Um dia-Esquema de fluxo de trabalho para detecção de patógenos de bactérias e de resistência antimicrobiana de hemoculturas

O objetivo geral deste procedimento é identificar e avaliar a suscetibilidade antibiótica de isolados de hemocultura em menos tempo do que com métodos convencionais. Isso é feito identificando primeiro o isolado da hemocultura. Usando um novo ensaio de PCR multiPro de DNA ribossômico de 16 s.

Em seguida, o isolado é incubado com um painel de antibióticos por seis horas. O próximo passo é determinar o crescimento ou o crescimento na inibição do isolado na presença do antibiótico usando um ensaio quantitativo de 16 s ribossômico D-N-A-P-C-R. Em última análise, os resultados mostram que a identificação e o teste de suscetibilidade a antibióticos de um isolado de hemocultura podem ser obtidos mais rapidamente por meio dessa combinação de cultura e PCR.

A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como aqueles que usam sistemas automatizados phoenix ou IIC, é que nenhum status de cultura anterior é necessário e que os resultados da identificação e do teste de suscetibilidade a antibióticos podem estar disponíveis no mesmo dia. Demonstrando o procedimento estarão Vandy Hanson e GID ing alunos de doutorado de nosso laboratório Diluir 100 microlitros de hemocultura positiva para crescimento microbiano em um tubo de reação contendo 900 microlitros de cloreto de sódio a 0,9%. Em seguida, centrifugue a amostra a 13.400 vezes G por cinco minutos para pellet as bactérias após a centrifugação.

Reese, suspenda o pellet em 100 microlitros de água desmineralizada estéril. Instale a amostra a quatro graus Celsius até uso posterior. Quando todas as amostras estiverem prontas, prepare as misturas de reação de PCR em tempo real para amplificar o DNA ribossômico específico de 16 s das bactérias de interesse.

Use água desmineralizada para ajustar os volumes para 20 microlitros por reação. Alíquota de 20 microlitros de mistura de PCR por poço em uma placa de PCR de 96 poços. Em seguida, adicione cinco microlitros de amostra a cada poço e sele a placa de PCR.

Em seguida, execute o PCR no sistema de PCR em tempo real A BI Prism 7, 900 HT para analisar os resultados assim que o PCR for concluído, primeiro use a guia de configurações de análise para ajustar a análise de TC para 0,1. Em seguida, restrinja as configurações de linha de base para iniciar o ciclo seis e terminar o ciclo 15. Registre o valor CT para cada amostra.

O valor de corte para considerar um resultado de PCR como positivo geralmente pode ser definido como um valor de TC de 35. Neste exemplo, o perfil de identificação de uma hemocultura infectada com E. coli é mostrado em duas misturas de reação. Primers universais de DNA ribossômico de 16 s foram incluídos e geraram duas curvas de amplificação de CT 25.2 e 25.95.

A terceira curva de amplificação é derivada da sonda específica para Coli. Outras sondas específicas não geraram sinais detectáveis. Uma vez identificado o patógeno, o teste de antibióticos pode ser realizado.

Comece transferindo cinco mililitros de caldo de uma hemocultura positiva para um tubo separador de soro. Centrifugue a amostra a 2000 vezes G por 10 minutos após a centrifugação, descarte o agente supan do tubo. Em seguida, usando um cotonete estéril, transfira as bactérias da camada de gel do tubo para cloreto de sódio a 0,9% até obter uma solução com turbidez de 0,5 McFarland.

Isso corresponde a cerca de 1,5 vezes 10 elevado às oito unidades formadoras de colônias por mililitro. Em seguida, dilua a suspensão em dupla concentração Muller Hinton. Dois caldos para obter uma concentração de aproximadamente cinco vezes 10 elevado às cinco unidades formadoras de colônias por mililitro.

Alíquota de 50 microlitros por poço da suspensão em uma placa de microtitulação já contendo 50 microlitros por poço de uma seleção de antibióticos. Certifique-se de incluir controles de crescimento positivos para cada amostra usando poços com água em vez de antibióticos. Cubra o prato quando terminar.

Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por seis horas para permitir o crescimento bacteriano. Certifique-se de armazenar uma alíquota da suspensão bacteriana a quatro graus Celsius como um controle de crescimento negativo. Após seis horas de incubação, transferir o conteúdo de cada alvéolo e a amostra de controlo negativo para tubos estéreis separados.

Após uma centrifugação de cinco minutos a 16.000 vezes. G, remova 80 microlitros de sobrenadante e suspenda novamente os pellets em 80 microlitros de água desmineralizada estéril. Diluir as amostras de um a 10 em água antes de as utilizar para 16 s de PCR ribossômica de ADN em tempo real.

Prepare a mistura de PCR usando a super mistura IQ cyber green e primers e alíquotas de DNA ribossômico de 16 s. 20 microlitros por poço em uma placa de PCR de 96 poços. Em seguida, adicione cinco microlitros de cada amostra aos poços e feche a placa.

Em seguida, execute o PCR para analisar os resultados. Primeiro, calcule o valor de corte do CT. Em geral, o CT de corte é igual ao CT do controle de crescimento positivo mais 0,5 vezes o CT do controle de crescimento negativo menos o CT do controle de crescimento.

No entanto, para piperacilina, piperacilina com tazobactam e CEF dazadi em bastonetes Gram-negativos, bem como para amoxicilina, oxacilina e trimetoprima com sulfametoxazol em Staphylococcus aureus ou de amoxicilina. No enterococcus SPP, o fator de multiplicação de 0,5 deve ser reduzido para 0,25. A suscetibilidade ou resistência das cepas em cada amostra pode ser determinada comparando o TC da amostra com o TC de corte.

Um valor de TC acima do ponto de corte indica suscetibilidade, enquanto um TC abaixo do ponto de corte indica resistência. Aqui está um exemplo de um gráfico de amplificação de suscetibilidade a antibióticos. A cepa de E. coli identificada anteriormente foi testada quanto à sensibilidade a vários antibióticos, cada um representado por uma curva separada.

Amostras com baixo valor de TC são amostras nas quais ocorreu crescimento na presença de um antibiótico indicando resistência ao antibiótico testado. Pelo contrário, um alto valor de CT representa uma amostra na qual não ocorreu crescimento indicando suscetibilidade ao antibiótico testado Uma vez dominado. Essa técnica pode ser feita em nove horas se for executada corretamente.