Name: Um dia-Esquema de fluxo de trabalho para detecção de patógenos de bactérias e de resistência antimicrobiana de hemoculturas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprenda um fluxo de trabalho de um dia para identificar patógenos bacterianos e perfis de resistência antimicrobiana em hemoculturas usando PCR quantitativo de DNA ribossômico 16S.

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Este trabalho foi financiado pelo azm Profileringsfonds (PF245).

PARTE I: identificação do patógeno 1. Preparação da Amostra Nota: O fluxo de trabalho inteiro molecular como é descrito no protocolo seguinte deve ser realizada de acordo com as recomendações para garantia da qualidade do diagnóstico molecular 3. <ol><li> Adicionar uma alíquota de 0,1 ml de cultura de sangue a 0,9 ml de NaCl 0,9% para um tubo de reacção 1,5 ml a tornar-se uma amostra 1:10 diluído. (Diluir a fim de evitar a inibição qPCR). </li><li> Centrifugar amostra a 13.400 xg durante 5 min a pelete o ADN bacteriano. </li><li> Ressuspender o sedimento bacteriano em 100 uL estéril desmineralizada H 2 O. </li><li> Armazenar a amostra de ADN a 4 ° C até uso posterior. </li></ol> 2. Ensaio de Identificação: Real-Time PCR rDNA 16s <ol><li> Preparar as misturas de reacção como se segue. O ensaio consiste em quatro reacções separadas por amostra. Cada mistura inclui 12,50 mestre ulmistura, 0,9 uM para a frente de iniciadores (5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3) 7, 0,6 mM iniciador reverso (5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3) 8 e um painel de sondas. A quantidade de sondas é dado para cada um dos quatro reacções separadas em baixo. </li><li> A primeira reacção inclui: <ul><li> 0,2 mM da sonda universal (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) 8 </li><li> 0,2 uM P. sonda aeruginosa (5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1) </li></ul></li><li> A segunda reacção inclui: <ul><li> 0,2 uM E. sonda coli (5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1) </li><li> 0,2 uM de Pseudomonas spp. sonda (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ) </li></ul></li><li> A reacção terceira inclui: <ul><li> 0,2 mM Staphylococcus spp. sonda (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ) </li><li> 0,2 uM de S. sonda aureus (5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1) </li><li> 0,2 uM Enterococcus spp. (5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1) </li></ul></li><li> A reacção quarto inclui: <ul><li> 0,2 mM da sonda universal (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) </li><li> 0,3 uM Streptococcus spp. sonda (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ) </li><li> 0,2 uM de S. pneumoniae sonda (5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1) </li></ul></li><li> Adicionar estéril desmineralizada H2O para atingir um volume total de 20 uL. Adicionar 20 ul de cada mistura de reacção para os poços de uma placa de PCR de 96 poços. </li><li> Adicionar 5 ul de amostra a cada poço. </li><li> Use uma película adesiva para selar a placa de 96 poços de PCR. </li><li> Execute o prato no PRISM 7900HT ABI Real Time PCR System usando as seguintes condições óptimas de ciclos térmicos: <ul><li> Pré-aquecimento a 50 ° C durante 10 min </li><li> Desnaturação inicial a 95 ° C durante 15 min </li><li> 42 ciclos de <ul type="circle"><li> Desnaturação a 95 ° C durante 15 s </li><li> Recozimento a 60 ° C durante 1 min </li></ul></li></ul></li></ol> 3. Análise dos Resultados <ol><li> Ajuste o limiar da Análise de Ct para 0,1 nas configurações de análise de tabulação. Estreitar as configurações de base para iniciar (Ciclo): 6 e End (ciclo): 15. </li><li> Registre o ciclo limiar (Ct) para todas as amostras. O valor de corte para considerar um resultado PCR positivo como pode ser definido como um Ct valor de 35. A quantidade de bactérias presentes em culturas de sangue variou de julho 10-novembro 10 CFU / ml, gerando Ct-valores abaixo de 35. </li></ol> PARTE II: TESTES susceptibilidade a antimicrobianos 4. Isolamento de bactérias a partir de hemoculturas positivas 9 <ol><li> Aspirar 5 ml de caldo de uma garrafa de sangue positivo cultura e transferi-lo para um tubo de separador de soro. </li><li> Centrifugar o tubo separador de soro a 2000 xg durante 10 min. </li><li> Descartar o sobrenadante do tubo separador de soro. </li><li> Transferência de bactérios a partir da camada de gel do tubo com uma mecha de algodão estéril em solução salina a 0,9% até 0,5 de McFarland uma suspensão padrão é obtida. </li></ol> 5. Inoculação de placas de Micro Titre <ol><li> Dilui-se a suspensão 0,5 McFarland em duplo concentrado Mueller Hinton II caldo para formar uma suspensão de 5 x 10 5 UFC / ml. </li><li> Adicionar esta suspensão para os poços de uma placa de micro titulação, contendo uma selecção de antibióticos (Tabela 1). </li><li> Incubar a placa de micro titulação, a 37 ° C durante 6 h. </li><li> Armazenar uma alíquota da suspensão a 4 ° C (como controlo de crescimento negativo). </li><li> Após 6 h de incubação, transferir o conteúdo de cada poço para um tubo de estéril, bem como a amostra de controlo negativo de crescimento que foi armazenada a 4 ° C. </li><li> Centrifugar os tubos a 16.000 xg durante 5 min. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante, sem perturbar o sedimento bacteriano. </li><li> Ressuspender o sedimento em H desmineralizada esterilizada <li> Diluir as amostras de 10 vezes na estéril desmineralizada H 2 O. </li></li></ol> 6. Real-time PCR rDNA 16s 10 <ol><li> Preparar a mistura de PCR como se segue: <ul><li> 12,50 ul iQ SYBR Green Supermix </li><li> 0,5 uM primer dianteiro 16S-1 (5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) 11 </li><li> 0,25 iM reversa 16S-2 primer (5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3) 11 </li><li> estéril desmineralizada H2O para um volume total de 20 uL </li></ul></li><li> Adicionar 20 ul de mistura de PCR para os poços de uma placa de PCR de 96 poços. </li><li> Adicionar 5 ul de amostra a cada poço. </li><li> Use uma película adesiva para selar a placa de 96 poços de PCR. </li><li> Execute o prato no Single-Cor MyiQ Sistema de Detecção de Real-Time PCR, utilizando os seguintes óptimas condições de ciclos térmicos: <ul><li> Desnaturação inicial a 95 ° C durante 4 min </li><li> Inicial de recozimento, a 65 ° C durante 30 s </li><li> 35 ciclos de <ul><li> Desnaturação a 95 ° C durante 15 s </li><li> Recozimento a 60 ° C durante 1 min </li></ul></li><li> Derreter análise da curva (60-95 ° C em 20 min com incrementos de 0,57 ° C) </li></ul></li></ol> 7. Análise dos Resultados <ol><li> Calcular o valor de corte Ct, utilizando uma das seguintes fórmulas (dependendo do tipo de antibiótico). <ul><li> Em geral: Cut-off Ct valor = valor Ct controle do crescimento positivo + 0,5 x (valor Ct controle do crescimento negativo - valor Ct controle de crescimento positivo) </li><li> Piperacilina, piperacilina / tazobactam e ceftazidima em bacilos Gram-negativos; amoxicilina, oxacilina e trimetoprim / sulfametoxazol em S.aureus; Amoxicilina em Enterococcus spp:. Cut-off Ct valor = valor Ct controle do crescimento positivo + 0,25 x (Ct crescimento valor negativo controle - valor Ct controle de crescimento positivo) </li></ul></li><li> Use a amostra incubada com desmineralizada estéril H 2 O, como controle de crescimento positivo.</li><li> Dependendo do microorganismo, utilizar o controlo de crescimento negativa adequada: <ul><li> Gram-negativas Amostra hastes incubadas com uma mistura de antibióticos </li><li> Enterococcus spp Amostra. Armazenado a 4 ° C </li><li> Exemplo S.aureus armazenado a 4 ° C </li></ul></li><li> Determinar a susceptibilidade (S) ou a resistência (R) da estirpe para o antibiótico testado como se segue: <ul><li> Um valor Ct superior ao valor Ct de corte indica susceptibilidade </li><li> Um valor Ct inferior ao valor Ct de corte indica resistência </li></ul></li></ol> 8. Os resultados representativos Dois organismos modelo, ou seja, uma E. Gram-negativas coli e S. uma Gram-positivos aureus, são escolhidos para visualizar o procedimento combinado para a detecção e identificação de agentes patogénicos bacterianos e de determinação do seu perfil de antimicrobiana. A primeira parte do protocolo compreende a identificação do patógeno. Spesondas específicos são concebidos para a detecção de oito microrganismos clinicamente relevantes. Em presença de um alvo incluídos no painel de bacteriana, as curvas de amplificação são gerados e valores Ct são calculados (Figura 2). O valor de corte para considerar um resultado positivo de PCR como está definido para um valor de Ct de 35. Na Figura 2A, o perfil de identificação de uma cultura de E. coli sangue infectado é mostrado. A sonda 16S universal está incluído em duas misturas de reação separadas e, conseqüentemente, gera duas curvas de amplificação (Ct de 25,20 e 25,95). O terceiro sinal é derivado da sonda específica para E. coli (Ct de 27,04). A identificação de um S. aureus infectado cultura de sangue é mostrado na Figura 2B. A sonda 16S universal tem sinais de amplificação de 33,35 e 33,71. Os dois sinais restantes são derivadas das sondas específicas para Staphylococcus spp. e S. aureus (Ct de 32,48 e 30,59). A Figura 3 é um exemplo de um antibiótico trama amplificação susceptibilidade de teste, que representa a estirpe de E. coli que foi também mostrado na Figura 2A. Cada linha representa um antibiótico que a amostra bacteriana foi incubada com. Uma amostra com um valor baixo Ct é uma amostra na qual o crescimento ocorreu na presença de uma resistência, antibiótico indicando ao antibiótico testado. Pelo contrário, um valor elevado Ct representa uma amostra na qual nenhum crescimento ocorreu por causa de o funcionamento eficaz da susceptibilidade, antibiótico indicando ao antibiótico testado. A Tabela 1 ilustra a determinação do perfil de antimicrobiana do E. coli e S. isolados aureus. Todos os valores são relatados Ct e, usando as fórmulas mencionadas no texto protocolo (7,1), dois valores de corte Ct são calculadosisoladas de distinguir entre a resistência e susceptibilidade. A estirpe é resistente ao antibiótico se o valor relatado Ct é menor do que o valor calculado Ct cut-off (e vice-versa). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura Fluxograma 1. Da identificação do patógeno e procedimento de teste de sensibilidade aos antibióticos em tempo real usando 16S rDNA PCR. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> A Figura 2 ensaio Identificação:. Gráficos de amplificação e os valores de limiar de ciclo (valores Ct) Uma cultura de sangue positivo é detectado pelo universal 16S rDNA sonda, enquanto as sondas específicas são utilizados para a identificação do agente patogénico causal.. A. enredo ampliação da cultura de sangue contendo E. coli, B. enredo ampliação da cultura de sangue contendo S. aureus; Pseudomonas ae, Pseudomoncomo aeruginosa; uni, 16S sonda universal; Ecoli, Escherichia coli sonda; Pseudomonas sp, Pseudomonas spp. sonda; S. pneumoniae, Streptococcus pneumoniae sonda; Strep sp, Streptococcus spp. sonda; Entero, Enterococcus spp. sonda; S. aureus, Staphylococcus aureus sonda; Staph sp, Staphylococcus spp. sonda. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura enredo Amplificação 3. Dos testes de susceptibilidade a antibióticos de um E. coli isolado (amostra 1). Cada curva representa um antibiótico que a estirpe foi incubada com. Um sinal precoce é causada por uma carga elevada de bactérias, o que significa que a estirpe cresceu na presença do antibiótico testado e é, portanto, resistente ao antibiótico. Sinais tardios indicam que a estirpe não cresceu na presença do antibiótico, por outras palavras, ela é susceptível. <table border="1"><tbody><td> Exemplo 1: E. coli </td><td></td><td></td><td> Exemplo 2: S. aureus </td><td></td><td></td><tr><td> AST </td><td> Ct </td><td> R / S </td><td> AST </td><td> Ct </td><td> R / S </td></tr><tr><td> A amoxicilina de 8 mg / L </td><td> 16,83 </td><td> R </td><td> A amoxicilina de 0,25 mg / L </td><td> 21,03 </td><td> R </td></tr><tr><td> Amoxicilina-clavulanato mg 8/4 / L </td><td> 17,36 </td><td> R </td><td> Oxacilina 2 mg / L </td><td> 25,80 </td><td> S </td></tr><tr><td> Piperacilina 16 mg / L </td><td> 16,67 </td><td> R </td><td> A vancomicina 2 mg / L </td><td> 25,20 </td><td> S </td></tr><tr><td> Piperacilina-tazobactam 16 /4 mg / L </td><td> 24,15 </td><td> S </td><td> Gentamicina 4 mg / L </td><td> 25,86 </td><td> S </td></tr><tr><td> Ciprofloxacina 1 mg / L </td><td> 29,72 </td><td> S </td><td> Trimetoprima-sulfametoxazol mg 2/38 / L </td><td> 24,62 </td><td> S </td></tr><tr><td> A ceftazidima 1 mg / L </td><td> 24,03 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> A ceftazidima 8 mg / L </td><td> 26,58 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina 4 mg / L </td><td> 29,83 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Trimetoprima-sulfametoxazol mg 2/38 / L </td><td> 27,60 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Controlo de crescimento negativo (mistura de antibióticos) </td><td> 30,41 </td><td></td><td> Controlo de crescimento negativo (amostra armazenada a 4 ° C) </td><td> 27,42 </td><td></td></tr><tr><td> Controle de crescimento positiva </td><td> 16,90 </td><td></td><td> Controle de crescimento positiva </td><td> 20,22 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cut-off valor Ct-1 * </td><td> 21,76 </td><td></td><td> Cut-off valor Ct-1 *** </td><td> 23,82 </td><td></td></tr><tr><td> Cut-off Ct-valor 2 ** </td><td> 18,75 </td><td></td><td> Cut-off Ct-valor 2 **** </td><td> 22,02 </td><td></td></tr><tr><td> * Para amoxicilina, amoxicilina-clavulanato, ciprofloxacina, gentamicna, sulfametoxazol-trimetoprim ** Para piperacilina, piperacilina-tazobactam, ceftazidima </td><td></td><td></td><td> *** Para vancomicina e gentamicina Para **** amoxicilina, oxacilina e sulfametoxazol-trimetoprim </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Determinação dos testes de susceptibilidade aos antibióticos das duas amostras (E.coli e S.aureus). Os valores de TC do PCR-ensaio foram copiados para este ficheiro Excel, como o que pode automaticamente calcula os dois alores de corte Ct a partir do controlo de crescimento positivo e negativo, usando as fórmulas mostradas no texto de protocolo. Se um antibiótico mostra um valor Ct inferior ao valor Ct de corte, a estirpe é resistente ao antibiótico, se o valor Ct foi maior do que o ponto de corte, a estirpe é susceptível.

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</ol>

Não temos nada a divulgar.

O protocolo descrito aqui permite a rápida identificação de patógenos e fornece um perfil funcional antimicrobiano que poderia conduzir a administração precoce de antibióticos adequados, melhorando o prognóstico de pacientes com infecções da corrente sanguínea. Dependendo das condições requeridas de um teste, isto é, baixo custo, com rendimento elevado, o mínimo tempo de rotação, as condições de ensaio pode ser ajustada. Todo o procedimento pode ser realizado dentro de um dia útil. Além disso, as duas partes do protocolo pode ser realizada simultaneamente, o que reduz o tempo de rotação de forma significativa. Como apresentado aqui, o painel de identificação é uma seleção das bactérias mais clinicamente relevantes em nosso hospital. Uma vez que o principal princípio tem como alvo a região do gene 16S, as sondas específicas para outros microorganismos podem ser concebidos e adicionado ao ensaio. O ensaio completo foi originalmente destinado para a análise rápida de culturas de sangue, mas também pode ser usado para o processamento de Oamostra materiais Ther. Este é também o caso para os antibióticos que foram usados ​​para os testes de susceptibilidade aos antibióticos: mais antibióticos ou outras podem ser adicionados, com base em padrões de resistência locais e orientações.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio (NaCl) </td><td> Merck Chemicals </td><td> 106404 </td><td> 0,9% em água </td></tr><tr><td> Vacutainer SST tubo separador de soro de 5 ml </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 367986 </td><td></td></tr><tr><td> Mueller Hinton II caldo </td><td> BD Diagnostic Dystems </td><td> 212322 </td><td> 44 g / L em água </td></tr><tr><td> Centrifugar Rotixa 50 rs </td><td> Andreas Hettich GmbH &amp; Co. KG </td><td> 4910 </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga 5415 D </td><td> Eppendorf </td><td> Descontinuado </td><td></td></tr><tr><td> Primers </td> &lt;td&gt; Sigma-Aldrich </td><td> nd </td><td></td></tr><tr><td> Sondas </td><td> Sigma-Aldrich/Applied Biosystems </td><td> nd </td><td></td></tr><tr><td> TaqManEnvironmental mestre mix 2,0 </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4396838 </td><td></td></tr><tr><td> iQ SYBRGreen Supermix </td><td> Bio-Rad Laboratories BV </td><td> 170-8880 </td><td></td></tr><tr><td> MicroAmp Optical 96-Bem Placa de Reacção </td><td> Applied Biosystems </td><td> N8010560 </td><td></td></tr><tr><td> Película adesiva MicroAmp Optical </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311971 </td><td></td></tr><tr><td> iQ placas de 96 poços de PCR </td><td> Bio-Rad Laboratories BV </td><td> 223-9441 </td><td></td></tr><tr><td> Microseal B Adesivo Selos </td><td> Bio-Rad Trabalhoatories BV </td><td> MSB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Real-time Sistema de Detecção de PCR </td><td> Applied Biosystems </td><td> ABI PRISM 7900HT </td><td></td></tr><tr><td> Real-Time PCR Detection System </td><td> Bio-Rad Laboratories BV </td><td> MyiQ Single-Cor </td><td></td></tr></tbody></table>

um dia-esquema de fluxo de trabalho para detecção de patógenos de bactérias e de resistência antimicrobiana de hemoculturas

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Infecções da corrente sanguínea estão associados a altas taxas de mortalidade por causa da manifestação provável de sepse, sepse grave e choque séptico 1. Assim, a administração rápida de terapia antibiótica adequada é de grande importância no tratamento de infecções da corrente sanguínea. O elemento crítico neste processo é o tempo, fortemente dependente dos resultados da identificação bacteriana e testes de susceptibilidade aos antibióticos. Ambos estes parâmetros são rotineiramente obtido por cultura com base em testes, o que é demorado e leva em média 24-48 horas 2, 4. O objectivo do estudo foi o de desenvolver baseados em DNA ensaios para a rápida identificação de infecções da corrente sanguínea, bem como testes de susceptibilidade antimicrobiana rápida. O primeiro ensaio é um 16S eubacterianas ADNr baseado em tempo real de ensaio PCR, complementados com espécies-ou género sondas específicas 5. Usando estas sondas, bactérias gram-negativas, incluindo Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosae Escherichia coli, bem como bactérias Gram-positivas, incluindo Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., e Streptococcus pneumoniae poderiam ser distinguidas. Utilizando este ensaio Multiprobe, uma primeira identificação do micro-organismo causador foi dado após 2 h. Em segundo lugar, nós desenvolvemos um ensaio semi-molecular para testes de susceptibilidade a antibióticos de S. aureus, Enterococcus spp. e (facultativo) aeróbios Gram-negativos hastes 6. Este ensaio baseou-se um estudo em que a PCR foi utilizado para medir o crescimento de bactérias 7. As bactérias colhidas directamente a partir de culturas de sangue são incubadas durante 6 h, com uma selecção de antibióticos, e seguindo um Sybr Verde baseado em tempo real ensaio de PCR determina a inibição do crescimento. A combinação destes dois métodos poderiam dirigir a escolha de uma terapia adequada antibiótico no mesmo dia (Figura 1). Em conclusão, A análise molecular de ambos identificação e antibiograma oferece uma alternativa mais rápida para a detecção de patógenos e pode melhorar o diagnóstico de infecções da corrente sanguínea.

O desenho de um esquema de fluxo de trabalho simples de um dia para diagnóstico de patógenos bacterianos permite o reconhecimento rápido de infecções da corrente sanguínea. A inclusão de oito clinicamente relevantes alvos bacterianas e os seus perfis de resistência a antibióticos oferece a percepção um clínico inicial no mesmo dia, o que pode levar a uma terapia mais adequada.

Um dia-Esquema de fluxo de trabalho para detecção de patógenos de bactérias e de resistência antimicrobiana de hemoculturas

Infecções da corrente sanguínea estão associadas a altas taxas de mortalidade devido à provável manifestação de sepse, sepse grave e choque séptico1. ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar e avaliar a suscetibilidade a antibióticos de isolados de hemocultura em menos tempo do que os métodos convencionais. Isso é realizado primeiramente identificando o isolado de hemocultura, utilizando um novo ensaio de PCR multiplex com ribossomo 16 s de DNA.Em seguida, o isolado é incubado com um painel de antibióticos durante seis horas. O próximo passo consiste em determinar o crescimento ou a inibição do crescimento do isolado na presença do antibiótico, utilizando um ensaio quantitativo de PCR do DNA ribossomal 16S. Em última análise, os resultados demonstram que a identificação e o teste de suscetibilidade a antibióticos de um isolado de cultura sanguínea podem ser obtidos mais rapidamente por meio dessa combinação de cultura e PCR.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como aqueles que utilizam sistemas automatizados Phoenix ou IIC, é que não é necessário nenhum pré-cultivo, e os resultados de identificação e teste de suscetibilidade a antibióticos podem estar disponíveis no mesmo dia. Demonstrarão o procedimento Vandy Hanson e estudantes de doutorado em GID do nosso laboratório. Dilua 100 microlitros de cultura sanguínea positiva para crescimento microbiano em um tubo de reação contendo 900 microlitros de cloreto de sódio 0,9%. Em seguida, centrifugue a amostra a 13.400 ×g durante cinco minutos para obter o pellet bacteriano após a centrifugação.Reese, suspenda o pellet em 100 microlitros de água desmineralizada estéril. Armazene a amostra a quatro graus Celsius até uso posterior. Após todas as amostras estarem prontas, prepare as misturas de reação de PCR em tempo real para amplificar o DNA ribossomal 16 s específico das bactérias de interesse.Use água desmineralizada para ajustar os volumes a 20 microlitros por reação. Aliquote 20 microlitros da mistura de PCR por poço em uma placa de PCR de 96 poços. Em seguida, adicione cinco microlitros da amostra a cada poço e feche a placa de PCR.Em seguida, realize a PCR no sistema de PCR em tempo real A BI Prism 7,900 HT para analisar os resultados assim que a PCR for concluída. Primeiro, use a guia de configurações de análise para ajustar a análise de CT a 0,1. Em seguida, reduza as configurações de linha de base para iniciar no ciclo 6 e terminar no ciclo 15. Registre o valor de CT para cada amostra.O valor de corte para considerar um resultado de PCR como positivo pode geralmente ser definido como um valor de CT de 35. Neste exemplo, o perfil de identificação de uma cultura sanguínea infectada por E. coli é mostrado em duas misturas de reação. Foram incluídos primers universais de DNA ribossômico 16S e geraram duas curvas de amplificação com CT de 25,2 e 25,95.A terceira curva de amplificação é derivada da sonda específica para Coli. Outras sondas específicas não geraram sinais detectáveis. Uma vez que o patógeno tenha sido identificado, pode-se realizar o teste de antibióticos.Inicie transferindo cinco mililitros de caldo de uma cultura sanguínea positiva para um tubo com separador sérico. Centrifugue a amostra a 2000 ×g por 10 minutos; após a centrifugação, descarte o sobrenadante do tubo. Em seguida, utilizando um swab de algodão estéril, transfira as bactérias da camada gelatinosa do tubo para cloreto de sódio a 0,9%, até obter uma solução com turbidez equivalente ao padrão de McFarland 0,5.Isso corresponde a cerca de 1,5 vezes 10 elevado a oito unidades formadoras de colônias por mililitro. Em seguida, dilua a suspensão em caldo Muller Hinton de concentração dupla para obter uma concentração de aproximadamente cinco vezes 10 elevado a cinco unidades formadoras de colônias por mililitro.Aliquotar 50 microlitros por poço da suspensão em uma placa de microtitulação já contendo 50 microlitros por poço de uma seleção de antibióticos. Certifique-se de incluir controles positivos de crescimento para cada amostra, utilizando poços com água em vez de antibióticos. Cubra a placa ao finalizar.Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius por seis horas para permitir o crescimento bacteriano. Certifique-se de armazenar uma alíquota da suspensão bacteriana a quatro graus Celsius como controle negativo de crescimento. Após a incubação de seis horas, transferir o conteúdo de cada poço e da amostra controle negativo para tubos estéreis separados.Após uma centrifugação de cinco minutos a 16.000 × g, remova 80 microlitros do sobrenadante e re-suspenda os pellets em 80 microlitros de água estéril desmineralizada. Dilua as amostras na proporção de 1:10 em água antes de utilizá-las na PCR em tempo real do DNA ribossomal 16S.Prepare a mistura de PCR utilizando o super mix IQ cyber green e os primers do DNA ribossomal 16 s e distribua alíquotas de 20 microlitros por poço em uma placa de PCR de 96 poços. Em seguida, adicione cinco microlitros de cada amostra aos poços e feche a placa.Em seguida, realize a PCR para analisar os resultados. Primeiro, calcule o valor de CT de corte. Em geral, o CT de corte equivale ao CT do controle de crescimento positivo mais 0,5 vezes o CT do controle de crescimento negativo menos o CT do controle de crescimento.No entanto, para piperacilina com tazobactam e CEF dazadi em bastonetes gram-negativos, bem como para amoxicilina, oxacilina e trimetoprim com sulfametoxazol em staphylococcus aureus ou a partir de amoxicilina em enterococcus SPP, o fator de multiplicação de 0,5 deve ser reduzido para 0,25. A suscetibilidade ou resistência das cepas em cada amostra pode ser determinada comparando o CT da amostra com o CT de corte.Um valor CT acima do limite indica suscetibilidade, enquanto um valor CT abaixo do limite indica resistência. A seguir, há um exemplo de um gráfico de amplificação para suscetibilidade a antibióticos. A cepa de e coli identificada anteriormente foi testada quanto à sensibilidade a vários antibióticos, cada um representado por uma curva separada.Amostras com um valor de CT baixo são aquelas em que ocorreu crescimento na presença de um antibiótico, indicando resistência ao antibiótico testado. Em contrapartida, um valor de CT alto representa uma amostra na qual não houve crescimento, indicando suscetibilidade ao antibiótico testado. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em nove horas, se for executada corretamente.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um protocolo rápido para a identificação directa de Enterococcus faecalis e Enterococcus outras espécies a partir de uma hemocultura positiva usando um ácido nucléico Peptide fluorescentes em ensaio de hibridização in situ (FISH PNA).

Um Procedimento de 1,5 horas para a Identificação de Enterococcus Espécies Diretamente de hemoculturas

Biossensores fagos líticos e contas de anticorpos são capazes de discriminar entre resistente à meticilina (MRSA) e bactérias estafilococos sensíveis. Os fagos foram imobilizadas por um método de Langmuir-Blodgett sobre uma superfície de um sensor de microbalança de cristal de quartzo e trabalhado como de largo espectro de estafilococos sondas. Contas de anticorpos reconhecer MRSA.

Biossensor para detecção de bactérias Staphylococcus resistente a antibióticos

Uma preparação sedimento bacteriano rápida de uma cultura de sangue positiva pode ser utilizado como uma amostra para aplicações tais como a identificação por MALDI-TOF, a coloração de Gram, teste de susceptibilidade aos antibióticos e ensaios baseados em PCR. Os resultados podem ser rapidamente comunicados aos médicos para melhorar a evolução dos pacientes que sofrem de infecções da corrente sanguínea.

Preparação de uma Cultura Pellet sangue para rápida identificação bacteriana e Antibiótico Teste à Susceptibilidade

Antibióticos fluorescentes são ferramentas poderosas que podem ser usadas para estudar múltiplos aspectos da resistência antimicrobiana. Este artigo descreve a preparação de antibióticos fluorescentes e sua aplicação para estudar a resistência a antibióticos em bactérias. As sondas podem ser usadas para estudar mecanismos de resistência bacteriana (por exemplo, efflux) por espectrofotometria, citometria de fluxo e microscopia.

Visualização da resistência bacteriana usando sondas de antibióticos fluorescentes

Este protocolo apresenta ensaio rápido de suscetibilidade antimicrobiana (AST) em até 2,5 h por imagem de espalhamento Raman estimulado por célula única do metabolismo de D2O. Este método aplica-se a bactérias no ambiente urinário ou no sangue total, o que é transformador para AST fenotípica de célula única rápida na clínica.

Teste Rápido de Suscetibilidade a Antimicrobianos por Imagem de Dispersão Raman Estimulada da Incorporação de Deutério em uma Única Bactéria

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o isolamento e identificação de bactérias resistentes a antibióticos da água e a caracterização molecular de seus genes de resistência a antibióticos (ARGs). O uso de técnicas baseadas em cultura e não baseadas em cultura (análise metagenômica) fornece informações completas sobre a diversidade bacteriana total e o pool total de diferentes ARGs presentes em águas doces de Mumbai, Índia.

Isolamento e Identificação de Bactérias Resistentes a Antibióticos Transmitidos pela Água e Caracterização Molecular de seus Genes de Resistência a Antibióticos

Aqui apresentamos o princípio, a estrutura e a instrução do sistema inteligente de teste de sensibilidade antimicrobiana de alto rendimento/triagem de fagos. Sua aplicação é ilustrada usando Salmonella isolada de aves em Shandong, China, como exemplo. O índice Lar é calculado, e sua importância na avaliação da resistência antimicrobiana é discutida de forma abrangente.

Aplicação do Sistema Inteligente de Teste de Sensibilidade Antimicrobiana de Alto Rendimento/Phage Screening System e Índice Lar de Resistência Antimicrobiana

A EUCAST desenvolveu um protocolo direto de teste de suscetibilidade antimicrobiana (AST) para hemoculturas automatizadas. No entanto, sua dependência da identificação microbiana baseada em espectrometria de massa pode ser evitada usando um protocolo de preparação direta de inóculo em um sistema automatizado de identificação microbiana. Essa abordagem pode fornecer relatórios de AST dentro de 24 horas após a coleta da amostra.

Identificação microbiana direta usando um sistema automatizado de identificação microbiana para facilitar o método EUCAST RAST sem espectrometria de massa

Vários patógenos bacterianos podem causar infecções do trato respiratório e levar a sérios problemas de saúde se não forem detectados com precisão e tratados prontamente. A detecção rápida e precisa desses patógenos por meio de amplificação isotérmica mediada por loop fornece gerenciamento e controle eficazes de infecções do trato respiratório em ambientes clínicos.

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Este protocolo descreve um método LAMP baseado em um chip microfluídico totalmente integrado, que permite a detecção na assistência médica de 15 patógenos causadores de infecções do trato respiratório inferior em pacientes de terapia intensiva dentro de uma hora.

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