Name: Imagem Pheromone Sensing em um Preparação Slice rato Vomeronasal aguda do tecido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprenda a preparar fatias agudas do órgão vomeronasal de camundongos para imagem de cálcio em neurônios individuais. Este método permite estudar respostas a feromônios e identificar pares receptor-ligante em pesquisas olfativas.

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Queremos agradecer especialmente Monique Nenniger Tosato por sua excelente suporte técnico, bem como Jean-Yves Chatton para seus conselhos científicos ea imagem plataforma CIF da UNIL para o equipamento de microscópio. O financiamento foi fornecido pelo National Science Foundation suíço.

1. Dissecção da VNO do mouse <ol><li> Use ratos adultos. Como feromônio de sensoriamento está implicado em multimodalities, cuidadosa distinção entre as linhagens, os genótipos, sexos e idades é importante e vai influenciar os resultados. Aqui, escolhemos ratos adultos VG 30 anteriormente utilizado para a identificação de um par receptor de feromônio-(2-heptanona-V1rb2) 31 (Fig. 1A). </li><li> Antes de iniciar a dissecção, prepare limpa e fria fluido cérebro-espinhal artificial (ACSF; NaCl 118 mM, NaHCO 3 mM 25, D-Glicose 10 mM, KCl mM 2, MgCl 2 2 mM, NaH 2 PO 4 1,2 mM, CaCl 2 2 mM, pH 7,4) saturado com oxycarbon (95% O 2: 5% CO 2). Para isso, misturar todos os componentes, exceto ACSF CaCl 2. Saturar a solução diretamente borbulhando com oxycarbon. No final, adicione o CaCl 2 e ajuste com DDH 2 0 para o volume desejado. Manter a solução ACSF em gelo até use. </li><li> Eutanásia do mouse deve ser preferencialmente feito por deslocamento cervical ou por inalação de CO 2, pouco antes do experimento. </li><li> Cortar a cabeça de rato. Colocá-lo sob um microscópio de dissecação em ACSF frio continuamente oxycarbonated. </li><li> Cortar o maxilar inferior e posição da cabeça, a fim de visualizar o palato (Figura 1B). </li><li> Faça uma incisão horizontal na parte superior do palato (Figura 1B) com uma tesoura micro e remover a membrana paladar com micro pinças de dissecação. Hidratar e limpar a cavidade exposta com ACSF (Fig. 1C). </li><li> Corte a parte superior ea parte inferior do septo nasal (Fig. 1C). Delicadamente extrair o septo nasal contendo o VNO e colocá-lo diretamente no ACSF no gelo (Figura 1D). </li><li> Separadas verticalmente as duas partes do VNO usando micro pinças de dissecação e delicadamente retire a cápsula cartilaginosa do VNO (Fig. 1E). Certifique-se de que todas as peças cartilaginosas são removidos. </li></ol> 2. VNO preparação fatia do tecido O VNO preparação fatia do tecido descrito nesta seção 2) deve-se principalmente para as investigações de imagens de cálcio. Fatias VNO pode também ser usado para immunohistostainings em fatias flutuante para verificar a integridade estrutural do tecido (ver secção 3) do protocolo). <ol><li> Prepare ponto de fusão baixo agar (3% no padrão PBS) e seu local de trabalho. Você vai precisar de ACSF, um micrótomo e suporta, micro pinças de dissecação, a incorporação de moldes (22 x 22 x 20 mm), toalhetes de precisão, escovas, placas de cultura de tecidos, cyanacrylat cola, gelo e um termômetro. </li><li> Encher o molde com a incorporação de 3% agar ponto de fusão baixo. Certifique-se que a temperatura não é maior do que 41 ° C antes de colocar na vertical do VNO logo enxugou (Fig. 2A) para ser capaz de obter cortes coronais. </li><li> Coloque o molde de incorporação no gelopara 1 min, até a solidificação e depois separá-lo do bloco de agar. Cortar o bloco de ágar-ágar numa forma piramidal e colocá-lo com cola com o apoio micrótomo (Fig. 2B). </li><li> Cortar fatias coronal VNO com o micrótomo, com uma velocidade de 0,5 mm / s, uma amplitude de 0,7 mm e uma espessura de 100 mm em ACSF frio e recolher as fatias de tecido com um pincel antes de colocá-los em uma placa de cultura de tecido cheio de frio ACSF. </li><li> Se o seu fatias contêm fluorescência endógena como GFP (em gene-alvo os neurônios), você pode selecioná-los sob um estereomicroscópio fluorescente (Fig. 2C). </li></ol> 3. Imunohistoquímica em fatias VNO flutuante O objetivo deste procedimento é para verificar a integridade das fatias de tecido VNO obtidos na seção 2). Tubulina-acetilado é um marcador de microtúbulos / citoesqueleto expressa em dendritos e microvilosidades de neurônios sensoriais VNO. Para experimentos com imagens de cálcio, vá direçãoqüentemente a seção 4) do protocolo. O método immunohistostaining em fatias flutuante VNO pode ser adaptado para a avaliação da expressão de qualquer proteína de interesse. Para este fim, recomendamos que você corrigir o VNO por 1h a 4 ° C em uma solução fixadora (paraformaldeído 4% em PBS, pH 7,6) após o ponto 1.7) do protocolo e usar a partir deste ponto em PBS pH 7,6, em vez de ACSF solução. <ol><li> Na placa de cultura de tecidos, corrigir o seu fatias de interesse em uma solução fixadora (paraformaldeído 4% em PBS, pH 7,6) 1h a 4 ° C. </li><li> Bloco fatias seu tecido durante a noite a 4 ° C em uma solução de PBS contendo NGS (soro normal de cabra) 10% e triton X-100 a 0,5%. </li><li> Incubar as fatias com o anticorpo primário (anti-acetilado-tubulina, Mouse, 1:2000) por 16h em temperatura ambiente (RT) em uma solução de PBS contendo NGS 5% e Triton X-100 em 0,25%. </li><li> Lavar 3 vezes por 5 minutos com uma solução de PBS contendo 2% NGS. </li><li> Incubar no escuro com o secoanticorpo ndary (Cy5 conjugada Goat anti-mouse, 1:200) em uma solução de PBS contendo 2% NGS por 1h em temperatura ambiente. </li><li> Lavar 3 vezes durante 5 minutos com PBS contendo NGS 2%, PBS NGS 1% e PBS apenas. </li><li> Monte seu fatias em uma mídia fluorescentes de montagem (contendo ou não DAPI), colocando-os no centro das zonas delimitadas hidrofóbica (use uma caneta hidrofóbica) e cubra com as fatias de lamelas. </li><li> Fazer observações e aquisições com microscopia confocal e um software que permite reconstruções em 3D (Fig. 2D-F). </li></ol> 4. Imagem de cálcio em fatias VNO <ol><li> Os procedimentos a seguir terá lugar no escuro. Fatias incubar VNO por 1h a 37 ° C em uma solução de carregamento composto por ACSF frio com Fura-02:00 (7 mM; solução estoque de 1 mM em DMSO) e 0,1% PLURONIC (w / v, solução estoque em 20% em DDH 2 O). </li><li> Manter as fatias carregado no gelo com oxycarbonation até o uso. Fatias carregado pode ser mantida por3-4h. </li><li> Coloque as fatias carregado com um pincel em uma câmara de perfusão contendo ACSF e manter as fatias com uma âncora fatia do tecido (Fig. 3A). </li><li> Coloque a câmara de perfusão no palco de um microscópio de imagem de cálcio (Fig. 3B) e continuamente perfundir com ACSF oxycarbonated na RT. Temperatura pode ser adaptado com o uso de um controlador de temperatura bipolar. </li><li> Observações das fatias carregado VNO (Fig. 3C-E) são realizadas com um microscópio invertido de fluorescência, com um objetivo 25x ou 63x e uma câmera SNAP-HQ CooL. Iluminação é feito sequencialmente (340/380 nm) com um instrumento policromador e gravadas a uma taxa de 5Hz. Emissão filtrada é feito em 510 nm. Alterações de cálcio intracelular ratio (ΔF = 340 nm/380 nm) são monitorados com um software apropriado. </li><li> Chemostimulation devem ser selecionados de acordo com sua própria finalidade experimental. Aqui, perfusões de ACSF contendo um feromônio mix (isobutylamine, 2-heptanona, 4-heptanona, 2-heptanol, pentylacetate, dimethylpyrazine, α / β-farneseno, 10 -6 M), 2-heptanona (10 -6 M) ou recém-coletados masculino e feminino (1: 1) urina do rato (1:100) são realizados 32. Perfusão da ATP (125 M) é usado como um teste de viabilidade no final dos experimentos (Fig. 3F) e deve indicar uma proporção de aproximadamente 80% neurônios viáveis. Sob essas condições, as fatias podem ser utilizados até 2 horas. </li><li> Subpopulações GFP-tagged dos neurônios sensoriais são visualizados através de iluminação específica (neste caso, os neurônios V1rb2 expressando) e podem ser analisados ​​com precisão (Fig. 3G-I). </li></ol> 5. Resultados representativos: Para estabelecer um ensaio funcional para investigar a transdução de várias vias de tomar lugar no VNO mouse, ou para identificar novas feromônio receptor-pares, aproveitamos o mouse VG linha (Fig. 1A (Fig. 1E), nos preparamos fatias aguda VNO (Fig. 2C). Fixamos uma fração deles, a fim de verificar e validar a integridade tissular da preparação através da realização de immunohistostainings contra a proteína tubulina-acetilado (Fig. 2D-F). A outra fração das fatias é usado para experimentos com imagens de cálcio. Para isso, as fatias são carregados com Fura-02:00 (Fig. 3C-E) e do nível de cálcio intracelular de cada neurônio é monitorado como uma relação ΔF (Fig. 3F). Viabilidade dos neurônios é avaliada pela perfusão da ATP (125 mM), após o que aumento rápido e transitório da relação ΔF é esperado (Fig. 3F). Urina sendo uma importante fonte de feromônios, a perfusão de frescoly urina do rato coletados (1:100) é usado como um controle endógeno. Ele dispara transientes de cálcio em aproximadamente 50% dos neurônios registrados (célula 1 e 2, fig. 3F). GFP sob iluminação, V1Rb2 neurônios positivos são observáveis, e perfusão de seu ligante conhecido pheromonal, 2-heptanona, inicia a ativação celular (célula 1, fig. 3I). Curiosamente, ativações neuronais também são observáveis ​​em uma fração de neurônios que não expressam o receptor V1Rb2 (neurônios GFP negativo) (célula 2, fig. 3I), demonstrando a complexidade do feromônio de codificação no VNO. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Dissecção do órgão vomeronasal do mouse. (A) do mouse A partir da linha de VG. (B) Após a eutanásia do mouse, a cabeça cheia é colocado sob um microscópio binocular e da mandíbula inferior é removida, a fim de visualizar o paladar. Uma pequena incisão horizontal é feita(Linha tracejada preta). (C) Após a remoção do palato, o septo nasal alinhado com o VNO é cortada na parte superior ea parte inferior (branco linhas tracejadas) para facilitar a extração VNO. (D) O VNO é posicionado em solução ACSF e separados (inserir: Vista poder maior das duas partes). (E) A cápsula cartilaginosa do VNO é delicadamente removida eo VNO sem sua cápsula cartilaginosa é utilizado para o resto dos experimentos. Barras de escala são: BE, 1 mm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Rato vomeronasal preparação fatia aguda e integridade tissular. (A) O VNO mouse é verticalmente integrado em uma solução ágar 3%. A temperatura do ágar deve ser inferior a 41 ° C. (B) O bloco de agar é cortado em forma piramidal e 100 seções M VNO (linha tracejada preta) são gerados em ACSF. (C) fatias VNO pode ser selecionado em um estereomicroscópio fluorescentes, a fim de visualizar uma específicapopulação de tag neurônios sensoriais. (DF) Integridade Tissular pode ser avaliada por immunohistostainings contra a proteína tubulina-acetilado, uma visão maior potência do gene-alvo V1rb2 neurônios demonstrar a perfeita conservação da preparação. Neurônios com seus dendritos de longo alcance a superfície do lúmen (E), bem como a expressão da proteína estrutural nos botões dendríticas e microvilosidades podem ser observados (F). Barras de escala são: B, 5 mm; C, 60 mm; D, 40 mm; EF, 20 mM. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura imagens de cálcio 3. E detecção de feromônio no vomeronasal fatias de tecido aguda. (A) Depois de um Fura-2:00 fase de carga, fatias VNO são colocados em uma câmara de perfusão e são mantidas com uma âncora adaptado (vista de alta potência). (B) Os experimentos são realizados no escuro e fatias VNO são continuamente perfundidos com ACSF de RT com um sistema de vácuo. A temperatura pode ser chosen usando um sistema controlador de temperatura composto por um elemento Pelletier bipolar e uma sonda térmica. Essa experiência foi realizada em temperatura ambiente. (CE) fatias VNO são observáveis ​​sob contraste de fase Hoffman (C, Hv) ou iluminação nm Fura 380 antes (D) e durante a ativação neuronal (E, aqui com ATP). (F) a viabilidade neuronal é avaliada com perfusão de ATP (125 mM). Aqui, chemostimulation é feito com urina (urina, 1:100) ou com uma mistura de feromônios mouse (ph mix., 10 -6 M) a uma vazão constante de 165 ml / h. Níveis de cálcio intracelular (ΔF) podem ser gravadas individualmente para cada célula (Cell 1-3). (G) Um neurônio V1Rb2 é visualizado sob iluminação GFP (1). (H) O carregamento deste neurônio (1), bem como um neurônio não expressar V1rb2 (2) é mostrado. (I) O neurônio V1rb2 é capaz de responder a 2-heptanona com um aumento de cálcio intracelular. Este neurônio não V1rb2 especial expressando também responde a 2-heptanona (célula 2). Barras de escala são: CE, 20 mm; GH,15 mm; ΔF = 340 nm / 380 nm. (F e I) Duração da aplicação do estímulo é indicado por barras em cada traço. A escala de cores arbitrárias representa a intensidade de fluorescência.

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<li>Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+patterns+of+axonal+projections+of+sensory+neurons+in+the+mouse+vomeronasal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system.</a> Cell. 97, 199-208 (1999).</li>
<li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nature. Neuroscience. 5, 1261-1262 (2002).</li>
<li>Brechbühl, J., Klaey, M., Broillet, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grueneberg+ganglion+cells+mediate+alarm+pheromone+detection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice.</a> Science. 321, 1092-1095 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de imagem de cálcio apresentado aqui permite gravar, em uma preparação fatia aguda, as respostas dos neurônios de rato pheromonal VNO. Com esta abordagem, a dissecção do animal para os neurônios vomeronasal é, com alguma prática, facilmente alcançável e oferece uma preparação de tecido de longa vida. Ele permite demorado experimentos como estudos farmacológicos ou o estudo de codificação pheromonal. Com esta técnica fisiológica, grandes populações, bem como precisa subpopulações neuronal pode ser analisado especificamente. Além disso, este método pode ser facilmente adaptado às abordagens imuno-histoquímica ou experimentos com base em corantes de cálcio outros. O uso destas metodologias combinadas certamente irá permitir a identificação de novos ligantes pheromonal para os quimiorreceptores muitos órfãos expressas no órgão vomeronasal do mouse.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Adenosina 5&#39;-trifosfato dissódico solução salina (ATP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6559-25UMO </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7002-100G </td><td> Preferencialmente por imuno-histoquímica </td></tr><tr><td> Agar (ponto de fusão baixo) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701-25G </td><td> Preferencialmente para imagens de cálcio </td></tr><tr><td> CL-100 Controlador de Temperatura Bipolar </td><td> Warner Instruments </td><td> W64-0352 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio confocal </td><td> Leica Microsystems </td><td> SP5 AOBS </td><td></td></tr><tr><td> Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG </td><td> ImmunoResearch Jackson </td><td> 115-175-071 </td><td> Proteger da luz </td></tr><tr><td> DMSO (dimetil sulfóxido) </td><td> Merck </td><td> 317275-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Incorporação de moldes, Peel-A-Way </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td> 22 x 22 x 20 mm </td></tr><tr><td> Fluorescentes de montagem de mídia (Vectashield com DAPI, 10 ml) </td><td> Rectolab </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> FURA-02:00 </td><td> Teflabs </td><td> 0103 </td><td> Proteger da luz </td></tr><tr><td> Glisseal N (graxa de vácuo, 60 g) </td><td> Chemie Borer </td><td> Glisseal N </td><td></td></tr><tr><td> Câmara de gravação grande banho (RC-26G) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0235 </td><td></td></tr><tr><td> MetaFluor (software para criação de imagens de cálcio; v.7.6.5.0) </td><td> Sistemas Visitron </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Monoclonal anti-tubulina acetilam,d anticorpo do rato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6793-.2ML </td><td></td></tr><tr><td> Normais de cabra soro (NGS, 10 ml) </td><td> Interchim </td><td> UP379030 </td><td></td></tr><tr><td> Plataforma de câmaras (P-1) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0277 </td><td></td></tr><tr><td> PLURONIC F-127, 2 g </td><td> Invitrogen </td><td> P-6867 </td><td></td></tr><tr><td> Roti Coll (frasco dosador, 10 g) </td><td> Carl Roth </td><td> 0.258,1 </td><td></td></tr><tr><td> SC-20 aquecedor Solução Dual In-line / Cooler </td><td> Warner Instruments </td><td> W64-0353 </td><td></td></tr><tr><td> Âncora fatia (SHD-26GKIT) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0266 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio Stereofluorescence </td><td> Leica Microsystems </td><td> MZ16FA </td><td></td></tr><tr><td> Super PEN PAP (hidrofóbicoscaneta) </td><td> Pelco Internacional </td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fluka </td><td> 93420-250ML </td><td></td></tr><tr><td> Vibrando blade micrótomo VT 1200S </td><td> Leica Microsystems </td><td> 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> VisiChrome policromador sistema de alta velocidade </td><td> Sistemas Visitron </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3D Visualização de Dados (Imaris; v.6.3.1) </td><td> Bitplane Software Científico </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagem pheromone sensing em um preparação slice rato vomeronasal aguda do tecido

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson e Lüscher Martin usou o termo feromônio pela primeira vez em 1959 para descrever um produtos químicos utilizados para a comunicação intra-espécies. Feromônios são voláteis e não-voláteis de curta duração moléculas secretadas 2 e / ou contidas em fluidos biológicos 3,4, como a urina, um líquido conhecido por ser a principal fonte de feromônios 3. Comunicação pheromonal está implicado em uma variedade de modalidades de animais chave, tais como interações familiares 5,6, organizações hierárquicas 3 e 7,8 interações sexuais e são, consequentemente, diretamente correlacionado com a sobrevivência de uma dada espécie 9,10,11. Em camundongos, a capacidade de detectar os feromônios é principalmente mediado pelo órgão vomeronasal (VNO) 10,12, uma estrutura pareada localizada na base da cavidade nasal, e fechado em uma cápsula cartilaginosa. Cada VNO tem uma forma tubular com um lúmen 13,14 permitindo o contato com o externomundo químico. O neuroepitélio sensorial é composto principalmente de neurônios sensoriais bipolares vomeronasal (VSNs) 15. Cada VSN estende um único dendrito para o lúmen que termina em um botão dendríticas grande influência até 100 microvilosidades implicados na detecção química 16. Subpopulações de numerosos VSNs estão presentes. Eles são diferenciados pelos quimiorreceptores eles expressam e, portanto, possivelmente pelo ligante (s) que reconheçam 17,18. Duas principais famílias receptor vomeronasal, V1Rs e V2Rs 19,20,21,22, são compostas respectivamente por 240 e 120 23 24 membros e são expressos em camadas separadas do neuroepitélio. Receptores olfativos (ORs) 25 e receptores de peptídeos formil (FPRs) 26,27 também estão expressos em VSNs. Ou não essas subpopulações neuronais use o caminho downstream mesmo sinalização para feromônios de sensoriamento é desconhecida. Apesar de um papel de destaque desempenhado por um cálcio permeável canais (TRPC2) presentes na microvilosidades de neurônios maduros TRPC2 28 canais de transdução independentes têm sido sugeridas 6,29. Devido ao elevado número de sub-populações neuronais ea morfologia peculiar do órgão, investigações farmacológicas e fisiológicas dos elementos de sinalização presente no VNO são complexas. Aqui, apresentamos uma preparação fatia aguda do tecido do VNO do mouse para a realização de exames imagiológicos de cálcio. Esta abordagem permite observações fisiológicas, no ambiente natural de um tecido vivo, de subpopulações geral ou individual de VSNs previamente carregado com Fura-02:00, um corante de cálcio. Este método também é conveniente para estudar qualquer GFP-tagged receptor de feromônio e é adaptável para o uso de outras sondas fluorescentes de cálcio. Como exemplo, usamos aqui um rato VG linha 30, em que a tradução do receptor de feromônio V1rb2 está ligada à expressão de GFP por uma estratégia polycistronic. </p&gt;

Em camundongos, a capacidade de detectar os feromônios é principalmente mediado pelo órgão vomeronasal (OVN). Aqui, uma preparação fatia aguda do tecido de VNO para a realização de imagens de cálcio é descrito. Esta abordagem permite observações fisiológicos de subpopulações e / ou neurônios individuais em um tecido vivo e é conveniente para receptor-ligante de identificação.

Imagem Pheromone Sensing em um Preparação Slice rato Vomeronasal aguda do tecido

Peter Karlson e Martin Lüscher utilizaram o termo feromônio pela primeira vez em 1959 para descrever substâncias químicas utilizadas para a comunicação intraespecífica. ...

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer uma preparação de fatias teciduais agudas do órgão nasal RO do camundongo ou VNO, a fim de realizar experimentos de imagem de cálcio em subpopulações e/ou neurônios individuais em tecido vivo. Isso é realizado primeiramente pela extração do VNO do nariz do camundongo e, em seguida, pela microdissecação do mesmo a partir de sua cápsula cartilaginosa sob um microscópio estereoscópico em A CSF frio. Em seguida, o VNO isolado é posicionado verticalmente em um bloco de ágar e fatias teciduais coronais agudas são cortadas utilizando um micrótomo para verificar a integridade do tecido.Algumas lâminas são observadas após imunohistoquímica em um microscópio confocal. Outras lâminas são carregadas com um corante sensível ao cálcio e, em seguida, perfundidas com ligantes putativos de feromônios, sendo a ativação neuronal observada por meio de imagem de cálcio. Este método pode ajudar a resolver questões fundamentais no campo olfativo.Por exemplo, centenas de receptores de feromônios são expressos no órgão vomeronasal, mas muito poucos deles têm ligantes identificados. Os receptores de feromônios são muito difíceis de expressar em um sistema heterólogo. Precisávamos desenvolver um ensaio eficiente in vivo para atribuir feromônios específicos a receptores específicos.Podemos usar camundongos tactuais em que uma subpopulação específica de neurônios expressa receptores desconhecidos e pode ser identificada pela expressão de GFP. Também poderíamos usar este ensaio para investigar farmacologicamente canais iônicos e enzimas envolvidos na cascata de transdução Fairmont, demonstrando o procedimento. Hoje serão Julian e Fabian, dois pesquisadores do meu laboratório, antes de iniciar a dissecação.Prepare uma solução salina artificial fresca e fria, ACSF, saturada com oxycarb, combinando todos os ingredientes exceto o cloreto de cálcio. Sature a solução borbulhando diretamente com oxycarb. Em seguida, adicione o cloreto de cálcio e ajuste com água bidestilada até o volume desejado.Mantenha a solução de LCR A em gelo até o uso. Após a eutanásia e decapitação de um camundongo adulto, prepare uma placa de Petri com LCR A frio e continuamente oxigenado e carbonatado. Após a remoção da mandíbula inferior, coloque a cabeça do camundongo na placa de Petri.Posicione a cabeça do camundongo sob o microscópio estereoscópico para visualizar o palato. Em seguida, faça uma incisão horizontal na parte superior do palato com tesoura microcirúrgica e, então, remova a membrana do palato com pinça microcirúrgica. Hidrate e limpe a cavidade exposta com um LCR.Corte a parte superior e inferior do septo nasal. Em seguida, extraia delicadamente o septo nasal contendo o órgão vomeronasal (VNO) e coloque-o diretamente em LCR limpo verticalmente. Separe as duas partes do VNO utilizando pinças microcirúrgicas.Identifique a cápsula cartilaginosa do órgão vomeronasal e, em seguida, remova-a delicadamente, certificando-se de que todos os fragmentos cartilaginosos sejam retirados. O órgão vomeronasal isolado, os fragmentos cartilaginosos e o órgão vomeronasal não dissecado são indicados aqui ano a ano, prepare 3% de ágar de baixo ponto de fusão e depois monte o espaço de trabalho com as ferramentas necessárias. Encha o molde de inclusão com ágar e certifique-se de que a temperatura esteja abaixo de 41 graus Celsius antes de submergir o órgão vomeronasal dissecado. Posicione o tecido verticalmente para obter cortes coronais.Coloque o molde de inclusão sobre gelo por um minuto, até que o cilindro solidifique. Após um minuto, remova o bloco de cilindro, corte o ágar em formato parametal e, em seguida, cole-o ao suporte do micrótomo usando o micrótomo para cortar fatias coronais do órgão vomeronasal com velocidade de 0,5 milímetros por segundo, amplitude de 0,7 milímetros e espessura de 100 micrômetros em LCR frio.Colete as fatias de tecido com um pincel e coloque-as em uma placa de cultura de tecidos preenchida com A CSF frio para verificar a integridade estrutural das fatias de tecido coletadas, que podem ser fixadas e, em seguida, submetidas à imunomarcação para componentes do citoesqueleto ou outras proteínas de interesse. Aqui, a imunomarcação contra tubulina acetilada em roxo demonstra a integridade estrutural da fatia de tecido. Além disso, a observação de uma população neuronal específica na qual um determinado receptor de feromônio foi marcado com GFP mostra a morfologia neuronal conservada, com neurônios apresentando corpos celulares pequenos e ovais e longos dendritos que alcançam a superfície da luz, terminando em microvilosidades, podendo ser observados em um ambiente escuro.Incube fatias do OVN em uma solução de carregamento contendo A CSF frio com sete micromolares de URA 2:00 AM e 0,1% ônico por uma hora a 37 graus celsius após uma hora. Mantenha as fatias carregadas sobre gelo com oxigênio-carbonação até o uso. Utilize um pincel para posicionar as lâminas carregadas em uma câmara de perfusão contendo A CSF e fixe as lâminas com um suporte para fatias de tecido.Coloque a câmara de perfusão sobre a platina do microscópio de um sistema de imagem de cálcio e realize a perfusão contínua com A CSF oxigenado e carbonatado à temperatura ambiente. Observe as fatias do OVN carregadas utilizando os comprimentos de onda de fluorescência correspondentes ao corante, que são de trezentos e quarenta a trezentos e oitenta nanômetros para o quatro O 2:00 AM. Utilize o software apropriado para registrar as alterações na razão de cálcio intracelular. Um sistema de perfusão é necessário para induzir a quimioestimulação.Aqui, uma fatia coronal do tecido do órgão vomeronasal de um camundongo, na qual a subpopulação de neurônios que expressa o receptor de feromônio V1Rb2 também expressa GFP, foi imunomarcada contra a proteína tubulina acetilada, mostrada em roxo. Ampliações da fatia demonstram a preservação da integridade do tecido. Neurônios com dendritos longos são observados estendendo-se até a superfície do lúmen, e a expressão da proteína estrutural pode ser vista nos botões dendríticos e microvilosidades para imageamento de cálcio.Os cortes de tecido carregados com FU são inicialmente visualizados usando contraste de fase Hoffman para localizar o campo de interesse, começando pelo vaso sanguíneo, a primeira seta branca; o observador avança lentamente em direção à luz, a segunda seta branca, e à região neuroepitelial. O corpo celular oval do neurônio nasal RO. A terceira seta branca pode ser identificada pelo seu dite longo e fino.A quarta seta branca estendendo-se até a luz, o botão dendrítico neuronal. A quinta seta branca mostra microvilosidades em contato com células carregadas com feromônios RA aqui demonstradas em três 80 nanômetros, que são então iluminadas sequencialmente em três 40 e três 80 nanômetros, e essa razão de comprimentos de onda fluorescentes é representada graficamente, correspondendo às alterações intracelulares de cálcio nos neurônios selecionados, círculos pretos, vermelhos e azuis. Um TP é usado para determinar a viabilidade dos neurônios.Observe a amplitude das respostas de cálcio exibidas nos três neurônios selecionados e o fato de que o neurônio número dois (círculo vermelho) não responde a um TP e, portanto, será descartado da análise subsequente. A estimulação química é então realizada utilizando urina e uma mistura de feromônios de camundongo, observando-se a profundidade da fatia tecidual. Uma subpopulação de neurônios que expressa tanto GFP quanto o receptor V um RRB dois pode ser localizada.Aqui, um neurônio que expressa tanto GFP quanto o receptor V1RB2 é mostrado ao lado de um neurônio que não expressa V1RB2. Ambas as células são carregadas com URA 2:00 AM e o neurônio que expressa V1RB2 exibe um pico de cálcio em resposta à perfusão do ligante do receptor, dois hep conhecido. Curiosamente, o neurônio que não expressa V1RB2 também responde ao dois hep conhecido, demonstrando a complexidade do revestimento de feromônio no Órgão Vomeronasal (VNO).Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como extrair e microdissectar o camundongo para o órgão de mar células a fim de realizar a preparação de fatias de tecido agudas. Este protocolo também é adaptável para investigações fisiológicas utilizando corantes alternativos de cálcio e configurações de microscópio. Boa sorte com o seu experimento.

imaging-pheromone-sensing-mouse-vomeronasal-acute-tissue-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Multieletrodo array (MEA) gravações de fornecer um método para o estudo da atividade elétrica de grandes populações de neurônios. Aqui, apresentamos os detalhes de uma preparação MEA para gravar a partir do epitélio do mouse vomeronasal, ao mesmo tempo estimulando o tecido.

Multieletrodo Recordings Matriz do Epitélio Vomeronasal

O órgão vomeronasal (VNO) detecta sinais químicos intraespecíficos que transmitem informações sociais e reprodutivas. Realizamos experimentos de imagem de Ca2+ utilizando camundongos transgênicos que expressam G-CaMP2 no tecido do VNO. Essa abordagem nos permite analisar os padrões complexos de resposta dos neurônios vomeronasais a um grande número de estímulos de feromônios.

Responses imagem Neuronal em Preparações Slice of Organ Vomeronasal Expressando um sensor de cálcio geneticamente codificado

Este vídeo descreve o isolamento de um órgão vomeronasal de camundongo (VNO) e a preparação de tecido para seccionamento de vibratomo. As seções são usadas para caracterizar os atributos biofísicos e fisiológicos de um grupo específico de neurônios sensoriais.

Preparação de órgão vomeronasal de camundongo para seccionamento de vibratomo

Este vídeo demonstra o registro eletrofisiológico de neurônios sensoriais olfativos (OSNs) em camundongos usando uma técnica de patch-clamp perfurada. O epitélio olfatório, contendo OSNs com receptores de odor marcados com fluoróforo, é isolado de um camundongo e preso em uma câmara de registro. Uma pipeta de registro é presa ao botão dendrítico de um OSN, e a nistatina dentro da pipeta perfura a membrana para formar conectividade elétrica com a célula. Finalmente, outra pipeta é usada para...

Registro perfurado de neurônios sensoriais olfativos em camundongos

O vídeo do protocolo descreve o estabelecimento de um grampo de adesivo de célula inteira para registro eletrofisiológico dos neurônios sensoriais do órgão vomeronasal (VNO) em camundongos. Uma fatia coronal de VNO com neurônios sensoriais marcados com fluorescência é colocada em uma configuração de gravação. Um neurônio marcado é temendado com uma pipeta de registro em uma configuração de célula inteira para registro eletrofisiológico em resposta a estímulos químicos.

Estabelecendo um grampo de remendo de célula inteira para registro eletrofisiológico de neurônios sensoriais vomeronasalis

Um método eficaz para Desossa manual Prepare Intacto Rato tecido nasal com organização anatômica preservada

O mouse do bulbo olfativo acessório (AOB) tem sido difícil de estudar, no contexto da codificação sensorial. Aqui, nós demonstramos uma dissecação que produz uma preparação ex vivo em que os neurônios AOB permanecem funcionalmente ligados às suas entradas periféricas, facilitando a investigação sobre o processamento de informações de feromônios e cairomônios rato.

Ex vivo preparações da Intacta Vomeronasal Órgão e acessórios bulbo olfatório

A análise das propriedades fisiológicas dos neurônios sensoriais olfativos ainda enfrenta limitações técnicas. Aqui, nós os registramos por meio de patch-clamp perfurado em uma preparação intacta do epitélio olfatório em camundongos direcionados ao gene. Esta técnica permite a caracterização das propriedades da membrana e respostas a ligantes específicos de neurônios que expressam receptores olfativos definidos.

Perfurado gravação patch-clamp de rato Olfactory neurônios sensoriais na Intact neuroepitélio: Análise Funcional do Neurônios Expressando uma Odorant Receptor Identificados

Aqui, descrevemos uma abordagem fisiológica que permite a identificação e análise aprofundada de uma população definida de neurônios sensoriais em fatias agudas de tecido coronal do órgão vomeronasal de camundongo usando gravações de patch-clamp de células inteiras.

Análise em profundidade Physiological de populações de células definido no aguda Tissue Fatias do mouse Vomeronasal Organ

Este artigo fornece um protocolo simplificado para a dissecção e dissociação do epitélio olfatório murino para fins de sequenciamento de RNA de núcleo único.

Dissecção rápida e dissociação do epitélio olfatório de camundongo para suspensões de núcleo único

Aprenda a preparar fatias agudas do órgão vomeronasal de camundongos para imagem de cálcio em neurônios individuais. Este método permite estudar respostas a feromônios e identificar pares receptor-ligante em pesquisas olfativas.

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