Name: Genome-wide tela de Metas de miRNA Usando a missão Biblioteca ID Alvo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprenda a realizar triagem genômica de alvos de miRNA usando a biblioteca Target ID em linhagens celulares estáveis. Este método permite identificar interações específicas de microRNAs por sequenciamento profundo.

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Agradecemos toda a vida Sigma Ciência Missão Alvo ID equipe de desenvolvimento da biblioteca, especialmente Kevin Gutshall para encontrar a tecnologia e negociar os termos de licença e Heather Holemon por seu apoio e participação nas discussões de problemas frutíferas. Agradecemos também a Dr. Joop Gäken de Faculdade Londres do rei para livremente compartilhar os resultados inéditos e sugestões, e Qazi Hamid RxBiosciences para a preparação de um lote grande de cDNA e sua persistência em consegui-lo clonado. Nós gostaríamos de agradecer Nan Lin e Scott Bahr de SAFC para a realização de arranjos de cDNA e análise de dados. MISSÃO é uma marca registrada da LP Biotecnologia Sigma-Aldrich

<ol><li>Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.sigma-aldrich.com">http://www.sigma-aldrich.com</a> (2012).</li>
<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li>
<li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li>
<li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li>
<li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li>
<li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+microRNAs%3A+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).</li>
<li>Thomas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperately+seeking+microRNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Desperately seeking microRNA targets.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).</li>
<li>Baek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).</li>
<li>Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).</li>
<li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+invasion+and+metastasis+initiated+my+microRNA-10b+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer.</a> Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).</li>
<li>Visone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-221+and+miR-222%2C+both+overexpressed+in+human+thyroid+papillary+carcinomas%2C+regulate+p27Kip1+protein+levels+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle.</a> Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-21+promotes+cell+transformation+by+targeting+the+programmed+cell+death+4+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene.</a> Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).</li>
<li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+noncoding+RNA%2C+miR-126%2C+suppresses+the+growth+of+neoplastic+cells+by+targeting+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+and+is+frequently+lost+in+colon+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chrom.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers.</a> Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li>
<li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li>
<li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 Forthcoming.</li>
<li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620(2009).</li>
<li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8%2F200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li>
<li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP%5BTitle%5D)+AND+%22L.+EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li>
<li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram relações financeiras com entidades comerciais que tenham interesse no trabalho apresentado.

microRNAs são RNAs de 20-24 nucleotídeos que regulam a expressão gênica pós-transcricional pela tradução do mRNA inibição e, freqüentemente, desestabilizar o mRNA alvo (revisto em [6]). Um único miRNA pode regular várias centenas de mRNAs para controlar a resposta de uma célula a sinais ambientais e de desenvolvimento. Identificação e validação de mRNAs alvo é essencial para determinar o papel de um miRNA e função nestas vias. No entanto, a identificação do alvo não é simples porque, em animais, miRNAs e seus locais-alvo não são totalmente complementares. A &quot;semente&quot; região, baseia 2 a 7 a partir da extremidade 5 &#39;da miRNA, é geralmente complementar aos seus alvos. No entanto, existem muitas exceções à regra de sementes, ea jusante emparelhamento de bases pode compensar uma correspondência semente imperfeita. Um certo número de algoritmos de computador têm sido desenvolvidos para prever alvos miRNA baseado em correspondência de sementes e de compensação a jusante, uma estrutura alvoposição d, conservação da sequência, e vários outros parâmetros que têm sido observados para alvos validados experimentalmente (revisto em [7]). Enquanto in silico previsões são convenientes e se identificam muitos alvos miRNA válidos, a maioria previu genes falhar os testes de validação experimental, e muitos alvos reais não são previstos. Além disso, desde algoritmos de computador são baseados em características-alvo previamente determinados, eles não permitem a descoberta de alvos que se afastam do que já é conhecido. Um certo número de sistemas experimentais têm sido utilizados com sucesso para identificar ou descobrir alvos miRNA funcionais em células vivas. Estes métodos de rastreamento globais incluem microarrays e sequenciamento de RNA, RNA co-imunoprecipitação (RIP), e Rotulagem Isótopos Estáveis ​​com Aminoácidos em cultura de células (SILAC), um método de proteômica (revisto em [7]). Cada método tem vantagens e desvantagens. Uma vez que miRNA segmentação frequentemente desestabiliza um mRNA e leva a sua degradação, uma perdar ganho no nível de ARNm após a introdução de um miRNA imitar ou inibidor, respectivamente, podem identificar alvos miRNA. Esta perda ou ganho de mRNA é facilmente detectada por microarray ou sequenciação de profundidade. Enquanto os métodos de detecção de mRNA são mais simples e mais sensível do que os métodos de detecção de proteínas, detecção de mRNA vai perder todos os alvos do miRNA que não são degradados. Relatórios recentes do laboratório Bartell comparando os resultados da detecção de miRNA-alvo RNA com os de SILAC [8] ou perfil ribossoma [9] indicam que os miRNAs mamíferos predominantemente agir, reduzindo os níveis de mRNA alvo. No entanto, muitos outros laboratórios que trabalham com metas de miRNA individuais detectaram alteração na proteína, mas nenhuma mudança no nível de mRNA. Relatos de que parece ser translacional regulação sem perda mRNA detectável incluem: miR-10b em HOXD10 [10], miR221/222 em p27KIP1 mostrou [11], miR-21 em Pdcd4 [12], miR-126 em p85β [13] , miR-34 em SIRT1 [14], miR-21 em PTEN [15], miR-302D em Arid4b [16], miR-200c em JAG1 [17], e miR-299, 297, 567, umnd 609 em VEGFA [18]. Além disso, Clancy et al [19] relatou recentemente que a regulação traducional por let-7 só foi detectado quando isoformas de RNAm individuais que contêm o local de let-7-alvo foram detectados de forma selectiva. A segunda sugere que, pelo menos em alguns casos, a regulação de translação pode ser negligenciada em um perfil compósito - isto é, quando todas as isoformas de mRNA são detectadas como uma mRNA - como obtido com microarray muitos e análise de sequências. Co-imunoprecipitação de miRNA mRNA complexos através Argonaute (geralmente ago2) ou outra proteína associada (RNA imunoprecipitação, ou RIP) vai isolar alvos miRNA independentemente do mecanismo de regulação. Além disso, RIP detecta endógena, e presumivelmente biologicamente relevantes, interacções. No entanto, não se sabe se todas as interacções miRNA de mRNA-são funcionais, e RIP perderia todos os objectivos de ARNm que se associam apenas transitoriamente ou são rapidamente degradados. Além disso, miRNA específicos de mRNA-parceiros deve ser inferida bioinformaticamente porque todos os pares de mRNA miRNA-co-precipitado em conjunto. Finalmente, SILAC directamente identifica o produto final de regulação miRNA, a própria proteína, mas é insensível e, portanto, perde proteínas raras e as pequenas alterações vezes nos níveis de proteína. À luz das limitações com os actuais métodos de identificação de miRNA-alvo, sentimos um ensaio adicional global para identificar alvos miRNA funcionais por um mecanismo alternativo foi necessário. Para suprir essa necessidade, que licenciou uma tecnologia inventada por Joop Gaken e Mohamedali Azim de Faculdade Londres do rei. A invenção é uma proteína de fusão dupla selecção, especificamente, uma timidina-quinase de fusão zeocin, regulada por uma biblioteca de cDNA de sequências de miRNA potenciais alvo na sua 3&#39;UTR. Células estavelmente transfectadas com e expressando TKzeo-cDNA construções podem ser seleccionados com zeocin, conforme ilustrado na Fig. 2. Depois de expressar um miRNA de interesse, as metas que miRNA pode ser selecionado with ganciclovir, como ilustrado na Fig. 3. Ganciclovir mata as células expressando timidina-quinase, ou seja, as células expressando TKzeo-cDNA falta um alvo para a miRNA de interesse. Targeted cDNA pode ser isolado por amplificação por PCR de DNA a partir de células que sobrevivem ganciclovir iniciadores utilizando que flanqueiam os produtos de cDNA, e PCR podem ser sequenciados para identificar alvos. Temos desenvolvido tecnologia da Kings College em uma nova ferramenta para a identificação global e descoberta de metas funcionais miRNA humanos - a MISSÃO Biblioteca ID Target. Com a biblioteca de ID do alvo, os utilizadores podem isolar alvos miRNA por uma série de transfecção das células de mamíferos cultura e os passos de selecção de drogas. A Biblioteca é abrangente, e contém 66-79% de genes humanos. Os resultados iniciais indicam que tanto a descoberto anteriormente, bem como novos alvos podem ser isolados a partir da biblioteca ID MISSÃO alvo. Embora o protocolo é de alguma extensão,uso da Biblioteca identificação de destino exige técnicas padrão de laboratório molecular - cultura de células de mamíferos, transfecção, a seleção de drogas, PCR, e seqüenciamento - e, portanto, deve ser bem no meio da maioria dos biólogos. Sugerimos que a atenção suficiente ser pago ao delineamento experimental adequado, otimizando as condições de cultura e, mais importante, pré-teste de cada novo tipo de célula para determinar os níveis ótimos de drogas para as etapas de seleção (matar-curvas) para garantir o sucesso com a Biblioteca ID Target. Tal como acontece com todos os métodos de identificação de miRNA alvo, é altamente recomendável que os alvos identificados pela triagem da biblioteca ID do alvo ser validado com um segundo método, tal como microarray, qRT-PCR, o ensaio de repórter (isto é, luciferase), ou análise de Western.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> JumpStart REDTaq Readymix </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td> Ganciclovir </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> Topo TA </td><td> Invitrogen </td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td> GenElute mamíferos Genomic DNA Miniprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td> Célula k Nucleofection específicaele </td><td> Lonza </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1"> Identificação do destino Biblioteca </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide tela de metas de mirna usando a missão biblioteca id alvo

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

A Biblioteca de ID Alvo é projetado para ajudar nas metas de descoberta e identificação de microRNA (miRNA). A biblioteca de ID do alvo é um plasmídeo baseado em biblioteca de todo o genoma de cDNA clonado a jusante 3&#39;UTR a partir da proteína de fusão de selecção de dupla, timidina-quinase zeocin (TKzeo). A primeira rodada de seleção é para transformantes estáveis, seguido com a introdução de um miRNA de interesse, e, finalmente, a seleção de cDNAs contendo a meta de miRNA. CDNAs selecionados são identificados por seqüenciamento (ver Figura 1-3 Fluxo de Trabalho para a Target Biblioteca ID e detalhes). Para garantir uma ampla cobertura do transcriptoma humano, Target ID Biblioteca cDNAs foram gerados através de oligo-dT priming usando um pool de ARN total preparado a partir de vários tecidos humanos e linhas celulares. Resultando gama de cDNA de 0,5 a 4 kb, com um tamanho médio de 1,2 kb, e foram clonados no dupla-selecção p3TKzeo plasmídeo (ver Figura 4 para o mapa do plasmídeo). Os alvos de genes representados na library podem ser encontradas no site da Sigma-Aldrich. Os resultados de sequenciação Illumina (Tabela 3), mostram que a biblioteca inclui 16.922 dos 21,518 genes únicos em UCSC RefGene (79%), ou 14.000 genes com 10 ou mais lê (66%).

A Biblioteca de ID de destino é um plasmídeo baseado em coleta de todo o genoma de cDNA clonado usado para identificar alvos miRNA. Aqui nós demonstrar o seu uso e aplicação.

Genome-wide tela de Metas de miRNA Usando a missão Biblioteca ID Alvo

A Target ID Library foi projetada para auxiliar na descoberta e identificação de alvos de microRNA (miRNA). A Target ID Library é baseada em plasmídeos, ...

O objetivo geral do experimento a seguir é realizar uma triagem em genoma inteiro de alto rendimento de alvos de microRNA utilizando a biblioteca de identificação de alvos. Isso é realizado por meio da transfeção celular com o plasmídeo da biblioteca. Uma coleção em genoma inteiro de cDNAs clonados é então transfectada, seguida pela seleção de linhagens celulares estáveis.As células da biblioteca estabelecidas são então transfectadas com o construto de expressão de micro RNA para permitir a coexpressão do alvo de micro RNA e da timidina quinase. Neste ponto, o ganciclovir é utilizado para selecionar células que expressam alvos específicos de micro RNA, selecionando contra a expressão de timidina quinase. O DNA contendo os sítios alvo de micro RNA é então amplificado por PCR utilizando os iniciadores de amplificação de identificação do alvo, a fim de sequenciar e identificar os alvos da biblioteca de micro RNA.No final, são obtidos resultados que identificam alvos específicos de microRNA em células com base na análise de sequenciamento profundo. A biblioteca de identificação de alvos da missão é projetada para auxiliar na descoberta e identificação de alvos gênicos para microRNA. Aqui demonstramos seu uso e aplicação.Antes do início deste protocolo, escolha uma linhagem celular que não expresse ou que expresse baixos níveis do IRA de interesse, cultive e expanda as células para obter aproximadamente duas vezes 10 à sétima células com 80% de confluência. Após a tripsinização, transfira as células para um tubo estéril de 15 mililitros com tampa de rosca e centrifugue as células a 200 × g durante cinco minutos para obter o pellet. Após a remoção do meio, ressuspenda o pellet celular para lavar, centrifugue as células novamente e repita a lavagem uma segunda vez.Enquanto isso, prepare um número suficiente de tubos de 0,5 mililitro para o número de transfeções, adicionando dois microgramas da biblioteca de ID alvo a cada tubo. Agora, ressuspenda o pellet celular dentro do tubo de 15 mililitros usando 600 microlitros de solução Maxim Nucleofection por transfeção. Uma reação por vez.Adicione 100 microlitros de células à alíquota, juntamente com dois microgramas de plasmídeo, misturando com a ponta da pipeta. Transfira cada mistura para um vete de efetor nuclear. Insira um vete no instrumento de efetor nuclear e execute um programa otimizado apropriado para a linhagem celular.Em seguida, encha uma pipeta de transferência com meio pré-aquecido. Aspire as células transfectadas na mesma pipeta e transfira para um único poço de uma placa de seis poços previamente preparada. Repita este processo para cada afecção nuclear de NU seguindo afecção nuclear de NU.Retorne as células à câmara de crescimento para incubação durante a noite no dia seguinte. Substitua o meio e permita que as células se recuperem por três a cinco dias. Após a recuperação das células, remova o meio e adicione meio completo contendo o nível apropriado de eosina para selecionar a integração estável e a expressão da proteína de fusão TKZO.A concentração de eosina pode ser previamente determinada conforme descrito no texto. Monitore as células para seleção de eosina por meio da viabilidade celular. Substitua o meio por meio fresco contendo eosina a cada dois ou três dias.Uma vez confluentes na placa de seis poços, realize a passagem e expanda as células para frascos maiores. É realizada uma análise de curva de morte para estabelecer a dose letal mínima dos reagentes de seleção utilizados no estudo. Para evitar respostas fenotípicas indesejadas, realize primeiramente a curva de morte plaqueando as células em cada poço de uma placa de 96 poços contendo 120 microlitros de meio fresco no dia seguinte.Adicione o fármaco aos poços selecionados. Antibióticos como G418 ou puromicina são usados para selecionar a integração do construto de expressão de mirna, ou contra-áciclovir é usado para selecionar contra a expressão de timidina quinase. Durante a incubação, examine a viabilidade celular para cada concentração do fármaco a cada dois dias. Substitua o meio contendo o agente de seleção a cada três dias.A concentração mínima do reagente de seleção que causa morte celular completa após o tempo desejado deve ser utilizada para esse tipo celular e experimento, após a determinação das concentrações do fármaco. Prepare-se para MI transfectando ao cultivar e expandir as células do Biblioteca de ID-alvo para atingir duas vezes 10 à sétima células. Use tripsina quando as células estiverem com mais de 80% de confluência.Transfira as células para um tubo estéril de 15 mililitros com tampa de rosca e faça a pelotização a 200 vezes G durante cinco minutos. Remova o meio e lave o pellet celular duas vezes como anteriormente. Em seguida, para cada transfeção, adicione dois microgramas do plasmídeo de expressão MIRA a um tubo de 0,5 mililitro.Realize a transfeção nuclear do mRNA nas células do biblioteca com o mesmo método utilizado para a transfeção da biblioteca de ID alvo. Após as células terem se recuperado por três a cinco dias, substitua o meio por meio completo contendo o nível apropriado de antibiótico, conforme determinado pelo teste de curva de morte.Monitore as células para seleção com antibiótico, substituindo o meio por meio contendo o antibiótico a cada dois ou três dias. Uma vez confluentes, passe as células do poço de seis poços e expanda-as para frascos maiores. Como antes, substitua o meio por meio fresco contendo os níveis apropriados de GCV e antibiótico.Monitore as células quanto à expressão da timidina quinase e expressão de mRNA por meio da viabilidade celular e expanda as células sobreviventes na presença de GCV e antibiótico. Em seguida, prepare o DNA genômico das células selecionadas com GCV. Amplifique por PCR os fragmentos inseridos da biblioteca selecionada com os iniciadores do kit e subclone-os conforme descrito no protocolo escrito.As reações de sequenciamento podem então ser realizadas com os iniciadores de amplificação. Como etapa final, identifique os genes alvo por meio do alinhamento BLAST das sequências com o transcriptoma humano para transcritos conhecidos e com o genoma humano para transcritos novos. Um construto expressando mere 3 73 foi transfectado de forma estável na biblioteca MC seven e selecionado em meio contendo ganciclovir para enriquecer as células que expressam mere 3 73 alvos.O GCV não tem efeito sobre células MCF sete sem biblioteca, pois elas não expressam timidina quinase. Por outro lado, as células da biblioteca C sete expressam timidina quinase, mas não são completamente mortas pelo ganciclovir em oito ou 16 micromolares, conforme mostrado pelas células vivas que incorporam o azul brilhante. No entanto, as células da biblioteca param de crescer na presença de GCV, como evidenciado pela coloração do corante vermelho de fenol no meio delas.As células paralisadas não acidificam seu meio e a cor permanece avermelhada. Em vez disso, sequências-alvo amarelas foram isoladas das células sobreviventes. Amplificadas por PCR e sequenciadas.Foram obtidas quase 12 milhões de leituras de cDNA que mapearam para quase 12.000 genes únicos. Desses genes únicos, 234 foram considerados acertos confiáveis em virtude da frequência de acerto e eram específicos para o mere 3 73. Uma comparação inicial revelou que 10 dos genes únicos identificados com a biblioteca de identificação do alvo também estão na lista de alvos mere 3 73 previamente identificados na tar base.Portanto, esses 10 são provavelmente alvos válidos do mero 3 73 e estão atualmente sendo caracterizados para validar experimentalmente os acertos selecionados. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar a biblioteca de identificação de alvos Mission para realizar uma triagem em todo o genoma de alto rendimento para alvos gênicos de microRNAs.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

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EsiRNA MISSÃO para a seleção RNAi em células de mamíferos

MicroRNAs (miRNAs) são importantes reguladores da expressão gênica e foram mostrados a desempenhar um papel em inúmeros processos biológicos. Para entender melhor miRNA-UTR interações, criamos uma coleção de todo o genoma de três repórteres UTR luciferase emparelhado com um novo gene luciferase e reagentes de ensaio, o sistema de interruptor.

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Aqui descrevemos um ensaio de gene repórter baseado em células como uma ferramenta valiosa para rastrear bibliotecas químicas em busca de compostos que modulam os mecanismos de controle pós-transcricional exercidos por meio de 3' UTR.

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A identificação luminescente de elementos funcionais em regiões 3' não traduzidas (3'UTRs) (3'LIFE) é uma técnica para identificar a regulação funcional em 3'UTRs por miRNAs ou outros fatores regulatórios. Este protocolo utiliza metodologia de alto rendimento, como transfecção de 96 poços e ensaios de luciferase, para rastrear centenas de interações putativas quanto à repressão funcional.

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Identificar novos alvos de medicamentos que fazem a transição de testes pré-clínicos para testes em humanos é uma prioridade científica. Para esse fim, descrevemos aqui uma abordagem genômica funcional para examinar o impacto da depleção de genes em esferóides de linhas de células cancerígenas, que modelam mais apropriadamente cânceres humanos in vivo.

Utilizando Genómica Funcional de triagem para identificar alvos de drogas potencialmente romance em Spheroid culturas de células de câncer

Este relatório descreve um método rápido e confiável para validar alvos de mRNA de miRNAs celulares. O método usa biotinilado sintético baseado no LNA de ácido nucleico trancado miRNA imita para capturar o alvo do mRNA. Posteriormente, grânulos magnéticos streptavidin-revestidas são empregados para pulldown o alvo mRNA para quantificação por qPCR reação em cadeia da polimerase.

Pulldown biotina-baseado do ensaio para validar mRNA miRNAs alvos de celular

É descrito aqui um protocolo para caracterizar os módulos de miRNAs biologicamente sinérgica e seu conjunto em transgenes curtos, que permite o superexpressão simultâneo para aplicações da terapia de Gene.

Caracterização de miRNAs funcionalmente associadas em glioblastoma e sua engenharia em clusters artificiais para terapia gênica

Aqui, apresentamos um novo e totalmente automatizado pipeline de miRNA, mirMachine, que 1) pode identificar miRNAs conhecidos e novos com mais precisão e 2) é totalmente automatizado e disponível gratuitamente. Os usuários agora podem executar um script de envio curto para executar o pipeline mirMachine totalmente automatizado.

mirMachine: Um balcão único para anotação de miRNA de planta

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de edição de genes de edição de genes (CRISPR) regularmente interespaçado de alto rendimento para análise de rede de clusters microRNA que permite a geração rápida de um painel de linhas celulares geneticamente modificadas carregando combinações únicas de exclusão de membros de cluster miRNA de até 35 kb dentro de um único experimento.

Ferramenta de edição de genes CRISPR para análise de rede de cluster microrna

Desenvolvemos uma abordagem oncogenômica comparativa entre espécies utilizando análises genômicas e telas genômicas funcionais para identificar e comparar alvos terapêuticos em tumores surgidos em modelos de camundongos geneticamente modificados e o tipo de tumor humano correspondente.

Perfil Genético e Triagem de Abandono em Escala Genômica para Identificar Alvos Terapêuticos em Modelos Murinos de Tumor Maligno de Bainha de Nervo Periférico

O protocolo descreve um ensaio de hibridização de imunofluorescência em tandem com tecido embebido em parafina fixado em formalina para detectar e quantificar microRNA e proteínas multiplexadas simultaneamente.

Amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado como um novo método de detecção e quantificação

Aprenda a realizar triagem genômica de alvos de miRNA usando a biblioteca Target ID em linhagens celulares estáveis. Este método permite identificar interações específicas de microRNAs por sequenciamento profundo.

Genome-wide tela de Metas de miRNA Usando a missão Biblioteca ID Alvo

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