Gravação em grande escala Ensembles Neuronal com Sondas Silício na rato anestesiado

O objetivo geral deste procedimento é descrever uma gravação neuronal aguda em larga escala, simultaneamente nas cortes somatossensoriais dos membros anteriores esquerdo e direito, em uma rata anestesiada utilizando uma sonda de silício. Isso é realizado primeiramente anestesiando o animal com urétano e, posteriormente, posicionando a rata no estereotáxico para fazer uma incisão de dois a três centímetros sobre o crânio. O segundo passo é posicionar os parafusos de terra e referência.

Em seguida, são realizadas duas craniotomias acima das cortes somatossensoriais e a dura-máter é removida. O passo final consiste em introduzir cuidadosamente as sondas de silicone no cérebro e abaixá-las lentamente até a área desejada. Este procedimento permite o registro de potenciais de campo locais e atividade de disparo de dezenas de neurônios.

A principal vantagem dessa técnica é que as sondas de silicone permitem registrar um grande número de sítios de gravação. Além disso, múltiplos sítios de gravação podem ser dispostos ao longo de distâncias de milímetros, possibilitando a aquisição simultânea em múltiplas colunas corticais ou em múltiplas camadas de uma única coluna cortical. Importante, a distribuição geometricamente precisa dos sítios de gravação permite investigar as relações espaciais entre populações neuronais.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neurociência, como a forma como a atividade da população neuronal está envolvida na plasticidade da memória, no codificação de estímulos, na tomada de decisões, bem como a maneira como essas interações neurais são afetadas por diferentes fármacos. Para iniciar este procedimento, anestesie a rata com iso fluorina numa concentração de 3 a 4% e mantenha em 2% para evitar que o animal fique estressado durante a injeção. Em seguida, injete 7,5 mililitros por quilograma de solução de uretano diluída a 20% por via intraperitoneal, dividindo esta injeção em quatro aplicações separadas por intervalos de aproximadamente 30 minutos.

Em seguida, limpe as sondas de silicone com água destilada sob o microscópio. Pinte as sondas com um marcador fluorescente para assinalar as posições das sondas na análise histológica. Este procedimento deve ser sempre realizado sob o microscópio para garantir que as sondas não sejam danificadas ou entortadas.

Após isso, depile o pêlo ao longo do local da incisão. Em seguida, aplique pomada em ambos os olhos. Administre cinco miligramas por mililitro de dexametasona por via subcutânea para reduzir a inflamação cerebral.

Neste momento, fixe o animal no estereotáxico. Em seguida, prepare o local cirúrgico de forma asséptica utilizando sabão de clorexidina e etanol antes de fazer a incisão; administre lidocaína e epinefrina por via subcutânea no local da incisão para anestesia local e para reduzir o risco potencial de sangramento. Em seguida, faça uma incisão de dois centímetros ao longo da linha média do couro cabeludo e remova a pele.

Para expor o crânio, remova o couro cabeludo dorsal da fáscia por dissecação romba e controle o sangramento usando cera óssea. Em seguida, faça dois orifícios no osso occipital do crânio. Fixe os pequenos parafusos nos orifícios para os eletrodos de referência e de terra.

O parafuso de referência deve estar em contato com a dura-máter. Em seguida, faça duas craniotomias de um a dois milímetros de diâmetro nas coordenadas correspondentes à região do membro anterior. Cortices somatossensoriais.

Use ar comprimido para remover o pó ósseo conforme necessário durante a craniotomia, a fim de evitar o aquecimento do crânio provocado pela perfuração. Aplique gotas de solução salina. Em seguida, construa uma pequena barreira de resina acrílica ao redor das duas craniotomias para manter o PBS sobre a dura exposta e impedir que ela seque.

Aplicar PBS constantemente durante todo o experimento. Em seguida, usar duas agulhas de 30 e meia polegadas com pontas curvadas para remover a dura-máter de ambas as craniotomias. Neste momento, posicionar as pontas das sondas de silício em contato com a pia.

Em seguida, introduza lentamente as sondas de silício, certificando-se de que seus cabos possam ser inseridos no cérebro sem resistência ou dobrar. Abaixe cuidadosamente as sondas até que atinjam as áreas de gravação desejadas. Se necessário, adicione gotas de PBS sobre as craniotomias para evitar que o tecido seque.

É mostrado aqui um registro eletrofisiológico representativo do potencial de campo local durante 500 milissegundos a partir de um tetro. Um exemplo da forma de onda do pico está mostrado na inserção. Abaixo estão exemplos das vistas bidimensionais de agrupamentos de unidades obtidos a partir de um tetro.

Cada agrupamento representa os potenciais de ação de um único neurônio. As formas de onda médias dos potenciais de ação das unidades representativas em cada um dos quatro canais de um único tetrode são mostradas aqui. A energia da forma de onda dos potenciais de ação registrados ao longo do tempo é representada neste gráfico.

Observe que o valor de energia relativamente constante para cada unidade indica uma gravação estável ao longo do período exibido. Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de realizar gravações com sondas de silício em múltiplas áreas cerebrais a partir de mais de cem neurônios simultaneamente. Isso é alcançado completando os seguintes passos: anestesiar o animal, posicionar os parafusos de referência e de terra, realizar as craniotomias, remover a dura-máter e, finalmente, inserir as sondas na área de gravação desejada.