Imagem Pheromone Sensing em um Preparação Slice rato Vomeronasal aguda do tecido

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer uma preparação de fatias teciduais agudas do órgão nasal RO ou do órgão vomeronasal (VNO) de camundongo, a fim de realizar experimentos de imagem de cálcio em subpopulações e/ou neurônios individuais em tecido vivo. Isso é realizado primeiramente pela extração do VNO do nariz do camundongo e, em seguida, pela microdissecação do mesmo a partir de sua cápsula cartilaginosa sob um microscópio estereoscópico em A CSF frio. Em seguida, o VNO isolado é posicionado verticalmente em um bloco de ágar e fatias teciduais coronais agudas são cortadas utilizando um microtomo para verificar a integridade do tecido.

Algumas lâminas são observadas após imunohistoquímica em um microscópio confocal. Outras lâminas são carregadas com um corante sensível ao cálcio e, em seguida, perfundidas com ligantes putativos de feromônios, sendo a ativação neuronal observada por meio de imagem de cálcio. Este método pode ajudar a resolver questões fundamentais no campo olfativo.

Por exemplo, centenas de receptores de feromônios são expressos no órgão vomeronasal, mas muito poucos deles têm ligantes identificados. Os receptores de feromônios são muito difíceis de expressar em um sistema heterólogo. Precisávamos desenvolver um ensaio eficiente in vivo para atribuir feromônios específicos a receptores específicos.

Podemos usar camundongos tacto onde uma subpopulação específica de neurônios expressa receptores desconhecidos e pode ser identificada pela expressão de GFP. Também poderíamos usar este ensaio para investigar farmacologicamente canais iônicos e enzimas envolvidos na cascata de transdução Fairmont, demonstrando o procedimento. Hoje serão Julian e Fabian, dois pesquisadores do meu laboratório, antes de iniciar a dissecação.

Prepare uma solução fresca e fria de fluido cerebroespinhal artificial, ACSF, saturado com oxicarbono, combinando todos os ingredientes exceto o cloreto de cálcio. Sature a solução borbulhando diretamente com oxicarbono. Em seguida, adicione o cloreto de cálcio e ajuste com água bidestilada até o volume desejado.

Mantenha a solução de LCR A em gelo até o uso. Após a eutanásia e decapitação de um camundongo adulto, prepare uma placa de Petri com LCR A frio e continuamente oxigenado e carbonatado. Após a remoção da mandíbula inferior, coloque a cabeça do camundongo na placa de Petri.

Posicione a cabeça do camundongo sob o microscópio estereoscópico para visualizar o palato. Em seguida, faça uma incisão horizontal na parte superior do palato com tesoura microcirúrgica e remova a membrana do palato com pinça microcirúrgica. Hidrate e limpe a cavidade exposta com um LCR.

Corte a parte superior e inferior do septo nasal. Em seguida, extraia delicadamente o septo nasal contendo o órgão vomeronasal (VNO) e coloque-o diretamente em LCR artificial (A CSF) na posição vertical. Separe as duas partes do VNO utilizando pinças microcirúrgicas.

Identifique a cápsula cartilaginosa do órgão vomeronasal e, em seguida, remova-a delicadamente, certificando-se de que todos os fragmentos cartilaginosos sejam retirados. O órgão vomeronasal isolado, os fragmentos cartilaginosos e o órgão vomeronasal não dissecado são indicados aqui no primeiro ano; prepare agarose de baixo ponto de fusão a 3% e, então, organize o espaço de trabalho com as ferramentas necessárias. Encha o molde de inclusão com agarose e certifique-se de que a temperatura esteja abaixo de 41 graus Celsius antes de submergir o órgão vomeronasal dissecado. Posicione o tecido verticalmente para obter cortes coronais.

Coloque o molde de inclusão sobre gelo por um minuto, até que o cilindro solidifique. Após um minuto, remova o bloco cilíndrico, corte o ágar em formato parametal e, em seguida, cole-o ao suporte do micrótomo usando o micrótomo para cortar fatias coronais do órgão vomeronasal a uma velocidade de 0,5 milímetros por segundo, uma amplitude de 0,7 milímetros e uma espessura de 100 micrômetros em um LCR frio.

Coletar as fatias de tecido com um pincel e colocá-las em uma placa de cultura de tecidos preenchida com A CSF frio para verificar a integridade estrutural das fatias de tecido coletadas, que podem ser fixadas e posteriormente imunomarcadas para componentes do citoesqueleto ou outras proteínas de interesse. Aqui, a imunomarcação contra tubulina acetilada em roxo demonstra a integridade estrutural da fatia de tecido. Além disso, a observação de uma população neuronal específica em que um determinado receptor de feromônio foi marcado com GFP mostra a morfologia neuronal conservada, com neurônios apresentando corpos celulares pequenos e ovais e longos dendritos que alcançam a superfície do lúmen, terminando em microvilosidades, podendo ser observados em um ambiente escuro.

Incube fatias do OVN em uma solução de carregamento contendo A CSF frio com sete micromolares de URA 2:00 AM e 0,1% ônico por uma hora a 37 graus celsius após uma hora. Mantenha as fatias carregadas sobre gelo com oxigênio-carbonação até o uso. Utilize um pincel para posicionar as lâminas carregadas em uma câmara de perfusão contendo A CSF e fixe as lâminas com um suporte para fatias de tecido.

Coloque a câmara de perfusão sobre a platina do microscópio de um sistema de imagem de cálcio e realize a perfusão contínua com A CSF oxigenado e carbonatado à temperatura ambiente. Observe as fatias do OVN carregadas utilizando os comprimentos de onda de fluorescência correspondentes ao corante, que são de trezentos e quarenta a trezentos e oitenta nanômetros para o quatro O 2:00 AM. Utilize o software apropriado para registrar as alterações na razão de cálcio intracelular. Um sistema de perfusão é necessário para induzir a quimioestimulação.

Aqui, uma fatia coronal do tecido do órgão vomeronasal de um camundongo, na qual a subpopulação de neurônios que expressa o receptor de feromônio V1Rb2 também expressa GFP, foi imunomarcada contra a proteína tubulina acetilada mostrada em roxo. Ampliações da fatia demonstram a preservação da integridade do tecido. Neurônios com dendritos longos são observados estendendo-se até a superfície do lúmen, e a expressão da proteína estrutural pode ser vista nos botões dendríticos e microvilosidades para imageamento de cálcio.

Os cortes de tecido carregados com FU são primeiramente visualizados usando contraste de fase Hoffman para localizar o campo de interesse, começando a partir do vaso sanguíneo, a primeira seta branca; o observador avança lentamente em direção à luz, a segunda seta branca, e até a região neuroepitelial. O corpo celular oval do neurônio nasal RO. A terceira seta branca pode ser identificada por seu dite longo e fino.

A quarta seta branca estendendo-se até a luz, o botão dendrítico neuronal. A quinta seta branca indica microvilosidades em contato com células carregadas com feromônios RA aqui mostradas em três 80 nanômetros, que são então iluminadas sequencialmente em três 40 e três 80 nanômetros, e essa razão de comprimentos de onda fluorescentes é representada graficamente, correspondendo às alterações intracelulares de cálcio nos neurônios selecionados, círculos pretos, vermelhos e azuis. Um TP é usado para determinar a viabilidade dos neurônios.

Observe a amplitude das respostas de cálcio exibidas nos três neurônios selecionados e o fato de que o neurônio número dois (círculo vermelho) não responde a um TP e, portanto, será descartado da análise subsequente. A estimulação química é então realizada utilizando urina e uma mistura de feromônios de camundongo, observando-se a profundidade da fatia tecidual. Uma subpopulação de neurônios que expressa tanto GFP quanto o receptor V um RRB dois pode ser localizada.

Aqui, um neurônio que expressa tanto GFP quanto o receptor V1RB2 é mostrado ao lado de um neurônio que não expressa V1RB2. Ambas as células são carregadas com URA 2:00 AM e o neurônio que expressa V1RB2 exibe um pico de cálcio em resposta à perfusão do ligante do receptor, dois hep conhecido. Curiosamente, o neurônio que não expressa V1RB2 também responde ao dois hep conhecido, demonstrando a complexidade do revestimento de feromônio no Órgão Vomeronasal (VNO).

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como extrair e microdissectar o camundongo para o órgão de mar células a fim de realizar a preparação de fatias teciduais agudas. Este protocolo também é adaptável para investigações fisiológicas utilizando corantes alternativos de cálcio e configurações de microscópio. Boa sorte com o seu experimento.