Um dia-Esquema de fluxo de trabalho para detecção de patógenos de bactérias e de resistência antimicrobiana de hemoculturas

O objetivo geral deste procedimento é identificar e avaliar a suscetibilidade a antibióticos de isolados de hemocultura em menos tempo do que os métodos convencionais. Isso é realizado primeiramente identificando o isolado de hemocultura, utilizando um novo ensaio de PCR multiplex com ribossomal 16 s de DNA.

Em seguida, o isolado é incubado com um painel de antibióticos durante seis horas. O próximo passo consiste em determinar o crescimento ou a inibição do crescimento do isolado na presença do antibiótico, utilizando um ensaio quantitativo de PCR do DNA ribossomal 16S. Em última análise, os resultados demonstram que a identificação e o teste de suscetibilidade a antibióticos de um isolado de cultura sanguínea podem ser obtidos mais rapidamente por meio dessa combinação de cultura e PCR.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como aqueles que utilizam sistemas automatizados Phoenix ou IIC, é que não é necessário nenhum pré-cultivo, e os resultados de identificação e teste de suscetibilidade a antibióticos podem estar disponíveis no mesmo dia. Demonstrarão o procedimento Vandy Hanson e estudantes de doutorado em GID do nosso laboratório. Dilua 100 microlitros de cultura sanguínea positiva para crescimento microbiano em um tubo de reação contendo 900 microlitros de cloreto de sódio 0,9%. Em seguida, centrifugue a amostra a 13.400 ×g durante cinco minutos para obter o pellet bacteriano após a centrifugação.

Reese, suspenda o pellet em 100 microlitros de água estéril desmineralizada. Armazene a amostra a quatro graus Celsius até uso posterior. Quando todas as amostras estiverem prontas, prepare as misturas de reação de PCR em tempo real para amplificar o DNA ribossomal 16 s específico das bactérias de interesse.

Use água desmineralizada para ajustar os volumes a 20 microlitros por reação. Aliquote 20 microlitros da mistura de PCR por poço em uma placa de PCR de 96 poços. Em seguida, adicione cinco microlitros da amostra a cada poço e feche a placa de PCR.

Em seguida, realize a PCR no sistema de PCR em tempo real A BI Prism 7,900 HT para analisar os resultados assim que a PCR for concluída. Primeiro, use a guia de configurações de análise para ajustar a análise de CT para 0,1. Em seguida, reduza as configurações de linha de base para iniciar no ciclo 6 e terminar no ciclo 15. Registre o valor de CT para cada amostra.

O valor de corte para considerar um resultado de PCR como positivo geralmente pode ser definido como um valor de CT de 35. Neste exemplo, o perfil de identificação de uma cultura sanguínea infectada por Escherichia coli é mostrado em duas misturas de reação. Foram incluídos primers universais para DNA ribossomal 16S, que geraram duas curvas de amplificação com CT de 25,2 e 25,95.

A terceira curva de amplificação é derivada da sonda específica para Coli. Outras sondas específicas não geraram sinais detectáveis. Uma vez que o patógeno tenha sido identificado, pode-se realizar o teste de antibióticos.

Inicie transferindo cinco mililitros de caldo de uma cultura sanguínea positiva para um tubo com separador sérico. Centrifugue a amostra a 2000 ×g por 10 minutos; após a centrifugação, descarte o sobrenadante do tubo. Em seguida, utilizando um swab de algodão estéril, transfira as bactérias da camada gelatinosa do tubo para cloreto de sódio 0,9%, até obter uma solução com turbidez equivalente ao padrão de McFarland 0,5.

Isso corresponde a cerca de 1,5 vezes 10 elevado a oito unidades formadoras de colônias por mililitro. Em seguida, dilua a suspensão em caldo Muller Hinton de concentração dupla para obter uma concentração de aproximadamente cinco vezes 10 elevado a cinco unidades formadoras de colônias por mililitro.

Aliquotar 50 microlitros por poço da suspensão em uma placa de microtitulação já contendo 50 microlitros por poço de uma seleção de antibióticos. Certifique-se de incluir controles positivos de crescimento para cada amostra, utilizando poços com água em vez de antibióticos. Cubra a placa ao finalizar.

Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius por seis horas para permitir o crescimento bacteriano. Certifique-se de armazenar uma alíquota da suspensão bacteriana a quatro graus Celsius como controle negativo de crescimento. Após a incubação de seis horas, transferir o conteúdo de cada poço e a amostra do controle negativo para tubos estéreis separados.

Após cinco minutos de centrifugação a 16.000 vezes g, remova 80 microlitros do sobrenadante e re-suspenda os pellets em 80 microlitros de água estéril desmineralizada. Dilua as amostras na proporção de 1:10 em água antes de utilizá-las na PCR em tempo real do DNA ribossomal 16S.

Prepare a mistura de PCR utilizando o super mix IQ cyber green e os primers do DNA ribossomal 16 s e alíquota de 20 microlitros por poço em uma placa de PCR de 96 poços. Em seguida, adicione cinco microlitros de cada amostra aos poços e sela a placa.

Em seguida, realize a PCR para analisar os resultados. Primeiro, calcule o valor de CT de corte. Em geral, o CT de corte equivale ao CT do controle positivo de crescimento mais 0,5 vezes o CT do controle negativo de crescimento menos o CT do controle de crescimento.

No entanto, para piperacilina com tazobactam e CEF dazadi em bastonetes gram-negativos, bem como para amoxicilina, oxacilina e trimetoprima com sulfametoxazol em staphylococcus aureus ou a partir de amoxicilina em enterococcus SPP, o fator de multiplicação de 0,5 deve ser reduzido para 0,25. A suscetibilidade ou resistência das cepas em cada amostra pode ser determinada comparando-se o CT da amostra com o CT de corte.

Um valor CT acima do limite indica suscetibilidade, enquanto um valor CT abaixo do limite indica resistência. A seguir, há um exemplo de um gráfico de amplificação para suscetibilidade a antibióticos. A linhagem de e coli identificada anteriormente foi testada quanto à sensibilidade a diversos antibióticos, cada um representado por uma curva separada.

Amostras com um valor baixo de CT são amostras nas quais ocorreu crescimento na presença de um antibiótico, indicando resistência ao antibiótico testado. Pelo contrário, um valor alto de CT representa uma amostra na qual não ocorreu crescimento, indicando suscetibilidade ao antibiótico testado. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em nove horas, se for executada corretamente.