Name: Basófilos Teste de ativação de Investigação de IgE-mediada Mecanismos Hipersensibilidade a Drogas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Aprenda o teste de ativação de basófilos para investigar hipersensibilidade a drogas mediada por IgE usando conjugados droga-proteína caracterizados. Este método otimizado auxilia no diagnóstico de alergias medicamentosas.

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Este trabalho foi financiado pelo Fundo de Ciência Austríaco (FWF) conceder P18820-B13. Declaração de ética: O estudo foi aprovado (PLUS_Ethik_090514) pelo Comitê de Ética de experimentos envolvendo seres humanos e / ou Animais da Universidade de Salzburg cumprimento das Declaraction de Helsínquia revista em 1983 e todos os pacientes participantes deram seu consentimento informado.

1. Preparação de conjugados de medicamentos <ol><li> Dissolver 10 mg DF em 1 ml dH 2 O em um tubo de reação de 1,5 ml. No uso de prosseguir 95 mL desta solução DF. Conjugar PP para HSA dissolver 30,4 mg de derivados PP (304 g / mol) em 500 mL de hidróxido de sódio 0,3 M (NaOH). </li><li> Adicionar 430,6 mL dH 2 O e 100 l 0,5 M 2 - (N-morfolino) etanosulfónico (MES) pH 6,5-95 mL de DF dissolvido. Adicionar 33,1 mL dH 2 O e 140 mL de 2 M MES pH 2,9 para a amostra PP. </li><li> Adicionar 57,5 mL de uma recém-preparados N-etil-N '- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida cloridrato de solução-mãe (EDC) dissolvido em dH 2 O com uma concentração de 100 mg / ml de amostra DF, ou 10 mL de solução EDC a amostra PP. Vortex as amostras para um minuto. </li><li> Adicionar 16,9 ml de solução HSA com uma concentração de 118 mg / ml para cada amostra. </li><li> Incubar as amostras por 2 horas em temperatura ambiente, agitando a 300 rounds / min. </li><li> Diálise do DF e amostras de PP 3 vezes contra 2 litros de tampão fosfato-salina pH (PBS) 7,4 por várias horas cada. Executar todas as etapas diálise a 4 ° C. </li><li> Centrifugar a amostra de 10 minutos a 14.000 xg e recolher o sobrenadante contendo DF ou PP conjugado com HSA. </li><li> Verifique sobrenadante para as proteínas através da realização de um SDS-PAGE, utilizando géis de 12%. Carga de cerca de 12 microgramas de HSA conjugado em um slot de gel. </li></ol> 2. Determinar a taxa de acoplamento de conjugados de medicamentos (Figura 2) <ol><li> Para a análise da taxa de acoplamento do DF e conjugados PP por HPSEC usar um de sódio 100 mM de tampão fosfato pH 6,5 contendo NaCl 150 mM e azida sódica 0,05%. Use um x 7.8 300 milímetros TSK-Gel-G2000 coluna SWXL. </li><li> Realizar a detecção de sinais usando um RI-online acoplada e um sistema de detector UV. </li><li> Preparar uma amostra HSA padrão com uma concentração de 1 mg / ml em dH 2 O. Para a calibração de detector injetar 50 ul HSA solução padrão. </li><li> Calcular o RI RI k constante ea UV UV k constante para o detector. Use a área de RI fórmulas = RI k * [(dn / dc) HSA * c (HSA)] e área de UV UV = k * [(dA / dc) HSA * c (HSA)] com (dn / dc) HSA = 0,185 e (dA / dc) HSA = 0,518 5. </li><li> Prepare DF e padrões PP derivados para HPSEC que 5, 10 e 30 nmol quantidades de ambos os padrões podem ser facilmente injetado. </li><li> Calcule os valores médios de (dn / dc) de drogas e (dA / dc) de drogas para ambos os padrões. Para DF, a (dn / dc) de 0,235 ± 0,010 e um (dA / dc) de 39,000 ± 0,493 foi determinado. Para PP, a (dn / dc) de 0,328 ± 0,016 e um de (dA / dc) 53,155 ± 2,464 foi determinado. </li><li> Injetar conjugados de medicamentos em HPSEC e determinar o seu RI e UV áreas dos picos. </li><li> Calcular a concentração de DF, derivado PP, e HSA, resolvendo as duas equações área RI RI = k * [(dn / dc) de drogas * c (droga) + (dn / dc) HSA * c (HSA)] UV área e = k UV * [(dA / dc) de drogas * c (droga) + (dA / dc) HSA * c (HSA)] para as incógnitas. </li></ol> 3. BAT usando conjugados de medicamentos <ol><li> Prepare sete taças citometria de fluxo e rotulá-las dependendo do seu conteúdo: controle sem manchas, controle negativo, controle positivo, e conjugados de drogas. </li><li> Pipetar 50 ul de B-CCR-STB buffer de estimulação (Flow2 CAST, Bühlmann Laboratories, Schönenbuch, CH) nos frascos reservados para o controle imaculada e negativos. Como controle positivo, use 50 ul de uma solução anti-FcεRI fornecido pelo kit CAST Flow2. Adicionar as quantidades apropriadas de solução do conjugado aos frascos reservado para a conjugados de medicamentos através da criação de uma série diluição de 1:10 de 0,02 -20 mg / ml DF conjugado e PP conjugada (concentração final no ensaio de um volume de 200 mL). Estes experimentos de titulação deve ser realizada para determinar a concentração de activação de basófilos ideal para cada amostra. </li><li> Adicionar 100 mL de buffer estimulação a cada tubo e sangue de 50 mL de EDTA paciente todo. Misture as amostras com cuidado. </li><li> Pipetar 20 l Flow2 reagente coloração CAST contendo anticorpos anti-CCR3 marcado com ficoeritrina (PE) e anticorpos anti-CD63 marcado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) a cada tubo e misture novamente. Não pipetar reagentes coloração na amostra imaculada! </li><li> Incubar as amostras por 45 minutos em banho-maria a 37 ° C. </li><li> Reação de parada no gelo por 5 minutos. </li><li> Lisar eritrócitos pela adição de 2,0 ml de reagente de lise CAST Flow2 a cada frasco e vortex suavemente. Incubar as amostras no escuro por 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar amostras por 5 minutos a 500 xg eo sobrenadante cuidadosamente decantar. </li><li> Ressuspender as células em 500 mL de tampão de lavagem Flow2 CAST e armazenar em gelo até citometria de fluxo. </li><li> S Ajuste o citômetro de fluxo de tensãoettings para dispersão de frente e de lado (FSC, SSC), enquanto a aquisição da amostra imaculada. </li><li> Porta das células como linfócitos previsto da parcela SSC-FSC para a trama SSC-PE. Basófilos são identificados por um PE-anticorpo marcado anti-CCR3 como CCR3 oi SSC lo e porta-los para o enredo FITC-PE. O anticorpo anti-CD63 detectar basófilos ativados é marcado com FITC. </li><li> Definir o corte de no máximo 2,5% de basófilos CD63 como oi no controle negativo. Uma amostra é considerada positiva para a ativação de basófilos se&gt; 5% são basófilos CD63 oi eo índice médio de fluorescência (IMF) da amostra dividido pelo MFI do controle negativo superior a 2 (Figura 3). </li></ol> 4. Resultados representativos: Este experimento avalia BAT como uma ferramenta útil para detectar IgE-dependente hipersensibilidade a drogas. Conjugados de proteína de AINEs são usados ​​para a ativação de basófilos. Por HPSEC com RI e do estado de agregação de detecção UV, o grau de acoplamento, e de rendimento efetivo dos conjugados são determinados. A Figura 4 mostra como, 43,5% dos conjugados DF permaneceu monomérica com um grau de acoplamento de 5,0 DF / HSA. Para os agregados um grau de acoplamento de 9,5 foi determinado. O conjugado propyphenazone mostrou consistem em monômeros 68,5% com um grau de acoplamento de 21,2. O grau de acoplamento dos agregados foi de 27,9. No total, o grau de acoplamento determinada de conjugados DF foi de 7,6 DF e que de conjugados de PP foi de 23,2. BAT realizada com conjugados em condições otimizadas (concentração de conjugados, tempo de estimulação) permitiu a investigação da IgE-dependente reações de hipersensibilidade em AINE. Conforme mostrado na Figura 5, apenas o conjugado PP foi capaz de desencadear a activação de basófilos visualizado por uma upregulation na expressão de CD63 de superfície: 20,6% de basófilos foram ativados caracterizada por uma mudança de log-in intensidade de fluorescência. A IFM aumentou por um fator de 4,9 de 386 (controle negativo) para 1893. Em contraste, usando o conjugado DF apenas 3,1% dos basófilos foram ativadas que estava abaixo dos 5% de corte. Além disso, o IFM aumentou apenas por um fator 1,1 (limite de 2.0) a partir de 197 (controle negativo) para 210. Validade do ensaio é dado por (i) &lt;activação de basófilos 5% no controle negativo, (ii) uma mudança de log-in intensidade de fluorescência de uma subpopulação basófilos, e (iii)&gt; 50% basófilos ativados (controle positivo). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Acoplamento de derivados DF e PP para HSA. Depois de dissolver a droga, a água, MES buffer, e EDC (reagente de acoplamento) são adicionados. As amostras são agitadas durante 1 minuto antes HSA é pipetado para as soluções de drogas. Dentro de duas horas agitando à temperatura ambiente as drogas covalentemente se ligam a HSA. Monômeros, bem como agregados podem resultar. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Cálculo de graus de acoplamento. Em primeiro lugar, as constantes k RI e UV k são determinados. Portanto, HSA padrão com concentração conhecida é injetada no sistema HPSEC. (Dn / dc) e (dA / dc) de HSA são dados os valores de 0,185 e 0,518, respectivamente 5. As áreas dos picos são usados ​​para calcular as constantes. Segundo, para cada três padrões de drogas são injetadas para determinar droga e da concentração específicos e áreas de RI UV. Uma vez que o RI k e constantes UV k são conhecidos a partir das etapas acima, os derivados de drogas específicas (dn / dc) e (dA / dc) pode ser calculado. Terceiro, drogas HSA conjugados são injetadas em HPSEC. As áreas dos picos resultantes são usados ​​para calcular as concentrações de drogas e por HSA de pico, resolvendo as duas equações com duas variáveis ​​desconhecidas. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Gating Basófilo. Células previsto como linfócitos são dispersão lado gated relação ao dispersor de frente (SSC-enredo FSC). Os basófilos são identificados como CCR3 oi SSC lo a partir dos linfócitos gated (SSC-CCR3-PE enredo). Basófilos são analisados ​​para ativação (CD63 oi) na parcela CD63-FITC-CCR3-PE. O controle negativo é usado para definir o corte de no máximo 2,5% restantes basófilos CD63 oi. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Graus de acoplamento Determinado de conjugados de medicamentos. RI e os sinais UV mostram dois picos representando agregados (eluição com um volume de retenção baixa) e monômeros (eluição com um volume de retenção de altura) de drogas HSA conjugados. Percentagens de monômeros e agregados (determinado a partir de sinais de RI) e seus graus de acoplamento são retratados (n = 1). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Basófilo Activatiem teste. Resultados da droga conjugada ativado amostras, controles negativos e controles positivos são mostrados na CD63-FITC-CCR3-PE parcelas (n = 1).

<ol><li>Himly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgE-mediated+immediate-type+hypersensitivity+to+the+pyrazolone+drug+propyphenazone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">IgE-mediated immediate-type hypersensitivity to the pyrazolone drug propyphenazone.</a> J Allergy Clin Immunol. 111, 882-888 (2003).</li>
<li>Demoly, P., Pichler, W., Pirmohamed, M., Romano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+questions+in+Allergy%3A+1--drug+allergy%2Fhypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Important questions in Allergy: 1--drug allergy/hypersensitivity.</a> Allergy. 63, 616-619 (2008).</li>
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<li>Harrer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diclofenac+hypersensitivity%3A+antibody+responses+to+the+parent+drug+and+relevant+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diclofenac hypersensitivity: antibody responses to the parent drug and relevant metabolites.</a> PLoS One. 5, e13707-e13707 (2010).</li>
<li>Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography+with+on-line+light-scattering%2C+absorbance%2C+and+refractive+index+detectors+for+studying+proteins+and+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions.</a> Anal Biochem. 240, 155-166 (1996).</li>
<li>De Weck, A. L., Sanz, M. L., Gamboa, P. M., Aberer, W., Bienvenu, J., Blanca, M., Demoly, P., Ebo, D. G., Mayorga, L., Monneret, G., Sainte Laudy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+tests+based+on+human+basophils%3A+more+potentials+and+perspectives+than+pitfalls.+II.+Technical+issues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig+Allergol+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. II. Technical issues.</a> J Investig Allergol Clin Immunol. 18, 143-155 (2008).</li>
<li>Ebo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-assisted+allergy+diagnosis%3A+current+applications+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives.</a> Allergy. 61, 1028-1039 (2006).</li>
<li>Poulsen, L. K., Quan, S., Kragh, C., Platzer, M. H., Skov, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basophil+granulocyte+in+allergic+reactions%3A+experimental+models+and+their+use+for+the+identification+of+drugs+with+effects+or+side+effects+on+basophils%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem+-+Anti-inflammatory+%26+Anti-Allergy+Agents%22%5BJournal%5D)">The basophil granulocyte in allergic reactions: experimental models and their use for the identification of drugs with effects or side effects on basophils.</a> Curr Med Chem - Anti-inflammatory & Anti-Allergy Agents. 3, 167-180 (2004).</li>
<li>Sanz, M. L., Gamboa, P., de Weck, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+combined+test+with+flowcytometric+basophil+activation+and+determination+of+sulfidoleukotrienes+is+useful+for+in+vitro+diagnosis+of+hypersensitivity+to+aspirin+and+other+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">A new combined test with flowcytometric basophil activation and determination of sulfidoleukotrienes is useful for in vitro diagnosis of hypersensitivity to aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Int Arch Allergy Immunol. 136, 58-72 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

BAT é um bem estabelecida, embora ainda não utilizado rotineiramente método para diagnóstico de IgE mediada doença alérgica 6,7. Para hipersensibilidade a drogas, no entanto, sua aplicabilidade é comprometida, como compostos de baixo peso molecular não são capazes de receptores IgE crosslink, um pré-requisito para a ativação de basófilos 8. Portanto, as drogas sob investigação precisam ser covalentemente acoplado a proteínas de transporte adequado (por exemplo HSA). Importante, o grau de acoplamento (ie número de moléculas de droga por proteína transportadora) precisa ser controlada para garantir a atividade imunológica (ie receptor IgE cross-linking) de conjugados. Teoricamente, dois haptenos por molécula transportadora deve ser suficiente para o receptor de IgE de ligação cruzada e apenas cinco moléculas DF por HSA foram mostrados para desencadear a liberação de mediador em um ensaio baseado em células 4. Ambos os conjugados, PP-HSA e DF-HSA, foram determinados para mostrar um grau suficientemente elevado de acoplamento (HPSEC) e ser imunologicamente ativas tornando-os reagentes adequados para uso em BAT. Outro problema pode ser que os metabolitos de drogas pode ter um papel, como um metabólito em vez do fármaco pode causar a reação de hipersensibilidade. No caso do DF, essa possibilidade tem sido avaliada em detalhes anteriormente usando cinco principais Fase I metabólitos e uma variante de ligação 4. Fatores importantes para dominar a técnica descrita incluem a qualidade da amostra de sangue (&lt;12 horas desde a coleta de sangue, número de basófilos detectado&gt; 500) e otimização das condições de estimulação (dose, tempo). Além disso, os chamados não-respondedores, que nem sequer reagem com o controle positivo (anticorpos dirigidos contra o receptor IgE) têm de ser identificados. Portanto, critérios de validação tem que incluir um anticorpo anti-FcεRI como controle positivo. Uma vantagem importante do uso de conjugados de medicamentos é o fato de que eles parecem não tóxicos, em contraste com as drogas pura, como mostra a DF-HSA conjugado por co-estimulação com anticorpo anti-FcεRI na BAT 4. Pure DF, em contraste, exibe efeitos citotóxicos em uma concentração de 1,25 mg / ml causando problemas com a interpretabilidade da BAT 9. Geralmente, testes para citotoxicidade potencial é fortemente recomendado para cada conjugado droga recém-produzidos. Aqui, nós mostramos o potencial do PP-HSA conjugado usado em BAT para revelar hipersensibilidade mediadas por IgE. Em contraste, DF hipersensibilidade não está associada com IgE demonstrado pela falta de ativação de basófilos em resposta a DF-HSA conjugado. Importante, em caso de incerteza sobre um mecanismo IgE mediada, conjugados têm de ser avaliados para a atividade imunológica por ensaio in vitro em sistemas baseados em células como tem sido demonstrado por DF 4. Usando a configuração descrita de conjugar baixo peso molecular drogas covalentemente a proteína transportadora adequada moléculas uma série de reações de hipersensibilidade à droga, incluindo antibióticos, outros AINEs, radiocontrast mídia, relaxantes musculares, anestésicos, etc pode ser investigado por um envolvimento de uma mediada por IgE mecanismo. Assim, BAT pode servir como um complemento para os métodos existentes para o diagnóstico (teste cutâneo, o teste de provocação oral).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente / dispositivo </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> 2 - (N-Morfolino) etanosulfónico </td><td> Sigma </td><td> M3671 </td><td> - </td></tr><tr><td> 7,8 x 300 mm TSK Gel -G2000SWXL coluna </td><td> Tosoh Bioscience </td><td> 08540 </td><td> - </td></tr><tr><td> BD FACSCanto II </td><td> Becton Dickinson </td><td> 338962 </td><td> - </td></tr><tr><td> Centrífuga de bancada </td><td> Sigma </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Diclofenaco de sódio </td><td> Sigma </td><td> D6899 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA-Vacutainer </td><td> Becton Dickinson </td><td> 368589 </td><td> - </td></tr><tr><td> Flow2 Kit CAST </td><td> Bühlmann Laboratories </td><td> FK-CCR </td><td> Kit CAST eficazes 14 de junho de 2011 Flow2 agora é CAST Fluxo </td></tr><tr><td> HP1100 sistema HPLC </td><td> Hewlett Packard </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Albumina de soro humano </td><td> Sigma </td><td> A9511 </td><td> - </td></tr><tr><td> Centrifugadora de laboratório </td><td> Eppendorf </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> N-etil-N&#39;-(3-dimetilaminopropil) cloridrato de carbodiimida (EDC) </td><td> Sigma </td><td> E6383 </td><td> - </td></tr><tr><td> Comprimidos PBS </td><td> AppliChem </td><td> A9199 </td><td> - </td></tr><tr><td> Derivados Propyphenazone </td><td> Departamento de Biologia Molecular, Universidade de Salzburg, Áustria </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Sacudidor </td><td> Eppendorf </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Azida de sódio </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td> - </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio (NaCl) </td><td> Sigma </td><td> S1679 </td><td> - </td></tr><tr><td> Bicarbonato de sódio </td><td> Sigma </td><td> 90421C </td><td> - </td></tr><tr><td> Hidróxido de sódio </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td> - </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio </td><td> Sigma </td><td> 342483 </td><td> - </td></tr><tr><td> Conjunto detector triplo </td><td> Viscotek </td><td> TDA302 </td><td> - </td></tr><tr><td> BioVortex pessoal V-1 mais </td><td> Peqlab </td><td> 90-V-1 </td><td> - </td></tr><tr><td> Banho-maria 1012 </td><td> GFL </td><td> 1012 </td><td> - </td></tr></tbody></table>

basófilos teste de ativação de investigação de ige-mediada mecanismos hipersensibilidade a drogas

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

Reações de hipersensibilidade contra os não-esteróides anti-inflamatórios não esteróides (AINE), como propyphenazone (PP) e diclofenaco (DF) pode se manifestar como Tipo I-como reações alérgicas 1. Na prática clínica, o diagnóstico de hipersensibilidade a drogas é realizado principalmente pelo histórico do paciente, como testes de pele não é de confiança e testes de provocação oral tem risco de vida riscos para o paciente 2. Daí, a evidência de uma pathomechanism IgE mediada subjacente é difícil de obter. Aqui, apresentamos um método in vitro baseado no uso de basófilos humano, derivados de drogas pacientes hipersensíveis que imita a reação alérgica efetoras in vivo. Como basófilos de drogas pacientes alérgicos transportar moléculas de IgE específica para a droga culpado, eles se tornam ativados durante a IgE crosslinking receptor e liberar alérgica moléculas efetoras. A ativação de basófilos pode ser monitorado pela determinação da expressão de CD63 upregulation de superfície por citometria de fluxo 3. No caso de drogas baixo peso molecular, conjugados são projetados para permitir IgE crosslinking receptor em basófilos. Como mostrado na Figura 1, dois representantes de AINEs, PP e DF, são covalentemente ligado à albumina sérica humana (HSA), através de um grupo carboxila reagem com o grupo primário amino de resíduos de lisina. DF transporta um grupo carboxila intrínseca e, portanto, pode ser usado diretamente 4, enquanto um grupo carboxila contendo derivados do PP teve de ser sintetizada organochemically antes do estudo 1. O grau de acoplamento dos compostos de baixo peso molecular da molécula de proteína transportadora e sua distribuição espacial é importante para garantir crosslinking de duas moléculas de receptor IgE. O protocolo aqui descrito aplica-se cromatografia de exclusão de alto desempenho de tamanho (HPSEC) equipado com um índice de refração seqüencial (RI) e ultra-violeta (UV) sistema de detecção para a determinação do grau de acoplamento. Como a metodologia descrita pode ser aplicada para outras drogas, o teste de activação de basófilos (BAT) tem o potencial para ser utilizado para a determinação de IgE mediada por mecanismos de hipersensibilidade a drogas. Aqui, nós determinamos como PP hipersensibilidade mediadas por IgE e hipersensibilidade DF como não-IgE mediada pela BAT.

Basófilos teste de ativação é uma potente ferramenta para a detecção de IgE-dependente alergias<em&gt; In vitro</em&gt;. Aqui, um protocolo otimizado para a ativação de basófilos teste é utilizado para investigar hipersensibilidade a drogas. Um método para a produção eficiente de drogas covalente de proteínas e seus conjugados de caracterização físico-química é descrito.

Basófilos Teste de ativação de Investigação de IgE-mediada Mecanismos Hipersensibilidade a Drogas

Reações de hipersensibilidade a anti-inflamatórios não esteroides (AINEs), como a propifenazona (PP) e o diclofenaco (DF), podem manifestar-se como reações semelhantes ao Tipo I...

O objetivo geral do experimento a seguir é detectar a hipersensibilidade mediada por IgE a medicamentos por meio do teste de ativação de basófilos, utilizando conjugados bem caracterizados de proteína transportadora de droga com HAP. Isso é alcançado primeiramente ligando quimicamente uma droga, por meio de um grupo carboxila intrínseco ou introduzido organoquimicamente, aos resíduos de lisina do albúmina sérica humana. Em segundo lugar, os conjugados são caracterizados fisicoquimicamente para determinar o grau exato de acoplamento mediante a realização de cromatografia de exclusão por tamanho de alta eficiência ou H-P-S-E-C, com detecção sequencial por índice de refração e ultravioleta.Em seguida, os conjugados de fármacos bem caracterizados são utilizados para estimular basófilos de doadores com hipersensibilidade a fármacos. Em última análise, o teste de ativação de basófilos ou BAT pode ser usado para avaliar mecanismos mediados por IgE na hipersensibilidade a fármacos. Meu nome é Michael Steiner, do Grupo de Pesquisa em Alergia da Universidade de Salzburgo, na Áustria.Hoje gostaríamos de apresentar a vocês uma técnica que permite avaliar o envolvimento de anticorpos IgE específicos para fármacos nas reações de hipersensibilidade a medicamentos. Aqui, demonstramos o procedimento utilizando dois representantes amplamente utilizados de fármacos anti-inflamatórios não esteroides, a saber, propofol e diclofenaco. No entanto, o método possui potencial para ser utilizado no diagnóstico rotineiro de alergias imediatas a medicamentos.De modo geral, adicione 10 microlitros de uma solução estoque recém-preparada de cloreto de N-etil, N’-trimetilaminopropil-carbodiimida, ou EDC, à amostra de propafenona ou PP. Vortexe a amostra por um minuto. Em seguida, adicione 16,9 microlitros de solução de albúmina sérica humana ou HSA com concentração de 118 miligramas por mililitro à amostra e, então, incube a amostra por duas horas à temperatura ambiente, sob agitação a 300 rotações por minuto.Após a conclusão da agitação, realize uma diálise das amostras três vezes contra dois litros de PBS, por várias horas cada, a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugue as amostras por 10 minutos à temperatura ambiente a 14.000 vezes G e colete o sobrenadante S contendo os AINEs conjugados à HSA. Verifique a presença de proteínas no sobrenadante realizando uma eletroforese em gel de SDS usando géis a 12%.Carregando cerca de 12 microgramas de conjugado de HSA em uma única faixa do gel para análise da taxa de acoplamento dos conjugados de AINE por cromatografia de exclusão por tamanho de alta eficiência ou H-P-S-E-C. Primeiro, dilua a amostra padrão de HSA até uma concentração de um miligrama por mililitro em água desmineralizada. Para calibração do detector, injete 50 microlitros da solução padrão de HSA.Em seguida, utilizando uma coluna TSK gel, G 2000 SSW XL de 7,8 por 300 milímetros e um sistema acoplado online de índice de refração ou RI e detector UV. Calcule a constante de RI (caso sub RI) e a constante UV (K sub UV) para o detector. Usando essas duas fórmulas, dilua padrões derivados de PP para H-P-S-E-C em água desmineralizada em quantidades animais de cinco, 10 e 30 para facilitar a injeção, e então calcule os valores médios de DN por DC da droga e DA por DC da droga para ambos os padrões.Utilizando essas duas fórmulas, injete agora os conjugados do fármaco no H-P-S-E-C e determine as áreas dos picos de RI e UV. Em seguida, usando as mesmas duas equações, calcule a concentração dos derivados de PP e da HSA para as amostras desconhecidas. Primeiro, rotule sete frascos de citometria de fluxo de acordo com seu conteúdo: controle não corado, controle negativo, controle positivo e conjugados do fármaco.Em seguida, pipete 50 microlitros de tampão de estimulação de basófilos nos frascos reservados para a amostra não corada e controle negativo. Adicione 50 microlitros da solução anti FC épsilon R um do kit de citometria dois fluxos ao frasco do controle positivo. Agora, adicione 0,02 a 20 microgramas por mililitro do conjugado PP aos frascos de conjugado com o fármaco em uma série de diluição de um para 10 e, em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de estimulação e 50 microlitros do sangue total com EDTA do paciente a cada tubo.Misture cuidadosamente as amostras. Em seguida, pipete 20 microlitros do fluxo. Adicione dois reagentes de coloração contendo anticorpos anti-CCR3 marcados com PE e anticorpos anti-CD63 marcados com ZI a cada um dos tubos de conjugado com fármaco, controle positivo e controle negativo, e misture.Novamente, incube as amostras por 45 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius. Em seguida, para interromper a reação, coloque as amostras em gelo por cinco minutos. Depois, lise os eritrócitos adicionando dois mililitros do reagente lisante Flow 2 Cast a cada frasco. Incube as amostras no escuro por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, após a centrifugação das amostras por cinco minutos a 500 vezes G à temperatura ambiente, remova cuidadosamente o sobrenadante e re-suspenda as células em 500 microlitros de tampão de lavagem para citometria de fluxo, mantendo as amostras no gelo até a análise por citometria de fluxo.Utilize a amostra não corada para ajustar as configurações de voltagem do citômetro de fluxo. Em seguida, selecione as células previstas como linfócitos dentro do gráfico de dispersão lateral versus dispersão frontal. Semelhante a esta figura de exemplo, os basófilos são inicialmente identificados como CCR três alto e dispersão lateral baixo.Semelhante a este gráfico de dispersão. Após o direcionamento das células no gráfico EPE ajustado, os basófilos ativados podem ser ainda mais identificados pela sua expressão de positividade para CD63 marcado com FITC. Após definir o ponto de corte como um máximo de 2,5% dos basófilos como CD63 alto no controle negativo, uma amostra pode ser considerada positiva para ativação de basófilos se mais de 5% dos basófilos forem CD63 alto e o valor de MFI da amostra dividido pelo MFI do controle negativo exceder dois.Este método avalia o uso do bat como uma ferramenta útil para detectar proteínas de hipersensibilidade a medicamentos dependentes de IgE. Conjugados de AINEs são utilizados para ativar basófilos por H-P-S-E-C com detecção de agregação por RI e UV. O grau de acoplamento e o rendimento eficaz dos conjugados são determinados conforme ilustrado nesta figura.43,5% dos conjugados de DF permaneceram monoméricos com um grau de acoplamento de 5,0 DF por HSA para os agregados. Um grau de acoplamento de 9,5 foi determinado conforme mostrado aqui. O conjugado PPP mostrou consistir de 68,5% de monômeros com um grau de acoplamento de 21,2.O grau de acoplamento dos agregados foi de 27,9. No total, o grau de acoplamento determinado dos conjugados DF foi de 7,6 df e o dos conjugados PPP foi de 23,2. O teste BAT realizado com os conjugados em condições otimizadas permite investigações de reações dependentes de IgE na hipersensibilidade a AINEs.Como mostrado aqui, apenas o conjugado PP foi capaz de induzir a ativação de basófilos, visualizada por uma superexpressão na expressão da superfície do CD63. 20,6% dos basófilos foram ativados, caracterizados por um aumento na intensidade de fluorescência, e a intensidade média de fluorescência (MFI) aumentou em um fator de 4,9, passando de 386 no controle negativo para 1893.Em contraste, utilizando o conjugado DF, apenas 3,1% dos basófilos foram ativados, o que estava abaixo do limite de corte de 5%. Além disso, o MFI aumentou apenas por um fator de 1,1, passando de 197 no controle negativo para 210. A validade do ensaio é comprovada por uma ativação de basófilos inferior a 5% no controle negativo.Dois, um desvio no deslocamento do logaritmo da intensidade de fluorescência de uma subpopulação de basófilos e três, mais de 50% de basófilos ativados para o controle positivo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar testes de ativação de basófilos e, mais importante, de como diferenciar reações de hipersensibilidade a medicamentos mediadas por IgE das não mediadas por IgE. Além disso, você deverá compreender como ampliar a aplicabilidade do teste de ativação de basófilos para alergias a medicamentos, além de seu uso já estabelecido nas alergias a pólen, alimentos e insetos Eno.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Modelos de ratos experimentais de asma alérgica oferecer novas possibilidades para o estudo da patogênese da doença eo desenvolvimento de novas terapêuticas. Estes modelos são bem adequados para factores de medição que regulam a resposta imune alérgica, inflamação das vias aéreas, e fisiopatologia pulmonar.

Modelo murino de asma induzida alergénio

Neste vídeo, descrevemos um método in vitro para avaliar o potencial alérgico de um antígeno para induzir a degranulação de basófilos. A β-hexosaminidase é usada como um índice de liberação de mediadores químicos, e a atividade enzimática da β-hexosaminidase é medida usando um substrato fluorogênico.

Ensaio de Liberação de Enzima Mediadora Humanizada: Um Método Imunoquímico para Rastrear o Potencial Alérgico do Antígeno de Teste Monitorando a Resposta de Degranulação de Basófilos In Vitro

Neste vídeo, demonstramos o teste para avaliar a ativação de basófilos na presença de um alérgeno de teste usando citometria de fluxo.

Analisando a ativação de basófilos na presença de um alérgeno de teste usando citometria de fluxo

Este vídeo demonstra um protocolo para detectar imunoglobulina E específica do soro usando um sistema de quimioluminescência baseado em cartucho microfluídico. As IgE séricas interagem com alérgenos distintos imobilizados na zona de reação do cartucho, que são posteriormente detectados com anticorpos anti-IgE conjugados com peroxidase e um substrato quimioluminescente, permitindo a detecção simultânea de múltiplas IgEs específicas para alérgenos.

Um sistema de detecção baseado em cartucho microfluídico para imunoglobulina E específica para alérgenos

As reações alérgicas, caracterizada pela ativação de mastócitos e basófilos, são movidos pela ligação cruzada de IgE e liberação de mediadores pró-inflamatórios. A avaliação quantitativa da resposta alérgica pode ser conseguido através de corante azul de Evans para monitorar alterações na permeabilidade vascular após o desafio alérgeno.

Medindo Anafilaxia locais em Ratos

A análise in vitro da recombinação de troca de classe em camundongos é desafiadora devido às moléculas de IgE citofílicas ligadas aos receptores Fc na superfície das células B.  Descrevemos um método para detecção de IgE usando clivagem mediada por tripsina de IgE ligada à superfície antes da fixação e permeabilização para coloração de fluorescência citoplasmática.

Detecção de True IgE-expressando Rato B células da linhagem

Este trabalho descreve um protocolo que utiliza uma abordagem resolvida por componentes para estudar a sensibilização para alérgenos do pólen em uma coorte de pacientes do sul da China com rinite alérgica e / ou asma.

Uma abordagem de diagnóstico resolvida por componente para um estudo sobre alergênios de pólen de grama em sulistas chineses com rinite alérgica e / ou asma

Este trabalho apresenta um protocolo para a detecção de imunoglobulina soro específico E com um sistema de cartucho-baseado da quimioluminescência microfluídicos e a avaliação de sua utilidade no diagnóstico de alergia.

Aplicação da tecnologia de Microfluidic Biochip para detectar soro alérgeno-específicas E de imunoglobulina (sIgE)

O teste de ativação basófila é um teste complementar de diagnóstico in vitro para a avaliação de reações alérgicas mediadas por IgE com base na detecção de ativação basofílica na presença de um estímulo específico através da medida de marcadores de ativação por citometria de fluxo.

Teste de ativação basófila para diagnóstico de alergia

Aqui apresentamos o ensaio de liberação do mediador, usando uma linha celular de leucemia basofílica de rato transfeminada com o receptor IgE humano, para simular a desgranulação de células efeitos tipicamente observadas em reações alérgicas tipo 1. Este método investiga a atividade biológica dos alérgenos de forma altamente sensível, reprodutível e adaptável.

Ensaio de liberação de mediador humanizado como um read-out para potência alergênico

Aprenda o teste de ativação de basófilos para investigar hipersensibilidade a drogas mediada por IgE usando conjugados droga-proteína caracterizados. Este método otimizado auxilia no diagnóstico de alergias medicamentosas.

Basófilos Teste de ativação de Investigação de IgE-mediada Mecanismos Hipersensibilidade a Drogas

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