Um método para Etiquetagem Vascularização no embrião do rato

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar os efeitos de mutações genéticas específicas no desenvolvimento e na estrutura vascular. Isso é alcançado mediante a dissecação do embrião e dos tecidos extraembrionários em conjunto, a fim de obter uma amostra adequada para injeção. Em seguida, a veia facial é injetada com um corante fluorescente para marcar a vasculatura intacta.

Em seguida, o embrião é preparado para análise. Por fim, montagens em lâmina ou seções da vasculatura marcada são utilizadas para gerar imagens que mostram a estrutura tridimensional da vasculatura normal com base na microscopia de imunofluorescência de montagens inteiras ou de seções de tecido. Tive pela primeira vez a ideia deste método quando estava interessado em determinar o ponto temporal do desenvolvimento em que a vasculatura periférica se conecta ao timo por meio da angiogênese.

Para começar, prepare o dextrano FXI ou o GS L um, I selectina B quatro em PBS em um tubo eppendorf de 1,5 mililitro, adicione 100 microlitros do estoque de verde rápido 1,25 milimolar em PBS ao dextrano FTSE, ou 180 microlitros ao GS L um. I selectina B quatro, de modo que as soluções fiquem visivelmente azuis. Em seguida, aqueça o tubo a 37 graus Celsius.

Disseque embriões de E 14,5 a E 18,5 junto com os sacos vitelinos, mantendo o pedículo umbilical intacto. Transfira os embriões para uma nova placa de Petri e imerja-os em PBS à temperatura ambiente. Em seguida, posicione um embrião para obter uma visão sagital do rosto.

Em seguida, com pinças de dissecação microcirúrgicas, segure suavemente o embrião pela cabeça. Usando uma agulha de calibre 30, injete 50 microlitros de dextrano FXI ou GS L um seletina B quatro na veia facial, orientando a agulha em direção à parte posterior da cabeça. Quando o corante for visível na veia umbilical, remova a agulha e separe o embrião do lan.

Deixe o embrião permanecer em PBS à temperatura ambiente por dois a três minutos para que o corante circule por todo o embrião. Após a circulação do corante por todo o embrião, remova amostras da pele das regiões dos membros, costas e estômago.

Lave as amostras de pele em PBS frio e fixe-as em PBS com 4% de paraformaldeído por duas horas. Em seguida, lave-as três vezes por 10 minutos cada em frascos transparentes de quatro mililitros com dois mililitros de PBS frio. Coloque as amostras de pele em lâminas de microscópio e adicione 100 microlitros de meio de montagem e uma lamínula a cada lâmina.

Deixe os lâminas secarem no escuro antes da imagem; a clareza em BABB e a subsequente imagem confocal podem ser realizadas para obter imagens de maior resolução da vasculatura da pele. Para preparar os tecidos para criosecção, congele rapidamente embriões inteiros em nitrogênio líquido para criosecção. Espalhe OCT sobre um bloco de seção e monte o embrião.

Corte o tecido congelado em seções de 10 mícrons de espessura e colete-as em lâminas. Fixe as seções em acetona por cinco a dez minutos, depois lave-as três vezes em TBS frio com bloqueio em soro de jumento a 10% em TBS em uma câmara úmida. À temperatura ambiente, adicione 100 microlitros de anticorpo primário a cada seção.

Neste exemplo, utilizamos o anticorpo rat anti-US CD31 para marcar o endotélio e o anticorpo goat anti-US P-D-G-F-R beta para marcar as células perivasculares, a fim de garantir que o anticorpo esteja uniformemente distribuído na seção. Cubra as lâminas com tiras individuais de filme parafilm cortadas. Incube as lâminas por uma hora até a noite toda em câmara úmida a quatro graus Celsius.

Em seguida, lave as seções três vezes em TBS frio. Incube com 100 microlitros dos anticorpos secundários apropriados por um mínimo de 30 minutos. Por fim, lave três vezes em TBS frio, adicione 100 microlitros de meio de montagem e uma lamínula a cada lâmina.

Deixe os lâminas secarem no escuro. Para o corte em vibrosserrote, dissecar os lobos do timo de embriões e lavar em PBS frio. Fixar o tecido em PBS com 4% de paraformaldeído à temperatura ambiente por duas horas.

Após lavar as amostras em PBS Triton X, preencha um pequeno cartucho plástico com agarose de baixo ponto de fusão a 4%. Submerja as amostras no agarose em PBS, certificando-se de que o tecido esteja em contato com o fundo do cartucho. Deixe o agarose solidificar em gelo.

Em seguida, use uma lâmina de barbear para cortar o excesso de agros. Aplique cola no bloco VIBRAM e adira a amostra ao bloco. Despeje PBS frio na cuba d'água Vibram até que a amostra e a lâmina fiquem imersas.

Defina a velocidade e a amplitude. A amplitude deve ser reduzida. Se as seções se desfizerem devido à agitação excessiva, corte 50 seções de tecido.

Em seguida, utilizando pinças, transfira os cortes para PBS frio em uma placa microliter de 24 poços. Bloqueie os cortes em 500 microlitros de soro de jumento a 10% em PBS com Triton X durante 30 minutos. Após a adição de anticorpos primários, como anti-CD31 e anti-P-D-G-F-R beta, incube por oito horas até a noite em uma placa microliter tampada a quatro graus Celsius. Em seguida, lave três vezes em PBS com Triton X ao longo de um total de oito horas a quatro graus Celsius.

Após bloquear novamente as seções e incubá-las em anticorpos secundários, lave as amostras três vezes em PBS Triton X durante um total de oito horas a quatro graus Celsius. Em seguida, refixe as amostras em PBS com 4% de paraformaldeído por 30 minutos no gelo e lave mais três vezes em PBS Triton X durante 30 minutos no gelo. Desidrate as amostras por meio de uma série graduada de metanol em PBS Triton X por 10 minutos em cada etapa.

Em seguida, substitua o metanol a 100% por metanol fresco e incube por uma hora à temperatura ambiente. Coloque a amostra em uma lâmina de vidro com depressão e cubra a amostra com uma solução de BABB e metanol na proporção um para um. Incube as amostras por 10 a 15 minutos.

Em seguida, substitua a solução por BABB 100% e incube à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos ou até ficar transparente. Adicione uma lamínula e feche com duas a três camadas de esmalte. Deixe o esmalte endurecer no escuro à temperatura ambiente.

A amostra pode ser armazenada a quatro graus Celsius, mas você deve capturar as imagens entre 12 e 24 horas. Imagem de seções congeladas de 10 mícrons com um microscópio confocal usando o objetivo plan A per chromat 20 vezes 0,8 com linhas a laser de 6 33 4 88 e 5 43 nanômetros; adquira seções Z confocais de um mícron de seções embutidas em aros de 50 mícrons usando o objetivo plan A per chromat 10 x 0,4 com linhas a laser de 4 88 5 43 e 6 33 nanômetros; reconstrua seções Z seriadas usando o software de análise de imagem Zeiss AIA vision 4.6 ou outro equivalente. A marcação eficiente da vasculatura embrionária é fundamental para avaliar defeitos nos vasos sanguíneos em camundongos embrionários. Essas figuras mostram marcação específica dos vasos sanguíneos do timo em E 16,5 e marcação conjunta de G S L um e selectina.

B quatro embriões injetados com CD 31, bem como coloração dos ventrículos direito e esquerdo. O protocolo GSL um I selectina B quatro para cortes criostáticos foi utilizado nestes experimentos. A marcação em montagem inteira da rede de vasos sanguíneos da pele em camundongos E 16,5 é mostrada aqui após este procedimento.

Outros métodos, como a marcação simultânea de células estromais e células sanguíneas com o sistema vascular, podem ser utilizados para responder perguntas adicionais, como: Como as células sanguíneas e as células estromais interagem com o sistema vascular no embrião de camundongo sob condições normais e patológicas?