Name: Enriquecimento das células NK do sangue humano com o Kit RosetteSep de StemCell Technologies (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Aprenda a isolar células NK do sangue humano por seleção negativa usando o kit RosetteSep. Este método garante alta pureza e viabilidade celular para pesquisas em imunologia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Um protocolo detalhado está incluído com cada cocktail isolamento Rosette setembro e está disponível online no site tecnologias StemCell 1.

<ol><li>Procedures and instruction manuals. , 
	
 <a target="_blank" href="http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx">http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx</a> Forthcoming.</li>
</ol>

As células isoladas usando esta técnica pode ser ainda separados em diferentes populações utilizando kits de separação outras células.

PBS suplementado com FCS a 2% e soluções Histopaque devem ser levados à temperatura ambiente antes do início do procedimento.

enriquecimento das células nk do sangue humano com o kit rosettesep de stemcell technologies

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) são grandes granular linfócitos citotóxicos que pertencem ao sistema imune inato e desempenham um papel importante na luta contra o câncer e infecções, mas também estão implicados nos estágios iniciais da gravidez e da rejeição do transplante. Essas células estão presentes no sangue periférico, a partir do qual eles podem ser isoladas. As células podem ser isoladas por meio de seleção positiva ou negativa. Para a seleção positiva usamos anticorpos dirigidos a um marcador de superfície presente apenas nas células de interesse enquanto que para seleção negativa usamos cocktails de anticorpos direcionados para marcadores de superfície presentes em todas as células, mas as células de interesse. Esta última técnica apresenta a vantagem de deixar as células de juros livre de anticorpos, reduzindo assim o risco de ativação das células indesejáveis ​​ou diferenciação. Neste vídeo protocolo demonstramos como separar as células NK do sangue humano por seleção negativa, usando o kit RosetteSep de StemCell tecnologias. O procedimento envolve a obtenção de sangue periférico humano (sob uma placa de revisão institucional aprovado pelo protocolo para proteger os seres humanos) e misturá-lo com um coquetel de anticorpos que se ligam a marcadores ausente em células NK, mas presente em todas as outras células mononucleares presentes na periferia sangue (por exemplo, os linfócitos T, monócitos ...). Os anticorpos presentes no cocktail são conjugados a anticorpos direcionados para Glicoforina A eritrócitos por diante. Todas as células não desejadas e células vermelhas do sangue, portanto, ser preso em complexos. A mistura de cocktail de sangue e anticorpo é então diluída, sobrepostos em um gradiente Histopaque, e centrifugado. Células NK (&gt; 80% puro) pode ser coletada na interface entre o Histopaque eo plasma diluído. Cocktails similares estão disponíveis para o enriquecimento de populações de células, tais como linfócitos T humanas.

Células natural killer são uma pequena população de linfócitos. Aqui nós mostramos como isolar estas células do sangue humano por seleção negativa, usando um kit de StemCell Technologies. As células obtidas são viáveis ​​e intocada por anticorpos e, portanto, pronto para ser usado para uma série de procedimentos.

Enriquecimento das células NK do sangue humano com o Kit RosetteSep de StemCell Technologies

As células natural killer (NK) são linfócitos citotóxicos granulares volumosos que pertencem ao sistema imunitário inato e desempenham papéis fundamentais no combate ao cancro...

Olá, sou Christine Beaton. Sou pesquisadora assistente no laboratório de George Chen, do Departamento de Fisiologia e Biofísica da Universidade da Califórnia em Irvine. E hoje vou mostrar a vocês como selecionar negativamente células natural killer a partir de sangue humano utilizando os kits coquetel da Stem Cell Technologies.A razão pela qual utilizamos este kit da Stem Cell Technologies é que ele nos fornece uma pureza celular muito alta, e a seleção negativa nos permite obter células que não foram ligadas a um anticorpo. Assim, não ocorre nada inesperado com essas células. O funcionamento do kit Tsep consiste em anticorpos que se ligam a todas as células nas quais não estamos interessados no sangue.No meu caso, linfócitos T, linfócitos B, monócitos e, então, você tem anticorpos que irão ligar-se à glicoforina A nas hemácias; o que fizeram foi ligar um anticorpo contra um leucócito a um anticorpo contra uma hemácia. O que vai acontecer é que se formará um complexo com um leucócito indesejado ligado a múltiplas hemácias; como as hemácias têm maior densidade do que os leucócitos, quando você colocar sua mistura contendo o sangue e os anticorpos sobre um gradiente e realizar a centrifugação, as hemácias irão afundar até o fundo do tubo e arrastarão consigo todos os leucócitos que não deseja. Assim, na fração superior, o que você coletará serão suas células matadoras naturais puras ou quase puras, que não foram ligadas a nenhum anticorpo.Então, vamos começar a isolar células NK de um tubo de sangue humano. Este é um sangue recentemente coletado em um tubo com heparina sódica. Vou utilizar o coquetel de enriquecimento de células NK humanas Roset ep como gradiente.Mais adiante no meu experimento, vou utilizar o histo pack 10 77, que tem uma densidade de 1,077, e também preparei um frasco de PBS suplementado com 2% de soro de feto bovino. Certifico-me de que esses componentes atinjam a temperatura ambiente antes de usá-los, pois os armazeno na geladeira. Assim, vou pegar todo o tubo de sangue e colocá-lo em um tubo cônico de 50 mL.Então, como se trata de um recipiente sob vácuo, há vácuo no interior; para abri-lo sem provocar respingos, localizo a pequena ranhura na tampa do fechamento e a levanto cuidadosamente para permitir a entrada de ar no meu tubo. E quando, após o rompimento do vácuo no tubo, posso retirar a tampa com mais facilidade e, usando uma pipeta de 10 mL, vou pipetar todo o conteúdo do tubo de sangue. Espero, portanto, que haja cerca de 10 mL de sangue.Aqui tenho 9,5 mL de sangue e vou colocar esses 9,5 mL inteiros neste tubo Falcon de 50 mL. Em seguida, a pipeta com o sangue vai diretamente para o saco de resíduos biológicos; no tubo, eu sempre coloco um pouco de água sanitária, fecho e depois o coloco no saco de resíduos biológicos. Assim é como o sangue se apresenta antes da adição do coquetel de anticorpos.Agora vou adicionar o coquetel de anticorpos ao sangue, já que tenho cerca de 9,5 mL de sangue e preciso adicionar 50 microlitros de coquetel por mL de sangue; portanto, vou adicionar 450 microlitros do coquetel ao meu sangue. Em seguida, vou misturar suavemente e quase imediatamente você verá o fenômeno ocorrer. Como você pode ver agora, o fenômeno já está visível.Portanto, a passagem indesejada entre os glóbulos brancos e os glóbulos vermelhos está ocorrendo agora. Vou configurar um cronômetro para 20 minutos e deixar o tubo nessa posição na câmara de fluxo laminar por 20 minutos. O sangue agora incubou por 20 minutos com o coquetel de sub-roseta.Então, vou diluí-lo na proporção de um para um com PBS mais soro de bezerro fetal. E essa mistura vou sobrepor a dois tubos de 15 mL de HistoPaque 1077. Depois disso, vou centrifugar minha amostra na centrífuga por 20 minutos.Então, tenho cerca de 10 mL de sangue mais o coquetel de anticorpos. Vou adicionar 10 mL de PBS contendo 2% de soro de bezerro fetal. Assim, temos uma diluição um para um.Terei que misturar suavemente porque, como você pode ver quando adiciono o PBS ao sangue, ele não se mistura imediatamente. Por isso, basta misturar suavemente. Agora tenho uma mistura em proporção um para um de PBS com sangue, e é isso que vou adicionar aos meus 15 mil de histo pack.E vou sobrepor cuidadosamente para evitar misturar o sangue com o histo pack. Para isso, ao invés de usar uma pipeta de 25 M, que pegaria todo o sangue, vou usar uma pipeta de 10 mil e proceder em várias etapas. Para sobrepor com facilidade, mantenho meu tubo de histo pack quase na posição horizontal.Vou colocar um pouco de sangue no tubo e levá-lo até o histo pack. Em seguida, vou sobrepor lentamente o sangue ao histo pack. Uma vez que eu tenha uma boa camada de sangue, posso começar a pipetar um pouco mais rápido e posso retornar lentamente meu tubo para a posição vertical.Agora, adicionei toda a minha mistura de 20 mil de sangue com coquetel de anticorpos e PBS sobre dois 15 mil de histo pack. E, se você observar na junção do tubo, começará a ver lentamente pequenos agregados de hemácias afundando lentamente no gradiente, e vamos centrifugar o RET simplesmente para acelerar o processo. Assim, em 20 minutos, teremos todas as hemácias no fundo do tubo.E há um ponto muito importante ao fazer uma gt: você deve desligar o freio, porque frear muito rápido pode perturbar seus ingredientes. Portanto, sempre desligamos o freio e, em seguida, vou centrifugar meu sobrenadante RI por 20 minutos e deixar o equipamento realizar seu trabalho. O ingrediente foi agora centrifugado por 20 minutos.Então temos as diferentes camadas de células. Começamos na parte inferior do tubo aqui. Aqui estão todas as células vermelhas do sangue e as células em que não estamos interessados.Acima disso, há uma camada clara de gradiente e, acima dessa, uma camada esbranquiçada de plasma. E as células em que estamos interessados hoje, as células NK, são esse fino filete branco de células entre as camadas de gradiente e plasma.É claro que esta camada é muito, muito fina, porque as células NK representam apenas uma minoria das células sanguíneas. Agora vou remover a camada de células NK usando uma pipeta Pasteur estéril. E esta camada vou colocar em um novo tubo cônico de 50 ml vazio.Então, vou até a camada e a extraio. Claro, há tão poucas células. Quando se tem um grande número de células, é possível obter a camada de forma muito limpa, mas quando há tão poucas células, isso não é possível.E conforme recomendado no aviso do fabricante, recomenda-se que você retire parte do gradiente com as células para evitar perdê-las. Assim, transfiro com pipeta enquanto ainda vejo células presentes. Após remover todas as células, você deverá observar um contraste nítido entre o reagente clarificado e o plasma esverdeado-amarelado.Então, acredito que retirei todas as minhas células agora. Se você observar o gradiente, não verá nada branco e turvo na interface entre o histo pack e o plasma. Agora removi todas as células NK que consegui visualizar no gradiente, coloquei-as em um novo tubo Falcon de 50 ml e imediatamente adicionei ao tubo um pouco de PBS suplementado com 2% de soro fetal bovino.Então, completei até 50 ml e vou centrifugar as células para formar o pellet. Essa será a primeira lavagem. E vou repetir o procedimento uma segunda vez para lavar as células, totalizando duas lavagens.E após isso, as células estarão prontas para qualquer procedimento que você desejar realizar, seja colocando-as em cultura ou utilizando-as para marcação por citometria de fluxo. E você deverá obter pelo menos 80% de pureza de células NK, talvez mais. Já obtive até 98% de pureza com este procedimento.Hoje mostrei a vocês uma técnica muito rápida e confiável para o isolamento de células assassinas naturais a partir de sangue humano, utilizando os kits da Stem Cell Technologies TS. E, é claro, se você deseja isolar outros tipos celulares de humanos, ratos ou camundongos, pode usar qualquer um dos vários kits de isolamento de células T. Eles possuem kits para células T, células B e até subtipos de células T, por exemplo.

enrichment-nk-cells-from-human-blood-with-rosettesep-kit-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui nós descrevemos um método eficiente para expandir e purificar um grande número de células NK e avaliar a sua função.

Expansão, Purificação e Avaliação Funcional de Células NK do sangue periférico

Este vídeo demonstra o método para analisar o metabolismo energético em células NK humanas ativadas usando um analisador de fluxo extracelular. Diferentes inibidores dos complexos da cadeia de transporte de elétrons afetam a síntese de ATP, que é medida por meio da taxa de consumo de oxigênio ou OCR, fornecendo informações sobre o metabolismo celular e a bioenergética.

Monitoramento em tempo real do metabolismo energético em células NK humanas usando um analisador de fluxo extracelular

Este protocolo descreve o desenvolvimento, a expansão, e in vivo de imagens de células NK derivadas de hESCs e iPSCs.

Desenvolvimento, expansão e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitorização das células NK humanas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e e induziu células-tronco pluripotentes (iPSCs)

Um método simples e de confiança é descrito aqui para analisar um conjunto de funções das células NK, tais como desgranulação, produção de citocina e quimiocina dentro de diferentes subconjuntos de células NK.

Ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células NK

O objetivo deste estudo foi a formulação de tecnologias que permitem a transdução de gene bem sucedido na primária natural killer (NK) as células. O dextran-mediada Lentivirus transdução de humanos ou rato primário NK células os resultados, em maior eficiência de expressão do gene. Este método de transdução gene vastamente irá melhorar a manipulação genética de células NK.

Dextran aumenta a eficiência de Lentivirus transdução das células NK primário murino e humano

Um método baseado em citometria de fluxo para determinar quantitativamente a atividade citotóxica de células humanas de assassino natural é mostrado aqui.

Um ensaio de citotoxicidade baseados em citometria de fluxo para a avaliação da atividade das células NK humana

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir em massa-silenciamento murino células NK usando um sistema de diferenciação de alimentador-livre para estudo mecanicista em vitro e em vivo.

Um novo sistema alimentador-livre para produção em massa de murino Natural Killer Cells In Vitro

Um protocolo para estudar eventos orientados pela FcγRIIIa por anticorpos terapêuticos em células assassinas naturais humanas é descrito aqui. Esta plataforma de estimulação artificial permite o interrogatório de funções de efeitos a jusante, como degranulação, produção de quimiocina/citocina, e caminhos de sinalização mediados pelas porções fcγriiia e fc de anticorpos envolvidos na vinculação.

Avaliação de Eventos celulares assassinos naturais humanos impulsionados pelo engajamento da FcγRIIIa na presença de anticorpos terapêuticos

O presente protocolo mostra como diferenciar células CD3−/CD45+CD56+ com citotoxicidade leve de células-tronco potenciais expandidas humanas (hEPSCs) em condições de cultura 3D e 2D. Isso permite a validação fenotípica de rotina sem a destruição do microambiente complexo.

Geração de células assassinas naturais a partir de células-tronco de potencial expandido humano

Aqui, apresentamos um método para diferenciar e expandir células assassinas naturais que expressam o receptor de antígeno quimérico derivado de iPSC humano (CAR) com morte aprimorada contra várias malignidades. Este protocolo demonstra a diferenciação e expansão de células CAR-NK derivadas de iPSC otimizadas para natural killer (NK) e a medição da atividade antitumoral contra várias linhagens de células tumorais.

Avanços em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos que expressam o receptor natural killer do antígeno quimérico derivado de células-tronco

Aprenda a isolar células NK do sangue humano por seleção negativa usando o kit RosetteSep. Este método garante alta pureza e viabilidade celular para pesquisas em imunologia.

Enriquecimento das células NK do sangue humano com o Kit RosetteSep de StemCell Technologies

Explorar mais vídeos