Mudando a direção e orientação do campo elétrico Durante Elétrica Aplicação Pulsos melhora a transferência de Gene Plasmid In vitro
12 de setembro de 2011
Transfecção gênica por eletroporação é melhorada aproximadamente duas vezes quando a orientação do campo elétrico é alterado durante a aplicação do pulso, enquanto que a viabilidade das células não é afetado. O aumento da transfecção do gene é causada pelo aumento da área de membrana que é feito competentes para a entrada de DNA na célula.
A transferência gênica por eletroporação é um método físico utilizado para introduzir genes nas células por meio da aplicação de pulsos elétricos curtos e intensos. Na transferência gênica por eletroporação bem-sucedida, são envolvidas várias etapas: formação de um complexo entre o DNA e a membrana celular, translocação do DNA através da membrana eletroporada, transferência do DNA do citoplasma para o núcleo e expressão gênica. Diferentes protocolos de pulsos elétricos são utilizados para alcançar a máxima transfeção gênica.
Um deles é a alteração da orientação do campo elétrico durante a aplicação do pulso. Neste vídeo, demonstramos a diferença na eficiência de transferência de genes por eletroporação quando todos os pulsos são aplicados na mesma direção e quando os pulsos são aplicados alterando a orientação do campo elétrico. Os experimentos com alteração da orientação do campo elétrico foram realizados em células de ovário de hamster chinês, CHOK1, para o experimento.
Siga estes passos: cultive as células em um frasco de cultura no incubador por 24 horas. No dia do experimento, prepare uma suspensão celular utilizando tripsina com solução de tripsina 0,25% em EDTA, conte as células, centrifugue-as por cinco minutos a 1000 rotações por minuto a quatro graus Celsius e re-suspenda os pellets celulares em tampão de fosfato de sódio ISO OSM Miller para uma densidade celular de 5 milhões de células por mililitro. Em seguida, transfira a amostra para a placa apropriada; as células são expostas a um campo elétrico em uma ponteira com eletrodos integrados conectados a um gerador de alta voltagem prototípico.
Esses eletrodos permitem a aplicação de um campo elétrico relativamente homogêneo em diferentes direções. A ponta e o gerador foram desenvolvidos no laboratório de Bicibernética da faculdade de engenharia elétrica. Universidade de Luana adicione plasmídeo, E-G-F-P-N um a uma concentração de suspensão celular de 10 microgramas por mililitro.
Misture as células com o DNA plasmidial completamente e incube a mistura por dois a três minutos à temperatura ambiente antes de aplicar os pulsos elétricos. Aspire 100 microlitros da suspensão celular para dentro da ponta da pipeta com eletrodos integrados. Neste experimento, uma série de oito pulsos retangulares é aplicada utilizando um gerador de alta tensão protótipo, sendo utilizados diferentes protocolos de campo elétrico no primeiro protocolo.
Todos os pulsos são aplicados na mesma direção, enquanto no segundo protocolo os pulsos são aplicados alterando a orientação do campo elétrico. O segundo protocolo só pode ser utilizado com um gerador de pulsos apropriado, que permita a aplicação de pulsos elétricos em diferentes direções. Imediatamente após a aplicação dos pulsos, transfira as células da ponta do pipeto para placas de seis poços e adicione soro bovino fetal.
Incube as células em 25% do volume da amostra por cinco minutos a 37 graus CELs. Para permitir o resselamento da membrana celular, adicione dois mililitros de HAMF 12 a cada amostra em placa de seis poços e incube as células por 24 horas a 37 graus Celsius em atmosfera umidificada com 5%CO2 no incubador. A eficiência da eletrotransferência gênica é determinada como a porcentagem de células expressando GFP 24 horas após a aplicação do pulso.
As células são observadas utilizando um microscópio de fluorescência no software de aquisição. Ajuste o comprimento de onda de excitação para 488 nanômetros e escolha um filtro de passagem de banda apropriado para a imagem fluorescente verde, a fim de detectar as células que expressam GFP. Adquira pelo menos cinco imagens, com contraste de fase e fluorescência verde, em 20 vezes.
A ampliação do objetivo conta as células na imagem de contraste de fase e as células que expressam GFP na imagem de fluorescência verde, determinando a porcentagem de eficiência da eletrotransferência gênica pela divisão do número de células que expressam GFP pelo número total de células em cada imagem correspondente. A porcentagem de células que expressam GFP quando todos os pulsos são aplicados na mesma direção e quando os pulsos são aplicados alterando a orientação do campo elétrico é apresentada mediante a mudança na orientação do campo elétrico. A porcentagem de células que expressam GFP aumenta significativamente.
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Visão Geral
Este estudo investiga a transfeção gênica por eletroporação, destacando o impacto da orientação do campo elétrico na eficiência da transfeção. Os resultados indicam que alterar a direção do campo elétrico durante a aplicação do pulso pode dobrar as taxas de transfeção gênica sem comprometer a viabilidade celular.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Terapia gênica
- Biologia celular
- Técnicas de eletroporação
Contexto
- A transferência gênica por eletroporação é um método para introduzir genes em células.
- Envolve a aplicação de pulsos elétricos curtos e intensos para facilitar a entrada de DNA.
- Para que a transfeção seja bem-sucedida, o DNA precisa atravessar a membrana celular e entrar no núcleo.
- Diferentes protocolos de pulsos elétricos podem aumentar a eficiência da transfeção.
Objetivo do Estudo
- Avaliar o efeito da orientação do campo elétrico na eficiência de transfeção gênica.
- Determinar se a alteração da orientação afeta a viabilidade celular.
- Demonstrar o processo utilizando células de ovário de hamster chinês (CHO).
Métodos Utilizados
- Aplicação de pulsos elétricos a células CHO.
- Comparação da eficiência de transfeção com diferentes orientações do campo elétrico.
- Avaliação da viabilidade celular após a transfeção.
- Análise da entrada de DNA nas células e da expressão gênica subsequente.
Resultados Principais
- A eficiência de transfeção gênica aumentou aproximadamente duas vezes com a alteração na orientação do campo elétrico.
- Não foi observado impacto significativo na viabilidade celular.
- O aumento da área da membrana contribuiu para a entrada aprimorada de DNA.
- Demonstrou-se a eficácia de diferentes protocolos de pulsos elétricos.
Conclusões
- Alterar a orientação do campo elétrico durante a aplicação do pulso melhora significativamente a transfeção gênica.
- Este método pode ser otimizado sem comprometer a saúde celular.
- Pesquisas futuras podem explorar protocolos adicionais para aprimorar a entrega de genes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A otimização da orientação do campo elétrico durante a eletroporação aumenta a eficiência da transferência gênica de plasmídeos, oferecendo uma estratégia não viral para melhorar os rendimentos de transfeção em fluxos de trabalho de validação inicial de alvos e identificação de compostos líderes. Essa abordagem auxilia na redução de riscos mecanicistas ao aumentar a entrada de DNA por meio da ampliação da competência da membrana, sem comprometer a viabilidade celular, melhorando assim a confiança preditiva em modelos pré-clínicos. O método permite a entrega reprodutível e escalonável de genes para o desenvolvimento de ensaios e aplicações de triagem fenotípica em pesquisa e desenvolvimento biofarmacêutico.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Aumenta a área da membrana competente para entrada de DNA, melhorando a eficiência de transfeção e apoiando a validação funcional de alvos em estudos de expressão de proteínas recombinantes.
- Valor Operacional: Permite a entrega consistente de plasmídeos em populações celulares, reduzindo a variabilidade em testes iniciais de hipóteses e na clarificação de vias.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece leituras quantitativas baseadas em fluorescência da eficiência de transferência gênica compatíveis com plataformas de triagem de alto conteúdo.
- Valor Operacional: Padroniza parâmetros de eletroporação utilizando ponteiras de eletrodo integradas e geradores de pulsos programáveis, melhorando a reprodutibilidade do ensaio entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Permite o preparo escalonável de linhagens celulares transfectadas para ensaios downstream de engajamento de alvo e biomarcadores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a viabilidade celular após a transfeção, permitindo estudos longitudinais da expressão gênica e dos efeitos fenotípicos em sistemas relevantes para doenças.
- Valor Operacional: Facilita a geração de modelos pré-clínicos estabelecidos de forma estável ou transitória utilizando células CHO, um sistema amplamente utilizado como hospedeiro para a produção de biológicos e análise de vias metabólicas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se no continuum de descoberta que vai da validação do alvo à identificação de compostos iniciais, onde é necessária uma entrega gênica eficiente para avaliar a função do alvo e modular vias em modelos celulares.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir a superexpressão ou silenciamento confiável de genes de interesse em células de mamíferos.
- Telagem: Fornece resultados quantitativos padronizados de transfeção que permitem a comparação entre construtos genéticos ou elementos regulatórios.
- Análises: Gera métricas de eficiência baseadas em porcentagem (células GFP+ / células totais) que possibilitam comparações estatísticas entre protocolos de pulsos.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao produzir células transfectadas viáveis, adequadas para validação adicional em modelos tridimensionais ou sistemas de co-cultivo.
- Reutilização Empresarial: Representa uma capacidade reutilizável de eletroporação aplicável a múltiplos projetos que exigem entrega de plasmídeos em linhagens celulares aderentes ou em suspensão.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva nos resultados de entrega gênica ao melhorar a eficiência de transfeção por meio da otimização biofísica dos parâmetros de pulso.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e padronização dos procedimentos de transferência gênica por meio de trens de pulsos definidos e controle da orientação do campo.
- Valor Estratégico: Reduz o risco biológico na validação de alvos ao garantir expressão suficiente do transgene para avaliação fenotípica, minimizando falsos negativos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos genéticos com base nos níveis alcançáveis de expressão em ensaios celulares.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células de mamíferos, preparação de plasmídeos e microscopia de fluorescência para avaliação da eficiência de transfeção.
- Depende do acesso a geradores de pulso de alta tensão capazes de alterar a orientação do campo elétrico programavelmente e ponteiras compatíveis com eletrodos integrados.
- Necessita padronização dos parâmetros de pulso (tensão, duração, número) e da densidade celular entre experimentos para garantir comparabilidade.
- Envolve a otimização da relação DNA-célula e dos tempos de incubação para equilibrar eficiência de transfeção e estresse celular.
- Limita-se a linhagens celulares aderentes ou em suspensão compatíveis com eletroporação; células primárias ou sensíveis podem exigir métodos alternativos de entrega.
