornecer-nos com a GFP-rotulados, linha de células T específicas ovalbumina utilizado neste protocolo.

1. Estimulação dos linfócitos T específicos ovalbumina Descansando células ovalbumina específico T são estimuladas com ovalbumina na presença de ratos irradiados timócitos Lewis (30 Gy) como células apresentadoras de antígenos (APCs), no Médio Estimulação (Prepare em DMEM + Pen / Strep / L-Glut + + NEAA RPMI Vitaminas + + 2ME Rat Serum + ovalbumina, nas concentrações finais observou na lista de materiais.) Preparação do soro de ratos <ol><li> Tomamos soro dos ratos nos sacrificamos como doadores timo. </li><li> Os ratos são profundamente anestesiado por inalação de halotano e tanto sangue quanto possível é desenhada por perfusão cardíaca (50-10 ml por rato), utilizando 10 seringas ml e 23 G 1 &quot;agulhas, após o que os ratos são imediatamente decapitado para garantir a morte. </li><li> O sangue é permitida a coagular por 10 min a 37 ° C seguido por 10 min no gelo. </li><li> O coágulo é removido eo líquido restante fiadas. </li><li> O soro é coletado, filtrado estéril e armazenado a -20 ° C. </li></ol> Preparação das células apresentadoras de antígenos <ol><li> Leve o timo de um rato decapitado utilizando instrumentos estéreis e colocá-lo em PBS contendo penicilina e estreptomicina (PBS-PS), sobre o gelo. </li><li> Leve o timo de um capuz de cultura de tecidos, limpe-o de coágulos sanguíneos e tecido contaminar outras e corte-o em pequenos pedaços em uma peneira de células (Fisher # 08-771-2) colocado em um prato de 10 centímetros de petri contendo 10 ml de PBS- PS. </li><li> Cada peça é pressionado através do filtro de células usando as costas de um êmbolo da seringa estéril 1 ml. Recolher a suspensão única célula em um tubo de 50 ml no gelo. </li><li> Lavar o filtro de células com 20-40 ml de PBS mais-PS. Centrifugar a suspensão de 1250g e ressuspender o sedimento em PBS-PS, 5 ml / timo, sobre o gelo. </li><li> Irradiar esta suspensão (30 Gy) em um irradiador gama e lave-o duas vezes com 50 ml de PBS-PS. Nota: O melhor doadores timo são ratos adultos jovens, 5-7 semanas de idade. Ratos até 10 semanas pode ser usado, mas o número de células diminui com o tempo. Sexo não é importante, embora algumas pessoas dizem que os homens são melhores doadores timo. Nós sempre usamos fêmeas porque todos os nossos animais são alojados no mesmo quarto e nós não queremos homens e mulheres na mesma sala. </li></ol> Estimulação <ol><li> Lavar os linfócitos T uma vez e contá-las. </li><li> Contar as células apresentadoras de antígenos. </li><li> Mix 3 x 10 6 ovalbumina específicas de células T com 150 x 10 6 APCs em um prato de 10 centímetros de petri contendo 10 ml de meio de estimulação. </li><li> Incubar por 48 horas a 37 ° C. </li></ol> 2. Transferência adotiva dos linfócitos T específicos ovalbumina <ol><li> Os ratos que usamos como destinatários são do sexo feminino 70-10 semanas de idade. </li><li> Contar os linfócitos T, elas devem ser grandes e redondos. As células apresentadoras de antígenos será morto. </li><li> Centrifugar os linfócitos T e ressuspenda-los em 10 x 10 6 células / ml em PBS. </li><li> Injectar 1 ml por via intraperitoneal com 3 seringas ml e 23 G 1 &quot;agulhas. </li></ol> 3. Desafio com antígeno no ouvido <ol><li> Dois dias após a transferência adotiva, injetar 20 l de 1 mg / ml solução ovalbumina (= antígeno relevante) por um ouvido e salinas (ou antígeno irrelevante) na outra orelha. Não filtrar a solução antígeno como você pode perder agregados que aumentam a reação inflamatória. Nota: Os ratos devem ser anestesiados para evitar movimentos. Se você é destro, segure a orelha entre o polegar eo dedo indicador esquerdo, o dedo indicador estar dentro da orelha e do rato voltado para você. </li><li> Injetar a solução no pavilhão da orelha usando 27G ½ &quot;agulhas. Tente injetar todos os ratos exatamente no mesmo lugar. </li></ol> 4. Medição de DTH <ol><li> O ouvido começa a ficar vermelha e inchar como um sinal de inflamação. Medir a espessura de cada orelha com um micrômetro de mola (por exemplo modelo PK-0505 da Mitutoyo). </li><li> Tome 5-6 medições para cada orelha em cada ponto do tempo e calcular a média. </li><li> O inchaço máxima deve ocorrer entre 24 e 72 horas. </li></ol>

<ol><li>Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blocking+of+voltage-gated+K%2B+channels+treats+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+inhibits+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation.</a> J. Immunol. , 166-936 (2001).</li>
<li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+monitoring+of+active+delayed+type+hypersensitivity+%28DTH%29in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats.</a> J Vis Exp. (5), (2007).</li>
</ol>

O desafio antigênico também pode ser realizada em outros locais, por exemplo, na pele do dorso (2). Nós, no entanto descobrir que um desafio. Usando o pavilhão da orelha, como mostra este vídeo, permite a medição mais precisa da reação DTH.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12430-062</td><td>500ml</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>1 mM final, no Meio de Estimulação</td></tr><tr><td>Penicilina &amp;#8211; Estreptomicina &amp;#8211; L-Glutamina</td><td>Cambrex/BioWhittaker</td><td>17-718R</td><td>100 u/ml - 100 &amp;#x03BC;g/ml - 4 mM respectivamente, final, no Meio de Estimulação</td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td>NEAA, 1% final, no Meio de Estimulação</td></tr><tr><td>Vitaminas RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7256</td><td>1% final, no Meio de Estimulação</td></tr><tr><td>beta-mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>2ME, 50 &amp;#x03BC;M final, no Meio de Estimulação</td></tr><tr><td>Soro de rato síngeo</td><td></td><td></td><td>1% final. Veja explicação no Protocolo.</td></tr><tr><td>Ovalbumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503</td><td>10 &amp;#x03BC;g/ml final, no Meio de Estimulação.</td></tr></tbody></table>

indução e monitoramento de hipersensibilidade tardia-type adoptive em ratos

Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats

De hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é uma reação inflamatória mediada por linfócitos efetores CCR7-T de memória que infiltram o local da injeção de um antígeno contra o qual o sistema imunológico tem sido preparado. A reação inflamatória é caracterizada por vermelhidão e inchaço do local de desafio antigênico. É um modelo conveniente para determinar a eficácia in vivo de imunossupressores. DTH cutânea pode ser induzida ou por transferência adotiva de linfócitos T antígeno-específicos ou por imunização ativa com um antígeno e subseqüente desafio intradérmico com o antígeno para induzir a reação inflamatória da pele em uma área determinada. Respostas DTH pode ser induzida a vários antígenos, para a ovalbumina exemplo, a tuberculina, toxóide tetânico, ou hemocianina limpet buraco da fechadura. Tais reações também pode ser induzida contra autoantígeno, por exemplo, para proteína básica da mielina (MBP) em ratos com encefalomielite auto-imune experimental induzida com MBP, um modelo animal para a esclerose múltipla (1). Aqui demonstramos como para induzir uma reação adotivos DTH em ratos Lewis. Vamos primeiro estimulam as células T específicas ovalbumina in vitro e injetar essas células ativadas por via intraperitoneal em ratos ingênuos. Depois de permitir que as células para equilibrar in vivo por 2 dias, vamos desafiar os ratos com ovalbumina no pavilhão auricular de uma orelha, enquanto a outra orelha wil receber solução salina. A reação inflamatória será visível 3-72 horas depois e espessura de ouvido será medido como uma indicação da gravidade da DTH.

De hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é uma reação inflamatória mediada por CCR7-efetoras de memória T (TEM) linfócitos. Aqui demonstramos como ativar células antígeno-específicas TEM, induzir DTH adotivos em ratos Lewis e monitorar a resposta inflamatória.

Indução e Monitoramento de hipersensibilidade tardia-Type Adoptive em Ratos

A hipersensibilidade do tipo tardio (HT) é uma reação inflamatória mediada por linfócitos T de memória efetores CCR7+ que infiltram o local de injeção de...

Sou Christine Beaton. Sou pesquisadora assistente no laboratório de George Chen, do Departamento de Fisiologia e Biofísica da Universidade da Califórnia em Irvine. E, nos próximos dias, vou mostrar a vocês o procedimento para induzir e medir a DTH adaptativa em ratos Louis.Portanto, este procedimento leva cinco dias e o que vou mostrar a você é como ativar linfócitos T específicos por antígeno, como então, dois dias depois, injetá-los inicialmente em ratos ingênuos. Depois de mais dois dias, desafiaremos os ratos nas orelhas com o antígeno para o qual esses linfócitos T são específicos. E, no dia seguinte, vamos medir o grau de inflamação nesses ratos.Para obter soro para o meu cultivo de tecidos, preciso coletar o sangue. Para isso, realizo uma punção cardíaca. Coloco o indicador esquerdo sobre o plexo solar e alcanço o coração através das costelas, entre as costelas com a minha agulha, aspirando o máximo de sangue possível.E, a partir de uma única coleta, dependendo do dia e da eficiência, podemos obter entre dois e 10 mililitros de sangue de uma determinada rata. E a razão pela qual precisamos de soro na cultura é que queremos cultivar células que são células de rato Louis em so

induction-monitoring-adoptive-delayed-type-hypersensitivity

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra o placar de indução e clínicos de um modelo animal de esclerose múltipla: doenças crônico-recidivante encefalomielite autoimune experimental em ratos DA. A doença, induzida pela imunização ratos com uma emulsão contendo medula espinhal de ratos inteiros e adjuvante de Freund completo, apresenta sinais clínicos semelhantes à doença humana.

Indução e pontuação clínica de doenças crônico-recidivante encefalomielite autoimune experimental

De hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é uma reação inflamatória mediada por CCR7 efetuador linfócitos T de memória. Aqui demonstramos como induzir DTH ativa em ratos Lewis e monitorar a resposta inflamatória.

Indução e Monitoramento de hipersensibilidade do tipo retardada Ativa (DTH) em ratos

Aqui demonstramos um método para induzir e gravar o progresso de um atraso de hipersensibilidade do tipo-reação (DTH) na orelha de ratos. Isso é seguido por uma demonstração da preparação do tecido da orelha de rato para geração de imagens de dois fótons da resposta das células de memória / T efectoras.

As células de memória efetoras T imagem no ouvido após a indução de DTH Adoptive

Este vídeo mostra como induzir hipofisite auto-imunes em camundongos SJL e como avaliar sua gravidade pela histopatologia.

Indução de hipofisite Auto-Imune Experimental em Ratos SJL

Descreve-se um ensaio de diagnóstico potencialmente valiosa, que pode ser utilizada para decidir a retirada da imunossupressão após transplante sem risco elevado de rejeição do enxerto. O ensaio utiliza os princípios do tipo hipersensibilidade cutânea tardia e fornece uma avaliação precisa do dador respostas imunes efetoras e reguladoras específicas montadas pelos destinatários.

Trans-vivo Atraso Tipo Ensaio Hipersensibilidade para o Antigen Regulamento Específico

Descrevemos aqui métodos para tratamento neonatal capsaicina induzir a dermatite atópica em ratos e exposição de formaldeído vaporizado para investigar os efeitos da inalação do formol na dermatite atópica.

Efeitos da exposição de formol para um modelo do rato da dermatite atópica, induzido pela capsaicina Neonatal tratamento

Este protocolo usa peptídeos mistos G6PI para construir modelos de artrite reumatoide que estão mais próximos do da artrite reumatoide humana em células CD4+ T e citocinas. Células T assassinas naturais invariantes de alta pureza (principalmente iNKT2) com fenótipos e funções específicas foram obtidas por indução in vivo e purificação in vitro para imunoterapia adotiva.

Imunoterapia adotiva de células iNKT em Isomerase Isomerase Induzida de Glicose-6-Fosfato (G6PI)-Induzido RaMice

A hipersensibilidade de contato (CHS) é um modelo experimental de murina de dermatite de contato alérgico (ACD). O CHS baseia-se na sensibilização com hapten reativo pintando a pele raspada do peito e abdômen, com um subsequente desafio da pele do ouvido com um hapten diluído, causando uma reação de inchaço que é avaliada de várias maneiras.

Entrar em contato com a Hipersensibilidade como modelo murino de dermatite de contato alérgico

Aqui, apresentamos um protocolo conciso para a criação de um modelo de rato prematuro, facilitando a pesquisa sobre o manejo precoce da dor pós-parto. O método envolve a realização de uma cesariana três dias antes do nascimento esperado, a extração de filhotes de ratos prematuros por meio de histerectomia e a integração deles com a prole biológica de uma mãe de aluguel.

Um modelo de rato prematuro para estudos da dor

Este protocolo descreve uma técnica de imunofluorescência multicolor para avaliação do modelo de rinite alérgica em ratos.

Marcação por Imunofluorescência em Cortes de Tecido da Mucosa Nasal de Ratos com Rinite Alérgica via Imunoensaio Multicolorido

O estudo demonstra o papel da pele na modulação das respostas imunes em camundongos por meio da imunização epicutânea (EC). A imunização contra CE com um antígeno proteico pode suprimir as respostas imunes na hipersensibilidade de contato ou reverter a supressão induzida pela pele quando combinada com padrões moleculares associados a patógenos. A imunização contra a CE mostra-se promissora como uma abordagem eficaz e sem agulha para a imunoterapia.

Modelo Murino de Imunomodulação Induzida por Epicutâneo

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