Name: Vídeo taxa de microscopia de varredura confocal e Microendoscopy (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Aprenda a construir um microscópio confocal de varredura em taxa de vídeo usando componentes padrão de prateleira. Este sistema de baixo custo permite imagem em tempo real com geometrias flexíveis para neurociência e biologia.

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Os autores gostariam de agradecer pelo seu apoio ThorLabs deste projeto. AJN gostaria de agradecer o apoio de uma Pós-Graduação NSF Fellowship. Este trabalho foi parcialmente financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde através do Programa Novo Diretor do NIH Innovator Award, conceder número 1 DP2 OD007096-01. Informações sobre o Programa New Innovator Award está em <a href="http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/">http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/</a> . Os autores gostariam de agradecer a Tom Hayes para a utilização do laboratório de Eletrônica Harvard.

<ol><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. , Springer Verlag. 985-985 (2006).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 444-456 (2001).</li>
<li>Klonis, N., Rug, M., Harper, I., Wickham, M., Cowman, A., Tilley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+photobleaching+analysis+for+the+study+of+cellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescence photobleaching analysis for the study of cellular dynamics.</a> European Biophysics Journal. 31, 36-51 (2002).</li>
<li>Stephens, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+Microscopy+Techniques+for+Live+Cell+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Light Microscopy Techniques for Live Cell Imaging.</a> Science. 300, 82-86 (2003).</li>
<li>McMahon, A., Supatto, W., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Analyses+of+Drosophila+Gastrulation+Provide+Insights+into+Collective+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic Analyses of Drosophila Gastrulation Provide Insights into Collective Cell Migration.</a> Science. 322, 1546-1550 (2008).</li>
<li>Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dishevelled+controls+cell+polarity+during+Xenopus+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dishevelled controls cell polarity during Xenopus gastrulation.</a> Nature. 405, 81-85 (2000).</li>
<li>Laemmel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibered+Confocal+Fluorescence+Microscopy+%28Cell-viZio%29+Facilitates+Extended+Imaging+in+the+Field+of+Microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Fibered Confocal Fluorescence Microscopy (Cell-viZio) Facilitates Extended Imaging in the Field of Microcirculation.</a> Journal of Vascular Research. 41, 400-411 (2004).</li>
<li>Moussata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+confocal+laser+endomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Endoscopica%22%5BJournal%5D)">The confocal laser endomicroscopy.</a> Acta Endoscopica. 39, 448-451 (2010).</li>
<li>Dunbar, K., Canto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+endomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Confocal endomicroscopy.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24, 631-637 (2008).</li>
<li>Udovich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+optics%22%5BJournal%5D)">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Applied optics. 47, 4560-4568 (2008).</li>
</ol>

Produção deste video video-este era patrocinado pela Thorlabs, Inc.

Este sistema de imagem de vídeo-rate faz uso de um espelho ressonante galvanométricos operacional em cerca de 8 kHz. Espelhos de ressonância pode ser bastante alto quando trabalhar a plena potência, e seu tom alto pode ser incômodo ou até mesmo perigoso em tempos de exposição suficiente. Apesar de não demonstrado aqui, é recomendado para proteger o espelho ressonante galvanométricos dentro de uma caixa transparente de reduzir significativamente o volume do sistema e / ou para usar equipamentos adequados de proteção auditiva, como tampões de ouvido. O espelho de ressonância galvanométricos scans em um padrão sinusoidal. No entanto, os cartões framegrabber lido em sinal assumindo uma velocidade de varredura completamente linear em ambas as direções horizontal e vertical. Desde uma varredura senoidal desacelera nas bordas da digitalização, os artefatos de compressão de imagem pode ser observada ao longo do eixo de imagem rápido (horizontal). Uma forma de minimizar este problema é propositadamente conduzir o ressonante Galvo faixa de varredura espelho significativamente maior do que odiâmetro da lente relay. Ao fazer isso, apenas varrer o quase linear central do padrão de leitura sinusoidal irá percorrer a amostra, minimizando distorções de imagem. Outra abordagem seria de pós-processamento de imagens coletadas para linearizar o eixo rápido. Isso pode ser feito por imagem um padrão conhecido fluorescentes (como uma grade) e usando as dimensões padrão conhecido para criar um script de processamento que unwarps as imagens coletadas. Este sistema de digitalização especial foi projetado com a finalidade de imagem in vivo, que muitas vezes exige uma posição vertical orientada microscópio de vídeo-rate. Para experimentos com imagens de celular, microscópios invertidos são mais tipicamente usado. O projeto aqui apresentado pode ser facilmente alterada para construir tal um microscópio invertido, tudo que é necessário é uma rotação da final espelho de diâmetro 2 &quot;. Em vez de orientar o espelho para direcionar o feixe de varredura para baixo, o espelho pode direcionar o feixe para cima. Colocar a lente objetiva umat a mesma distância do espelho, juntamente com um estágio de amostra permitiria imagem em uma geometria invertida. Se o sistema de imagem está sendo construída unicamente para imagens microendoscópica, não há razão para &quot;dobrar&quot; o projeto microscópio verticalmente em tudo. Em vez disso, o sistema de digitalização inteira pode ser construída sobre uma placa de montagem horizontal único com o paralelo lente objetiva orientada para a mesa óptica. Note-se que o microscópio nesta compilação usa uma configuração fixa pinhole, enquanto este prevê a maior simplicidade e facilidade de construir o alinhamento, os usuários que desejam um sistema mais versátil pode considerar a incorporação de uma pinhole variável, como pode ser encontrado na maioria dos comerciais microscópios confocal. Ao permitir que o usuário ajuste o tamanho da pinhole para compensar as amostras de diferentes intensidade de emissão, isto permite que o usuário para melhor otimizar o equilíbrio entre a força do sinal ea resolução de uma dada amostra. O choice de fibra de imagem selecionada para o microscópio é importante. Recomendamos o uso de fibras imagem Sumitomo coerente devido ao seu afastamento do núcleo de fibra perto e autofluorescência relativamente baixo. Fibras de imagem fabricado pela Fujikura foram encontrados para ter grandes quantidades de autofluorescência 10, que pode sobrecarregar fracos sinais de fluorescência de uma amostra e limitar a sensibilidade final do microendoscope. Sumitomo fibras fabricadas, como o 8-30N utilizado nesta configuração particular, têm muito mais baixos níveis de autofluorescência do que seus equivalentes Fujikura. Enquanto feixes de fibras leeched pode ser considerado atraente para microendoscopy, o seu design tipicamente lugares núcleos de fibra individuais muito longe, o que significa que os núcleos de fibra objetos pouco de amostra, deixando de fora as regiões significativas de interesse potencial. Finalmente, deve-se notar que, enquanto o microscópio descrito aqui será útil em uma variedade de in vitro e in vivo applications e pode ser criado por uma fração do custo de um sistema full-featured comercial, ele não tem recursos como detecção de luz transmitida, uma ocular para a visão, ou um caminho do feixe para não-confocal campo amplo de epifluorescência. Embora seja possível construir um sistema com estas características a partir do zero, os leitores que desejam um sistema deste tipo pode desejar modificar um sistema comercial existente para atender suas necessidades ao invés de dar início a uma inteiramente nova construção.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome da parte </td><td> Fabricante </td><td> Número do Item </td><td> Especificações </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> 515 nm filtro passa-banda </td><td> Chroma </td><td> HQ515/50M </td><td> 46 FWHM </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Acromática Doublet Lens Dia 25,4 milímetros. FL x 50mm, revestimento MgF2 </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-766 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Acromática Doublet Lens Dia 25,4 milímetros. FL x 76,2 mm, revestimento MgF2 </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-768 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Acromática Doublet Lens Dia 25,4 milímetros. x 88,9 milímetros FL, Revestimento MgF2 </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-769 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> Dia Lente acromática Doublet 50mm. FL x 300mm, revestimento MgF2 </td><td> Edmund Optics </td><td> NT45-179 </td&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8 kHz R Scanner óptico de alta freqüência </td><td> Electro-Optical Products Corporation (EOPC) </td><td> SC-30 </td><td> 8 kHz </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Driver de AGC </td><td> Electro-Optical Products Corporation (EOPC) </td><td> ACG: 8K </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H7422-PA Módulo Fotosensor </td><td> Hamamatsu </td><td> H7422-PA </td><td> Limitação de corrente recomendada </td><td> 1 </td></tr><tr><td> M9012 Alimentação </td><td> Hamamatsu </td><td> M9012 </td><td> Para uso com H7422-PA </td><td> 1 </td></tr><tr><td> HC PL APO CS Objetivo </td><td> Leica </td><td> 11506284 </td><td> 10x/0.40 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Solios Cartão Framegrabber eA / XA </td><td> Matrox </td><td> Solios eA / XA </td><td> MIL software necessário; OEM interliga recomendado </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Fonte de alimentação 12V </td><td&gt; Meanwell </td><td> LPV-100-12 </td><td> +12 V, 8.5A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Lente objetiva de 5x Microscópio </td><td> Newport </td><td> M-5X </td><td> 0,10 NA, Comprimento 25,4 milímetros Focal </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Fibra imagem coerente </td><td> Sumitomo </td><td> 8-30N </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 / 4 &quot;Parafuso -20 e Kit Hardware </td><td> ThorLabs </td><td> HW-KIT2 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 100 mm Montado Pinhole </td><td> ThorLabs </td><td> P100S </td><td> Ideal para a construção de filtros espaciais </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30 milímetros Grampo Cube Gaiola </td><td> ThorLabs </td><td> B6C </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30 milímetros Cube Sistema Cage, 4-Way </td><td> ThorLabs </td><td> C4W </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 406 nm, 5 mW, B Pin Code, fibra SM Diode Laser Pigtailed, FC / PC </td><td> ThorLabs </td><td> LPS-406-FC </td><td> Produtos obsoletos; substituído por LP405-SF10 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5 Minute-Epoxy, uma onça </td><td> ThorLabs </td><td> G14250 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 6 Axis cinemática Optic Monte </td><td> ThorLabs </td><td> K6X </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8-32 Parafuso e Kit Hardware </td><td> ThorLabs </td><td> HW-KIT1 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Parafuso de fixação 8-32 e Kit Hardware </td><td> ThorLabs </td><td> HW-KIT3 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Adaptador com Rosca externa RMS e roscas internas SM1 </td><td> ThorLabs </td><td> SM1A4 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Adj. FC / PC e FC / APC Collimator, f = 2,0 mm, ARC: 400-600 nm </td><td> ThorLabs </td><td> CFC-A-2X </td><td> f = 2,0 milímetros </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Adaptador Colimador ajustável Fibra, SM1 Threaded </td><td> ThorLabs </td><td> AD9.5F </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Breadboard de alumínio, 12 &quot;x 18&quot; x 1 / 2 &quot; </td><td> ThorLabs </td><td> MB1218 </td><td> 1 / 4 &quot;-20 Threaded </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Diode Laser de bancada / TEC Controlador </td><td> ThorLabs </td><td> ITC4001 </td><td> 1 A/96 W </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DMLP 425 nm Espelho longa-Pass Dichroic </td><td> ThorLabs </td><td> DMLP425 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Monte cinemática para Ø1 &quot;Optics </td><td> ThorLabs </td><td> KM100 </td><td></td><td> 3 </td></tr><tr><td> LD / TEC montagem para Diodos ThorLabs Fiber-Pigtailed Laser </td><td> ThorLabs </td><td> LM9LP </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Montagem de Lente de Ø18 MM Optics </td><td> ThorLabs </td><td> LMR18 </td><td> Um anel de retenção incluído </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Montagem da lente para 2 &quot;Optics </td><td> ThorLabs </td><td> LMR2S </td><td> Com internos e externos threading; anel de fixação incluída </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Mini Series Gaiola Assembléia Rod, 6 &quot;mm, Long Ø4, Quantidade 1. </td><td> ThorLabs </td><td> SR6 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1.0 &quot;Post Pillar Pedestal, 8-32 Taps, um&quot; Long </td><td> ThorLabs </td><td> RS1P8E </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Pilar Mensagem Extensão Comprimento, = 0,5 </td><td> ThorLabs </td><td> RS05 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Pilar Mensagem Extensão Comprimento, = 0,75&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> RS075 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Protected Prata Espelho, 3,2 mm de espessura </td><td> ThorLabs </td><td> ME1-P01 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;SM1 rotação do elemento ajustável foco, L = 1&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> SM1V10 </td&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ø2 &quot;Protected Prata Espelho, 3,2 mm de espessura </td><td> ThorLabs </td><td> ME2-P01 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> P100S - Ø100 mM Mounted Pinhole </td><td> ThorLabs </td><td> P100S </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Polaris Deriva Low Ø1 &quot;cinemática Espelho Monte </td><td> ThorLabs </td><td> POLARIS-K1 </td><td> Drift baixo </td><td> 1 </td></tr><tr><td> SM1 Lens Tube, L = 1 &quot; </td><td> ThorLabs </td><td> SM1L-10 </td><td> Um anel de retenção incluído </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SM1 Threaded 30 Placa Gaiola mm, 0,35 &quot;Thick </td><td> ThorLabs </td><td> CP02 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> SM1 a M25 Adaptador Componente Óptico de Threading </td><td> ThorLabs </td><td> SM1A24 </td><td> Externa e interna Threads SM1 M25.5x0.5 Tópicos </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Diam Boca pequenaeter Galvo Sistema </td><td> ThorLabs </td><td> GVSM001 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Fork aperto pequena </td><td> ThorLabs </td><td> CF125 </td><td> 25/01 &quot;escareados slot, universal </td><td> 15 </td></tr><tr><td> Sistema de filtro espacial </td><td> ThorLabs </td><td> KT310 </td><td> Pinhole vendido separadamente </td><td> 1 </td></tr><tr><td> TE-Cooled montagem para 5,6 e 9 milímetros Lasers </td><td> ThorLabs </td><td> TCLDM9 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Suporte Vertical para Breadboards </td><td> ThorLabs </td><td> VB01 </td><td> Cada </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano Apochromat- </td><td> Zeiss </td><td> 1101-957 </td><td> 20x/0.75 NA </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>

vídeo taxa de microscopia de varredura confocal e microendoscopy

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Microscopia confocal tem se tornado uma ferramenta valiosa na biologia e nas ciências biomédicas, permitindo rápido, de alta sensibilidade e alta resolução de seccionamento óptico de sistemas complexos. Microscopia confocal é rotineiramente usado, por exemplo, para estudar alvos celulares específicos 1, monitor dinâmica em células vivas 2-4, e visualizar a evolução tridimensional de organismos inteiros 5,6. Extensões de sistemas de imagem confocal, como microendoscopes confocal, permitem alta resolução de imagem in vivo 7 e estão actualmente a ser aplicado a imagem da doença e diagnóstico em clínicas 8,9. Microscopia confocal tridimensional fornece resolução criando os chamados &quot;seções óptica&quot; utilizando óptica geométrica simples. Em um microscópio de campo amplo padrão, de fluorescência gerada a partir de uma amostra é coletada por uma lente objetiva e retransmitidas diretamente para um detector. Enquanto aceitarcapaz de amostras de imagem fina, as amostras de espessura embaçada por fluorescência gerada acima e abaixo do plano objetivo focal. Em contraste, microscopia confocal permite corte, virtual óptico de amostras, rejeitando out-of-foco de luz para construir de alta resolução representações tridimensionais de amostras. Microscópios confocal a conseguir este feito através de uma abertura confocal no caminho do feixe de detecção. A fluorescência de uma amostra coletada pelo objectivo é retransmitida de volta através dos espelhos de varredura e através do espelho primário dicróicas, um espelho para refletir cuidadosamente selecionados comprimentos de onda mais curtos, como o feixe de laser de excitação durante a passagem do tempo, Stokes-shifted emissão de fluorescência. Este sinal de longo comprimento de onda de fluorescência é então passado para um par de lentes de ambos os lados de um diafragma que é posicionado em um avião exatamente conjugado com o plano focal da lente objetiva. Fótons coletados a partir do volume focal do objeto são colimadospela lente objetiva e estão focados pelas lentes confocal através do pinhole. Fluorescência gerado acima ou abaixo do plano focal, portanto, não ser colimada corretamente, e não vai passar pelo pinhole confocal 1, a criação de uma secção óptica na qual apenas a luz do foco do microscópio é visível. (Fig. 1). Assim, o pinhole age efetivamente como uma abertura virtual no plano focal, restringindo a emissão detectada apenas uma localização espacial limitada. Comercial moderno microscópios confocal oferecer aos usuários uma operação totalmente automatizada, fazendo procedimentos de imagem anteriormente complexo relativamente simples e acessível. Apesar da flexibilidade e potência desses sistemas, comercial microscópios confocal não são adequados para todas as tarefas de imagem confocal, como muitos em aplicações de imagem in vivo. Sem a capacidade de criar sistemas de imagem personalizada para atender suas necessidades, experiências importantes podem ficar fora da reaçãoh para muitos cientistas. Neste artigo, nós fornecemos um método passo-a-passo para a construção completa de um costume, sistema de imagem de vídeo de taxa de confocal a partir de componentes básicos. O microscópio vertical será construído utilizando um espelho ressonante galvanométricos para fornecer o eixo de varredura rápida, enquanto um padrão de velocidade de espelho ressonante galvanométricos irá verificar o eixo lento. Para criar um feixe preciso digitalizados no foco da lente objetiva, esses espelhos serão posicionados nos planos chamados telecêntrica usando quatro lentes relay. Detecção confocal será realizada usando um padrão, tubo fotomultiplicador off-the-shelf (PMT), e as imagens serão capturadas e exibidas usando um cartão de framegrabber Matrox eo software incluído.

A construção completa de um costume, sistema de imagens em tempo real confocal de varredura é descrito. Este sistema, que pode ser facilmente utilizado para vídeo-microscopia e taxa de microendoscopy, permite uma variedade de geometrias de imagem e aplicações que não sejam acessíveis usando o padrão comercial sistemas confocal, em uma fração do custo.

Vídeo taxa de microscopia de varredura confocal e Microendoscopy

A microscopia confocal tornou-se uma ferramenta inestimável na biologia e nas ciências biomédicas, permitindo a obtenção de imagens ópticas rápidas, de alta sensibilidade e de alta resolução...

Este vídeo demonstra como construir um microscópio confocal de varredura em taxa de vídeo utilizando componentes padrão disponíveis no mercado. Um microscópio confocal de varredura depende do movimento coordenado de dois espelhos de varredura para deslocar o feixe ao longo do plano raster; a luz proveniente do primeiro espelho é varrida horizontalmente através do primeiro conjunto de lentes de retransmissão, que a focaliza novamente em um ponto fixo sobre o segundo espelho de varredura. Esse mesmo movimento de varredura é então transferido através das lentes de varredura e tubo, posicionando o feixe de luz agora ampliado na abertura traseira da lente objetiva.O segundo espelho, cujo movimento é lento em comparação com o primeiro espelho, escaneia simultaneamente o eixo Y, permitindo a ação de varredura acima e abaixo do plano ilustrado e criando um raster retangular na superfície da amostra. A principal vantagem deste protocolo em relação à compra de um microscópio comercialmente disponível é o baixo custo e a possibilidade de personalizar o instrumento de acordo com as necessidades específicas de um projeto de imagem. Ao trabalhar com qualquer laser, é essencial adotar medidas de segurança apropriadas para prevenir lesões oculares.Certifique-se de usar óculos de segurança apropriados para laser sempre que possível. Espectadores e/ou pesquisadores que não estejam ativamente alinhando ou trabalhando com o feixe devem sempre usar óculos. Remova todos os relógios e joias brilhantes ou reflexivos.Acima de tudo, certifique-se de seguir e controlar o feixe em todos os momentos, interrompendo seu trajeto com um bloqueador de feixe ou um cartão de visita montado. Isso é especialmente importante ao alinhar espelhos, pois o trajeto do feixe pode ser difícil de prever. Além disso, nunca posicione seus olhos ao nível do trajeto do feixe.Desligue o laser se precisar atravessar o plano do feixe antes de montar o microscópio. Certifique-se de que todo o equipamento necessário para a montagem está disponível, incluindo a mesa óptica e os suportes em ângulo reto, todos os espelhos, lentes e o dicróico, juntamente com os grampos e os acessórios de fixação apropriados, ambos os espelhos de varredura e o detector fotônico. Também é útil ter um gerador de funções à mão para testar a ação de varredura e manipular os espelhos durante o alinhamento.Recomenda-se também fixar a placa de montagem com parafusos para garantir estabilidade. Inicie a construção do microscópio colocando a fibra com pigtail no suporte óptico e posicionando este conjunto no centro da placa óptica. Isso corresponde à origem do feixe azul conforme mostrado aqui.Ligue a fonte de luz. Use os parafusos de ajuste para ajustar aproximadamente o feixe, de modo que ele viaje em linha reta tanto na direção horizontal quanto na vertical. Coloque uma íris diante do colimador de fibra.Em seguida, ajuste a altura da íris para que o feixe passe pelo centro. Depois, mova a íris para longe do ator ao longo do trajeto do feixe. Verifique o alinhamento do feixe.Use os dois parafusos de ajuste para reposicionar o feixe na íris, se necessário. Posicione o espelho diic montado no trajeto do feixe, com o feixe a laser centralizado no espelho. Gire o suporte do espelho para refletir o feixe em aproximadamente 90 graus, garantindo que a altura do feixe não se altere.Fixe o espelho à mesa apertando os parafusos no suporte. Em seguida, posicione o espelho galvanométrico ressonante montado no trajeto do feixe a laser. Tendo o cuidado de garantir que o feixe a laser esteja posicionado exatamente no centro horizontal da superfície do espelho.Gire o suporte do espelho para refletir o feixe do laser em um ângulo de 90 graus. Em seguida, ajuste aproximadamente a reflexão no espelho para manter a mesma altura vertical do feixe de laser. Depois, pegue duas íris e posicione-as diretamente à frente do galvanômetro ressonante.Em seguida, utilizando o feixe a laser refletido pelo espelho galvanométrico ressonante como referência, ajuste a altura vertical como antes. Agora, usando os furos de parafuso na mesa óptica como guia visual, fixe as duas íris em linha reta. Ajuste o primeiro espelho no trajeto, que é o dicróico, para centralizar o feixe na primeira íris.Em seguida, ajuste o segundo espelho no trajeto. O galvanômetro ressonante deve centralizar o feixe no segundo diafragma. Ajuste iterativamente esses dois espelhos até que o feixe esteja alinhado através de ambos os diafragmas.Certifique-se de que o feixe a laser refletido pelo espelho galvanométrico ressonante ainda seja refletido a partir do centro aproximado do espelho. Se o feixe estiver desviado, ajuste o suporte do colimador de fibra e repita os ajustes com o feixe centralizado em ambas as diafragmas abertas. O próximo passo é posicionar as duas lentes de retransmissão que irão projetar o primeiro plano telecêntrico estacionário sobre o segundo plano telecêntrico estacionário.Para este microscópio específico, as lentes selecionadas no primeiro relé possuem o mesmo comprimento focal F, portanto a distância entre os dois espelhos aqui é simplesmente quatro F. Para esta configuração, F equivale a 90 milímetros, de modo que a posição quatro F estará a 360 milímetros de distância do espelho de varredura. Para garantir que as lentes estejam exatamente centralizadas no trajeto do feixe, coloque a primeira lente no trajeto do feixe e observe o ponto do feixe a laser na próxima diafragma no trajeto do feixe. Após a lente, ajuste a altura da lente para que o centro vertical do feixe coincida com o centro da diafragma.Em seguida, ajuste a posição horizontal do feixe para centralizá-lo na íris. Repita este processo com a segunda lente. Em seguida, o espelho de varredura será configurado e o microscópio será rotacionado para facilitar a colocação e o alinhamento diretos das peças, que, de outra forma, precisariam ser ajustadas verticalmente.Para encontrar a posição exata do segundo plano telecêntrico, conecte o galvanômetro ressonante O à sua unidade de varredura e ligue-o. Use um cartão de visita para acompanhar o trajeto do feixe de varredura através das duas lentes. O segundo plano telecêntrico estará localizado aproximadamente a quatro F do galvanômetro O e pode ser identificado como o ponto onde o feixe de varredura parece estacionário.Marque a matriz de contatos abaixo desse local com um lápis. Uma vez identificado o plano telecêntrico, ajuste a entrada do espelho de varredura para zero volt e ligue o hardware de controle do espelho para que o espelho se estabilize em sua posição neutra. Em seguida, posicione o espelho galvanométrico padrão de varredura exatamente no local do plano telecêntrico.Ajuste a posição do espelho de modo que o feixe no plano tele atinja exatamente o centro do espelho de varredura e aperte o suporte do espelho. Agora, solte o parafuso de fixação que segura o espelho galvanométrico e gire-o, garantindo que o feixe esteja se propagando verticalmente. Em seguida, desligue o laser e a eletrônica de varredura.Desconecte a fibra e desconecte os espelhos de varredura. Em seguida, utilizando braçadeiras de montagem em ângulo reto, fixe a segunda placa à primeira.Por fim, gire cuidadosamente todo o microscópio para que a nova placa de montagem fique plana e use o grampo para fixar o microscópio na posição. Reconecte aqui o galvanômetro e o laser e lembre-se de retornar o galvanômetro a zero volt. O restante da antiga configuração vertical pode ser facilmente montado sobre a placa plana.A seguir, vamos montar o segundo conjunto de lentes de retransmissão, denominado formalmente lente de varredura e lente tubular. Consulte o protocolo escrito acompanhante para obter informações muito importantes sobre a escolha da combinação correta de lentes. Comece montando as lentes.Primeiro, posicione os espelhos necessários para direcionar o feixe até a lente objetiva. Coloque o primeiro espelho grande de dois polegadas próximo à borda da mesa óptica e gire o suporte do espelho para refletir o feixe do laser aproximadamente 90 graus, de forma aproximada. Ajuste a reflexão no espelho para manter a mesma altura vertical do feixe.Em seguida, posicione o outro espelho de dois polegadas na borda oposta da mesa óptica para direcionar o feixe em um ângulo de 90 graus e use os parafusos de ajuste para fixá-lo no lugar. Depois, monte duas íris e ajuste os dois espelhos como antes para centralizar o feixe. Em seguida, posicione a lente de varredura à distância focal do galvanômetro no trajeto do feixe e ajuste sua posição horizontal e vertical.Para centralizar o ponto do laser na primeira íris entre os dois espelhos. Coloque cuidadosamente a lente tubular grande de duas polegadas à distância apropriada da lente de varredura e ajuste sua posição horizontal e vertical para centralizar o feixe na primeira íris. Nesta configuração, a lente tubular é colocada a uma distância de 75 milímetros mais 300 milímetros com todos os componentes no lugar.Conecte o galvanômetro O à saída de um gerador de funções elétrico padrão ou circuito de controle e ajuste as tensões de pico a pico para um a três volts. Em seguida, inicie a varredura dos dois espelhos utilizando um cartão de visita. Localize o feixe do laser no plano estacionário, 300 milímetros após a lente tubular.Coloque a lente objetiva no trajeto do feixe, certificando-se de posicionar a abertura traseira da lente objetiva o mais próximo possível do plano estacionário. Configure o estágio da amostra, certificando-se de que o suporte do eixo Z translacional não atinja o suporte da lente objetiva ao ser deslocado ao longo de sua faixa de movimento. Para configurar o confocal, comece desconectando todas as fontes de alimentação e as fibras ópticas do diafragma e do detector.Gire o conjunto do microscópio para que ele repouse novamente na placa de montagem, segurando o espelho de varredura ressonante. Após reconectar a fibra ao colimador e ao espelho de varredura padrão, bem como aos cabos de alimentação, fonte e controle, aplique zero volt no controle de tensão que aciona o galvanômetro de varredura padrão, como antes na platina, e coloque uma amostra de um corante brilhante em sanduíche entre duas lamínulas. Em seguida, ligue a fonte a laser e coloque o corante em foco.Ajuste a potência do laser para tornar a fluorescência o mais brilhante possível usando um cartão de visita. Siga a emissão fluorescente da amostra através da lente objetiva, passando pelo sistema de varredura até o espelho dicróico, que reflete o feixe de laser e transmite a emissão fluorescente. Localize esse sinal fluorescente no outro lado do espelho dicróico.Agora, diminue a luz do ambiente. Coloque um espelho atrás do espelho dicromático para refletir a emissão em um ângulo de 90 graus. Em seguida, utilizando uma diafragma com um espelho, direcione o feixe de fluorescência o mais reto e paralelo possível à base óptica.Em seguida, a unidade de pinhole confocal será montada utilizando o conjunto de suporte de montagem com filtro espacial da Thor Labs. Este diagrama esquematiza a montagem. O espelho de varredura situa-se em planos estacionários que são telescópicos com um objetivo estacionário.Os pares de lentes no plano da abertura posterior entre os planos estacionários atuam para retransmitir os feixes escaneados. O primeiro par de lentes possui distâncias focais iguais, formando um telescópio um para um. O segundo par de lentes, conhecido formalmente como lente de escaneamento e lente tubular, não precisa ter distâncias focais iguais e muitas vezes atua como um telescópio ampliador de feixe, garantindo que a abertura posterior da objetiva seja superpreenchida.A luz emitida pela amostra viaja de volta através do sistema de varredura e passa pelo espelho dicróico. Uma lente de foco curto ou uma lente objetiva focaliza a luz de emissão através do pinhole confocal, que é então colimada por uma lente. Uma lente final focaliza a emissão filtrada pelo confocal em um tubo fotomultiplicador.Posicione a unidade de filtro espacial ao longo do trajeto do feixe de emissão, tomando cuidado para centralizar o suporte da primeira lente de foco no feixe de emissão. Neste caso, selecionou-se uma unidade de filtro espacial com um orifício de 100 micrômetros. Em seguida, monte uma lente de distância focal curta na unidade e deslize o suporte de translação em Z até que um foco nítido possa ser observado na superfície do orifício.Certifique-se de que toda a unidade esteja orientada ao longo da linha reta definida pelo feixe fluorescente. Prenda a unidade na placa de montagem. Agora, utilizando os botões de ajuste do estágio de translação, ajuste os dois eixos para realizar uma busca bidimensional sobre a superfície do suporte do orifício de agulha, a fim de encontrar o ponto em que o sinal fluorescente através do orifício é maximizado.Em seguida, coloque a lente de revestimento no suporte de gaiola. Após o pinhole, utilizando um cartão de visita, localize o íon fluorescente que passa pela unidade confocal e deslize a lente de revestimento ao longo dos suportes até que a fluorescência emitida esteja o mais colimada possível. Monte o conjunto do tubo fotomultiplicador. Coloque uma lente com distância focal de 50 milímetros no trajeto do feixe de emissão fluorescente e localize seu ponto focal.Marque esta posição na placa de circuitos. Agora desligue completamente o laser e posicione o tubo fotomultiplicador de modo que sua janela fique o mais próximo possível do ponto focal marcado. Em seguida, utilizando tubos de lentes ajustáveis, conecte o conjunto à lente de focagem.Envolva com fita escura todos os trajetos do feixe expostos após o pinhole, ligue o laser mantendo sua potência extremamente baixa. Ligue o tubo fotomultiplicador, lendo cuidadosamente sua tensão no osciloscópio. À medida que a intensidade do laser aumenta, aumente a tensão até que um sinal em forma de pico ou um deslocamento contínuo (DC offset) possa ser observado na tela do osciloscópio.Confirme que esse sinal realmente provém da fluorescência desligando a potência do laser ou bloqueando o trajeto do feixe para observar a perda do sinal. Por fim, alinhe iterativamente o diafragma para obter o sinal máximo no osciloscópio. Primeiro manipulando a posição Z da lente de foco e depois ajustando o estágio de translação YZ, o hardware do microscópio em taxa de vídeo está completo.Primeiro, desligue o tubo fotomultiplicador. Agora, conecte os espelhos, as placas de controle personalizadas e o computador conforme diagramado no protocolo escrito que acompanha. Este sistema pode ser adaptado para realizar microendoscopia confocal de varredura.Ao substituir a platina por uma platina de fixação de fibra, consulte o texto ou os detalhes acompanhantes. O microscópio confocal de varredura ereto e o microendoscópio prontos devem aparecer conforme mostrado aqui. Os feixes de laser e de emissão foram desenhados como guia para os olhos.Durante a operação de microendoscopia, um suporte para fibra mantém a fibra de imagem fixa durante os experimentos. Esse suporte para fibra pode ser facilmente substituído por uma platina XY para outras aplicações. Uma plataforma de microscópio ereto, mostrada aqui, é uma imagem representativa obtida de um M minúsculo impresso em um cartão branco, utilizando uma placa capturadora de quadros em taxa de vídeo para gerar imagens a partir do sinal recebido. Bleanchado.O papel branco contém flúor que é facilmente excitado pela luz UV e azul, resultando em um fundo brilhante atrás da região escura. A letra M e um filtro de emissão centrado em 515 nanômetros foram escolhidos para coletar essa emissão fluorescente. Uma leve distorção da imagem pode ser observada, especialmente próximo às bordas laterais do quadro da imagem.Essa distorção resulta do padrão de varredura senoidal do espelho gvo de oito quilohertz e é discutida em detalhes no documento anexo. Este vídeo mostra dados de taxa de vídeo de exemplo obtidos ao escanear um cartão de visita. Após assistir a este vídeo, você agora deverá ter uma boa compreensão de como construir e alinhar um microscópio confocal de varredura de taxa de vídeo.Não se esqueça de que trabalhar com luz laser pode ser extremamente perigoso, e precauções como remover todas as joias reflexivas, bem como evitar trabalhar com os olhos no mesmo nível do trajeto do feixe, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

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