Utilização do Modelo EpiAirway para caracterizar a longo prazo Interações Hospedeiro-Patógeno

O objetivo geral do experimento a seguir é realizar co-cultura de longo prazo de influenza Hemophilus não tipável ou NTHI com tecidos epiteliais respiratórios humanos primários usando o modelo de vias aéreas epi. Isso é conseguido inoculando a superfície apical com NTHI para permitir que a bactéria adira e entre nos tecidos como uma segunda etapa. As inserções são lavadas a cada 24 horas com DPBS pré-aquecido para imitar o fluxo normal de muco e remover resíduos de mucina e quaisquer detritos celulares.

Em seguida, os tecidos são colhidos no momento desejado e a sobrevivência do NTHI total associado à célula ou internalizado é determinada. Finalmente, com este método, as características específicas da cepa de sobrevivência do NTHI dentro dos tecidos ao longo do tempo com base na contagem de bactérias viáveis podem ser avaliadas. Embora esse método possa fornecer informações sobre infecções de longo prazo com influenza hemófila não tipável.

Também pode ser usado no estudo de outros patógenos humanos, como Moraxella Alis, demonstrando que este procedimento será Dr.Doin fez um pós-doutorado em meu laboratório. Remova a placa de transporte de sua embalagem e prepare-se para iniciar o experimento. Pulverize a placa de transporte com etanol 70% e coloque a placa no gabinete de biossegurança.

Alíquota de um mililitro de quatro graus Celsius, epi vias aéreas, meios de manutenção em cada poço de uma placa de seis poços. Em seguida, após remover a fita, abra a placa e remova a gaze que cobre as inserções das vias aéreas epi. Usando um movimento de torção, use uma pinça para liberar uma inserção do aros.

Coloque a inserção em um dos poços da placa de seis poços, se necessário. Use um cotonete estéril para remover cuidadosamente o aros da inserção, evitando tocar na membrana. Confirme se não há bolhas de ar presas sob as inserções.

E então coloque a placa de seis poços em uma incubadora. Lave as inserções diariamente da seguinte maneira, pré-aqueça o DPBS com cálcio e magnésio e preencha uma ponta com o DPBS. Em seguida, usando uma pinça estéril, pegue uma inserção pipetando suavemente 200 microlitros da DPBS pré-aquecida no tecido.

Em seguida, balance a inserção para distribuir uniformemente o DPBS sem tocar no tecido. Em seguida, incline o inserto em um ângulo e coloque uma ponta de pipeta P 1000 contra o anel de plástico que prende a membrana na parte inferior do inserto. Em seguida, aspire cuidadosamente a solução tampão e coloque a solução em um tubo criogênico para estudo posterior.

Por fim, aspirar o meio basal de manutenção e substituí-lo por um mililitro de meio fresco. Pré-aqueça mais DPBS com cálcio e magnésio. Adicione três mililitros do DPBS pré-aquecido a um tubo de 15 mililitros e, em seguida, ressuspenda colônias únicas de influenza não tipável ou NTHI cultivadas durante a noite em ágar chocolate no tubo.

Agora vórtice o tubo vigorosamente por pelo menos 10 segundos e, em seguida, meça a densidade óptica. Continue a adicionar colônias únicas do NTHI até que a concentração bacteriana atinja um OD 600 nanômetros de aproximadamente 0,7. Em seguida, lave cada inserção de vias aéreas EPI com DPBS pré-aquecido como antes e, em seguida, adicione 28 microlitros da suspensão bacteriana à superfície apical de cada inserção.

Evitando inocular os meios basais de manutenção. Em seguida, retorne a placa à incubadora para quantificar o NTHI primeiro pré-aquecido e, em seguida, as placas de ágar chocolate seco à superfície. Em seguida, diluir em série o inóculo NTHI usando PBS estéril com 0,1% de gelatina ou PBSG.

Coloque alíquotas de 10 microlitros do inóculo nas placas e, em seguida, incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, determine as UFC por mililitro contando a diluição que tem 15 a 30 colônias distintas em cada gota e calculando de volta para o seu inóculo viável real de NTHI para colher o total de bactérias associadas à célula. Enxágue a superfície apical das vias aéreas epi três vezes com 200 microlitros de DPBS sem cálcio ou magnésio.

Em seguida, incline o inserto e enxágue qualquer meio de manutenção restante da membrana basal. Coloque o inserto lavado em uma placa nova de seis poços e adicione 250 microlitros de solução estéril de saponina a 1% na superfície apical de cada tecido. Retorne a placa à incubadora por 10 minutos enquanto a placa está incubando.

Configure os tubos para diluição em série, enchendo cada tubo de diluição com 900 microlitros de PBSG. Em seguida, esfregue o tecido da membrana com uma ponta de pipeta P 1000 usando um movimento para frente e para trás, seguido por um movimento circular para remover o tecido das bordas da inserção. Em seguida, usando uma ponta de pipeta P 1000 de grande diâmetro estéril, coloque a suspensão em um tubo einor vazio de 1,5 mililitro.

Agora adicione 250 microlitros de DPBS na superfície apical do inserto e, em seguida, examine o inserto usando um microscópio de contraste de fase invertida para determinar se ainda há algum tecido a ser colhido. Adicione a suspensão ao tubo einor e cubra com 500 microlitros de DPBS vigorosamente. Vortex a suspensão celular por um minuto.

Em seguida, usando uma seringa estéril de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 26. Aspire a suspensão para a seringa através da agulha. Passe lentamente a suspensão pela agulha três vezes, tomando cuidado para não criar bolhas.

Em seguida, bata a suspensão vigorosamente por mais um minuto. Em seguida, use uma ponta de pipeta de diâmetro grande para transferir 100 microlitros da suspensão para o primeiro tubo de diluição. Vortex o tubo vigorosamente por cinco segundos e, em seguida, faça uma a 10 placas de diluição em série para placas de ágar chocolate.

Em seguida, incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono para contagens bacterianas viáveis para coletar bactérias internalizadas. Lave cada inserto apenas três vezes com 200 microlitros de DPBS. Substitua o meio de manutenção basal por um meio contendo 100 microgramas por mililitro de sulfato de gentamicina e, em seguida, adicione 300 microlitros do meio de manutenção contendo Gentamicina na superfície apical.

Retorne as inserções para a incubadora por uma hora enquanto as inserções estão incubando pré-aqueça alguns DPBS. Em seguida, remova o meio de manutenção contendo gentamicina da superfície apical. Em seguida, lave extensivamente a superfície apical e a membrana basal das inserções com o DPBS pré-aquecido.

Finalmente, repita o procedimento de lavagem e colheita que acabamos de demonstrar antes de realizar diluições em série e plaqueamento das bactérias internalizadas nesta figura. Comparando imagens de microscópio eletrônico de varredura de tecidos epi-aéreos não infectados à esquerda com tecidos epi-aéreos infectados com NTHI de cinco dias à direita. Pode-se observar que a co-cultura a longo prazo com NTHI não resulta em danos significativos aos tecidos apicais, ressaltando a utilidade do modelo de via aérea epi.

Aqui, é mostrado um gráfico que descreve o número de NTHI internalizados ao longo do tempo durante uma co-cultura de vias aéreas epi. A cepa R 2 8 6 6 foi inoculada em aproximadamente uma vez 10 do sétimo UFC por inserto. Em seguida, as bactérias internalizadas foram colhidas e enumeradas em cada ponto de tempo indicado.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a co-cultura de longo prazo de NTHI com os tecidos respiratórios do hormônio primário usando o modelo A PRE.