Vídeo taxa de microscopia de varredura confocal e Microendoscopy

Este vídeo demonstra como construir um microscópio confocal de varredura de taxa de vídeo usando componentes padrão prontos para uso. Um microscópio confocal de varredura depende do movimento coordenado de dois espelhos de varredura para traduzir o feixe através do plano raster A luz do primeiro espelho é escaneada horizontalmente através do primeiro conjunto de lentes de relé, que a focaliza de volta a um ponto estacionário no segundo espelho de varredura. O mesmo movimento de varredura é então traduzido através das lentes de varredura e tubo, colocando o feixe de luz agora expandido na abertura traseira da lente objetiva.

O segundo espelho, cujo movimento é lento em comparação com o primeiro espelho, varre simultaneamente o eixo Y, permitindo a ação de varredura acima e abaixo do plano ilustrado e criando um raster retangular na superfície da amostra. A principal vantagem deste protocolo sobre a compra de um microscópio disponível comercialmente é o baixo custo e a capacidade de personalizar o instrumento de acordo com as necessidades específicas de um projeto de imagem. Ao trabalhar com qualquer laser, é vital tomar as medidas de segurança apropriadas para evitar lesões oculares.

Certifique-se de usar os óculos de segurança a laser apropriados sempre que possível. Os espectadores e/ou pesquisadores que não se alinham ou trabalham ativamente com o feixe devem sempre usar óculos. Remova todos os relógios ou joias brilhantes e reflexivos.

Mais importante ainda, certifique-se de seguir e controlar o feixe o tempo todo, terminando seu caminho usando um bloco de feixe ou cartão de visita montado. Isso é especialmente importante ao revestir espelhos, pois o caminho do feixe pode ser difícil de prever. Além disso, nunca nivele seus olhos com o caminho do feixe.

Desligue o laser se precisar cruzar o plano do feixe antes de montar o microscópio. Certifique-se de que todo o equipamento necessário para a construção esteja disponível, incluindo a placa de ensaio óptica e os suportes de 90 graus, todos os espelhos, lentes e dicróicos, juntamente com os grampos apropriados e hardware de montagem, tanto espelhos de varredura quanto o fotodetector. Também é útil ter um gerador de funções à mão para testar a ação de varredura e manipular os espelhos durante o alinhamento.

Também é altamente recomendável aparafusar a placa de ensaio para estabilidade. Comece a construção do microscópio colocando o fiber ator pigtail na montagem óptica e colocando este conjunto no meio da placa de ensaio óptica. Isso corresponde à origem do feixe azul, conforme mostrado aqui.

Ligue a fonte de luz. Use os parafusos de ajuste para ajustar aproximadamente a viga de forma que ela se desloque em linha reta horizontal e verticalmente. Coloque uma íris na frente do coletor de fibra.

Em seguida, ajuste a altura da íris para que o feixe passe pelo centro. Em seguida, afaste a íris do ator ao longo do caminho do feixe. Verifique o alinhamento da viga.

Use os dois parafusos de ajuste para reposicionar o feixe na íris, se necessário. Coloque o espelho diic montado no caminho do feixe com o feixe de laser posicionado no centro do espelho. Gire o suporte do espelho para refletir o feixe em aproximadamente 90 graus, garantindo que a altura do feixe não mude.

Prenda o espelho à mesa apertando os parafusos no suporte. Em seguida, coloque o espelho métrico galvan ressonante montado no caminho do feixe de laser. Tomando cuidado para garantir que o feixe de laser esteja posicionado no centro horizontal exato da superfície do espelho.

Gire o suporte do espelho para refletir o feixe de laser em um ângulo de 90 graus. Em seguida, ajuste aproximadamente o reflexo do espelho para manter a mesma altura vertical do feixe de laser. Em seguida, pegue duas íris e coloque-as diretamente na frente da garota ressonante.

Em seguida, usando o feixe de laser refletido no espelho ressonante como referência, defina sua altura vertical como antes. Agora, usando os orifícios dos parafusos na placa de ensaio óptica como guia para o olho, prenda as duas íris em linha reta. Ajuste o primeiro espelho no caminho, que é o dicróico para centralizar o feixe na primeira íris.

Em seguida, ajuste o segundo espelho no caminho. A garota ressonante para centralizar o feixe na segunda íris. Ajuste iterativamente esses dois espelhos até que o feixe esteja alinhado através de ambas as íris.

Garantir que o feixe de laser refletido do espelho ressonante ainda seja refletido do centro aproximado do espelho. Se o feixe estiver desviado, ajuste o suporte do colador de fibra e repita os ajustes com o feixe centralizado em ambas as íris abertas. O próximo passo é colocar as duas lentes de relé que irão criar imagens do primeiro plano telecêntrico estacionário no segundo plano telecêntrico estacionário.

Para este microscópio em particular, as lentes selecionadas no primeiro relé têm a mesma distância focal F, então a distância entre os dois espelhos aqui é simplesmente quatro F. Para esta configuração, F é igual a 90 milímetros, então a posição quatro F estará a 360 milímetros de distância do espelho de varredura. Para garantir que as lentes estejam precisamente centralizadas no caminho do feixe, coloque a primeira lente no caminho do feixe e observe o ponto do feixe de laser na próxima íris no caminho do feixe. Seguindo a lente, ajuste a altura da lente para que o centro vertical do feixe fique no centro da íris.

Em seguida, ajuste a posição horizontal do feixe para centralizar o feixe na íris. Repita esse processo com a segunda lente. Em seguida, o espelho de varredura será configurado e o microscópio será girado para facilitar a colocação e o alinhamento diretos de peças que, de outra forma, precisariam ser ajustadas verticalmente.

Para encontrar a posição exata do segundo plano telecêntrico, conecte o gal O ressonante em sua unidade de varredura e ligue-o. Use um cartão de visita para seguir o caminho do feixe de varredura através das duas lentes. O segundo plano telecêntrico estará localizado a aproximadamente quatro F do galão O residente e pode ser identificado como o local onde o feixe de varredura aparece estacionário.

Marque a placa de ensaio abaixo deste local com um lápis. Uma vez identificado o plano telecêntrico, defina a entrada do espelho de varredura para zero volts e ligue o hardware de controle do espelho para que o espelho se acomode em sua posição neutra. Em seguida, posicione o espelho de galil de varredura padrão no local exato do teleplano.

Ajuste a posição do espelho de forma que o feixe no plano tele atinja o centro exato do espelho de varredura e aperte o suporte do espelho. Agora afrouxe o parafuso de travamento que segura o espelho e gire-o, certifique-se de que o feixe esteja se propagando verticalmente. Agora desligue o laser e os componentes eletrônicos de digitalização.

Desconecte a fibra e desconecte os espelhos de digitalização. Em seguida, usando suportes de montagem de placa de ensaio de 90 graus. Prenda a segunda placa de ensaio à primeira.

Por fim, gire cuidadosamente todo o microscópio para que a nova placa de ensaio fique plana e use o grampo para prender o microscópio na posição. Reconecte o gal o e o laser aqui e lembre-se de retornar o gal O a zero volts. O restante da configuração anteriormente vertical pode ser facilmente realizado na placa de ensaio plana.

Em seguida, configuraremos o segundo conjunto de lentes de relé formalmente chamadas de lentes de varredura e lentes tubulares. Consulte o protocolo escrito que acompanha o documento para obter informações muito importantes sobre como escolher a combinação certa de lentes. Comece configurando as lentes.

Primeiro, coloque os espelhos necessários para direcionar o feixe para a lente objetiva. Coloque o primeiro espelho grande de duas polegadas perto da borda da placa de ensaio e gire o suporte do espelho para refletir o feixe de laser aproximadamente 90 graus aproximadamente. Ajuste o reflexo do espelho para manter a mesma altura do feixe vertical.

Em seguida, coloque o outro espelho de duas polegadas na borda oposta da placa de ensaio para direcionar o feixe em um ângulo de 90 graus e use os parafusos de ajuste para fixar no lugar. Em seguida, configure duas íris e ajuste os dois espelhos como antes para centralizar o feixe. Em seguida, coloque a lente de varredura em sua distância focal da gal no caminho do feixe e ajuste sua posição horizontal e vertical.

Centralizar o ponto do laser na primeira íris entre os dois espelhos. Coloque cuidadosamente a lente de tubo grande de duas polegadas na distância apropriada da lente de varredura e ajuste sua posição horizontal e vertical para centralizar o feixe na primeira íris. Nesta configuração, a lente do tubo é colocada a uma distância de 75 milímetros mais 300 milímetros com todos os componentes no lugar.

Conecte o gal O à saída de um gerador de função elétrica padrão ou circuito de controle e defina o pico para pico voltages para um a três volts. Em seguida, comece a escanear os dois espelhos usando um cartão de visita. Localize o feixe de laser no plano estacionário, 300 milímetros após a lente do tubo.

Coloque a lente objetiva no caminho do feixe, certificando-se de posicionar a abertura traseira da lente objetiva o mais próximo possível do plano estacionário. Configure o estágio de amostra, certificando-se de que a montagem do eixo Z traduzível não atinja a montagem da lente objetiva à medida que é transladada em seu alcance. Para configurar o confocal, o orifício e o detector, comece desconectando todas as fontes de alimentação e fibra óptica.

Gire o conjunto do microscópio de forma que ele fique novamente apoiado na placa de ensaio, segurando o espelho de varredura ressonante. Depois de reconectar a fibra ao colimador e ao espelho de varredura padrão, cabos de alimentação, alimentação e controle, coloque zero volts na tensão de controle que aciona a garota de varredura padrão como antes no palco, coloque uma amostra de um sanduíche de corante brilhante entre duas lamínulas. Em seguida, ligue a fonte de laser e coloque o corante em foco.

Ajuste a potência do laser para tornar a fluorescência o mais brilhante possível usando um cartão de visita. Rastreie a emissão fluorescente da amostra através da lente objetiva através do sistema de varredura até o espelho dicróico, que reflete o feixe de laser e transmitirá a emissão fluorescente. Encontre este sinal fluorescente do outro lado do espelho dicróico.

Agora diminua as luzes da sala. Coloque um espelho atrás do espelho dicróico para refletir a emissão em um ângulo de 90 graus. Em seguida, usando uma íris com um espelho, direcione o feixe de fluorescência o mais reto e paralelo possível à placa de ensaio.

Em seguida, a unidade confocal pinhole será configurada usando o conjunto de montagem da gaiola de filtro espacial da Thor Labs. Este diagrama descreve a configuração. O espelho de varredura fica em planos estacionários que são tele com uma objetiva estacionária.

Pares de lentes do plano de abertura traseira entre os planos estacionários atuam para retransmitir os feixes digitalizados. O primeiro par de lentes tem lentes focais iguais, formando um telescópio um-para-um. O segundo par de lentes, conhecido formalmente como lente de varredura e lente de tubo, não precisa ter igual distância focal e geralmente serve como um telescópio de expansão de feixe para garantir que a abertura traseira da objetiva seja preenchida demais.

A luz emitida pela amostra viaja de volta pelo sistema de varredura e passa pelo espelho dicróico. Uma lente de foco curto ou uma lente objetiva focaliza a luz de emissão através do orifício confocal, que é então agrupado por uma lente. Uma lente final focaliza a emissão filtrada confocal em um tubo fotomultiplicador.

Coloque a unidade de filtro espacial alinhada com o caminho do feixe de emissão, tendo o cuidado de centralizar o primeiro suporte da lente de foco no feixe de emissão. Neste caso, uma unidade de filtro espacial com um tamanho de orifício de 100 mícrons foi selecionada. Em seguida, monte uma lente de distância focal curta na unidade e deslize o suporte de translação Z até que um foco claro possa ser observado na superfície do orifício.

Certifique-se de que toda a unidade esteja orientada ao longo da linha reta definida pelo feixe fluorescente. Prenda a unidade à placa de ensaio. Agora, usando os botões de ajuste no estágio de tradução, ajuste os dois eixos para realizar uma pesquisa 2D sobre a superfície de montagem do orifício para encontrar o ponto onde o sinal fluorescente através do orifício é maximizado.

Em seguida, coloque a lente de revestimento no suporte da gaiola Após o orifício usando um cartão de visita, encontre o íon fluorescente que passa pela unidade confocal e deslize a lente de revestimento ao longo dos postes até que a fluorescência emitida esteja o mais agrupada possível. Configure o conjunto do tubo multiplicador de fotos. Coloque uma lente de distância focal de 50 milímetros no caminho do feixe de emissão fluorescente e encontre seu ponto focal.

Marque esta posição na placa de ensaio. Agora desligue o laser completamente e posicione o tubo fotomultiplicador de forma que sua janela fique o mais próximo possível do ponto focal marcado. Em seguida, usando tubos de lente ajustáveis, conecte o conjunto à lente de foco.

Enrole fita escura em torno de todos os caminhos de feixe expostos seguindo o orifício, ligue o laser, mantendo sua potência extremamente baixa. Ligue o tubo fotomultiplicador lendo cuidadosamente sua tensão no osciloscópio. À medida que a intensidade do laser aumenta, aumente a tensão até que um pico como leitura e/ou um deslocamento CC possa ser visto na tela do osciloscópio.

Confirme se esse sinal realmente surge da fluorescência desligando o laser ou bloqueando o caminho do feixe para observar uma perda de sinal. Por fim, alinhe iterativamente o orifício para obter o sinal máximo no osciloscópio. Manipulando primeiro a posição Z da lente de foco e, em seguida, ajustando o estágio de translação YZ, o hardware do microscópio de taxa de vídeo está completo.

Primeiro, desligue o tubo multiplicador de fotos. Agora conecte os espelhos, placas de controle personalizadas e computador, conforme diagramado no protocolo escrito que acompanha. Este sistema pode ser adaptado para a realização de microendoscopia de varredura confocal.

Ao substituir o estágio por um estágio de retenção de fibra, consulte o texto ou os detalhes que o acompanham. O microscópio de varredura confocal vertical acabado e o microendoscópio devem aparecer como mostrado aqui. Os feixes de laser e emissão foram desenhados como um guia para o olho.

Durante a operação de microendoscopia, um suporte de fibra mantém a fibra da imagem no lugar para experimentos. Esta montagem de fibra pode ser prontamente substituída por um estágio XY para usos. Uma plataforma de microscópio vertical mostrada aqui é uma imagem de teste representativa tirada de um M minúsculo impresso em um cartão de visita branco usando um cartão de captura de quadros de taxa de vídeo para gerar imagens do sinal de entrada. Branqueado.

O papel branco contém força de flúor que é facilmente excitada pela luz UV e azul, resultando no fundo brilhante por trás do escuro. A letra M e o filtro de emissão centrado em 515 nanômetros foram escolhidos para coletar essa emissão fluorescente. Uma pequena distorção da imagem pode ser observada especialmente perto das bordas laterais do quadro da imagem.

Essa distorção resulta do padrão de varredura senoidal do espelho gvo de oito kilohertz e é discutida em detalhes no documento anexo. Este filme mostra dados de taxa de vídeo de amostra obtidos pela digitalização de um cartão de visita. Depois de assistir a este vídeo, agora você deve ter uma boa compreensão de como construir e alinhar um microscópio de varredura confocal de taxa de vídeo.

Não se esqueça de que trabalhar com luz laser pode ser extremamente perigoso e precauções como remover todas as joias reflexivas e evitar trabalhar com os olhos no nível da linha do feixe devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.