Câncer Colorretal Profiling proteína de superfície celular Usando um Microarray de anticorpos e Multiplexação de fluorescência

O objetivo geral do seguinte experimento é utilizar o microarranjo de anticorpos DOT scan para obter o perfil molecular de antígenos de superfície em tecido de câncer colorretal. Além disso, a multiplexação fluorescente é empregada para distinguir tipos celulares com perfis específicos dentro de uma população mista. Os antígenos de diferenciação celular, ou antígenos CD, foram identificados como possíveis biomarcadores prognósticos ou metastáticos no câncer colorretal.

Esses antígenos são biomarcadores ideais, pois sua expressão geralmente muda com a progressão tumoral ou a interação com outros tipos celulares. Neste vídeo, utilizamos o microarranjo de anticorpos DOT scan para capturar células vivas por meio dos antígenos superficiais expressos. O microarranjo de anticorpos DOT scan consiste em uma lâmina de vidro com uma camada de nitrocelulose.

O painel de micromatriz de anticorpos DOT scan é delimitado por pontos de alinhamento compostos pelos CD29 e CD44. Matrizes duplicadas também são pontilhadas em cada lado da matriz. O primeiro painel consiste nos 82 anticorpos originais da micromatriz de leucemia DOT scan, e 40 anticorpos adicionais foram selecionados com base em seu potencial prognóstico para formar a micromatriz satélite de câncer colorretal.

E o último painel consiste em anticorpos de controle do tipo ice. Aqui, o tecido de câncer colorretal e a mucosa intestinal normal são digeridos e filtrados para obter uma suspensão viável de células isoladas. A suspensão pode ser congelada ou armazenada para uso posterior.

A suspensão celular é utilizada para captura de células em um microarranjo de anticorpos DOT scan, em que antígenos expressos em diferentes subtipos celulares são analisados por multiplexação de fluorescência. Os perfis de expressão resultantes mostram uma alteração significativa na expressão de antígenos entre as células de câncer colorretal e a mucosa intestinal normal. Essa diferença também é refletida na população de leucócitos associada ao tumor.

Agrupamento hierárquico de vários perfis de tumores mostra o agrupamento de assinaturas da doença com os estágios do câncer colorretal. Olá, sou Jerry da Escola de Biotecnologia Molecular da Universidade de Sydney, Austrália, e hoje vou mostrar a vocês um experimento para o perfilhamento de antígenos de superfície em tecido de câncer colorretal. Utilizando um microarranjo de anticorpos em dot scan e multiplexação por fluorescência, os microarranjos em dot scan permitem o perfilhamento de aproximadamente 140 antígenos de superfície em células cancerígenas vivas, juntamente com os leucócitos inflamatórios associados.

Subconjuntos de células capturados em microarranjos podem ser diferenciados usando anticorpos marcados com fluorescência que se ligam a um antígeno marcador altamente expresso nas células de interesse. Até três subconjuntos diferentes de células podem ser analisados em um único microarranjo utilizando rótulos fluorescentes apropriados em anticorpos com três especificidades distintas. O ensaio de microarranjo DOT scan é um método relativamente simples e já foi utilizado anteriormente para o perfilamento da superfície celular de diversos tipos de câncer.

Uma característica fundamental do exame DOT é a sua capacidade de capturar células vivas por meio de seus antígenos de superfície, de modo que o padrão de ligação obtido reflete o perfil da superfície celular. Os antígenos de superfície desempenham um papel importante no desenvolvimento tumoral e na metástase, bem como na resposta inflamatória contra o câncer. Perfis extensivos da superfície ou imunofenótipos podem ser utilizados como assinaturas da doença para aprimorar a classificação do câncer, permitindo um tratamento ideal após a cirurgia.

Ok, vamos começar. No experimento mostrado aqui, amostras clínicas de tumores de câncer colorretal, graus A a D, são coletadas em tampão de Hank. Para iniciar, utilizando duas espátulas, corta-se cuidadosamente o tumor em fatias finas de um milímetro.

Coloque as fatias em uma solução de colagenase tipo quatro a 2% e DNA a 10% para digestão. Seções de mucosa intestinal normal do mesmo paciente são coletadas a 10 centímetros de distância do sítio do tumor primário. Isso serve como nosso controle e é processado de maneira idêntica à amostra tumoral.

A digestão do tumor ocorre a 37 graus Celsius durante uma hora para promover a degradação do tecido conjuntivo; os D ns irão degradar o DNA de quaisquer células danificadas. Após a incubação, a suspensão tecidual é passada através de uma peneira de arame com lavagem chamada tampão de Hanks, enquanto o êmbolo de uma seringa de 10 mil é usado para ajudar a empurrar as células através da peneira. Esse processo é repetido várias vezes até que a maioria das células tenha passado pela malha de arame.

A malha separa as células de qualquer tecido conjuntivo não digerido. Em seguida, filtre ainda mais a suspensão celular aspirando-a com uma seringa de 10 mL e filtrando através de um filtro de 200 micrômetros, seguido por um filtro de 50 micrômetros. Esses filtros mais finos devem garantir a remoção de muco em excesso ou DNA, bem como a dissociação de agregados celulares para obter uma suspensão viável de células isoladas.

O mesmo tratamento é realizado para a mucosa normal. Observamos que a mucosa normal tende a conter mais tecido conjuntivo e, como resultado, exige algumas lavagens adicionais para passar através da malha. Centrifugue a suspensão celular a 410 ×g por cinco minutos a 20 °C. Em preparação para o armazenamento a frio, suspenda o pellet celular com 750 µL de soro fetal bovino, seguido por volumes iguais de soro fetal bovino com DMSO.

Adicione a solução neste DMS. Adicione a solução gota a gota com mistura constante, alíquota o sobrenadante em tubo criogênico e coloque em um recipiente isolante. Essas amostras podem ser armazenadas a menos 80 por até um ano.

O isolamento e o DMSO devem garantir que as células congelem lentamente sem romper. Um efeito colateral do armazenamento é a lise da população de glóbulos vermelhos. Felizmente para nós, eles não são necessários.

Para o experimento, retire as amostras do armazenamento e descarte-as rapidamente. Em banho-maria a 37 graus Celsius, reconstitua a suspensão celular em 10 mL de tampão de Hank; o tampão deve ajudar a diluir o DMSO 10% e o soro de bezerro fetal, e deixe as células em repouso por cinco minutos a 410 ×g e 20 graus Celsius.

Em seguida, decante o sobrenadante e re-suspenda em 500 microlitros de tampão de Hank's; algumas células podem se romper durante o processo de congelamento e descongelamento, causando a liberação de DNA na suspensão. Para contornar esse problema, incube a amostra com 0,1% de DNAsa à temperatura ambiente. Durante esse período, pode-se realizar uma contagem da viabilidade celular.

Misture quantidades iguais de triam azul com 10 microlitros de suspensão celular e pipete 10 microlitros da mistura em um contador de células. Ao microscópio, células saudáveis e viáveis aparecem transparentes. Por outro lado, células não viáveis, com membranas rompidas, aparecerão azuis.

É necessário um mínimo de 4 milhões de células viáveis para o captura celular no anticorpo DOT scan. MICRORAY caindo. O tratamento com DNA lavou as células pela segunda vez com 10 mililitros de tampão de Hank e centrifugou a 410 ×g durante cinco minutos a 20 °C.

Suspendemos a paleta final de células com 200 microlitros de meio RPMI. Esse meio contém relativamente mais nutrientes do que o tampão de Hanks e é utilizado para facilitar a captura celular no micromatriz de anticorpos, mantendo a viabilidade celular. O micromatriz de anticorpos para varredura de pontos de câncer colorretal consiste em 140 diferentes pontos de anticorpos duplicados sobre nitrocelulose.

Cada ponto na matriz contém 10 nanolitros de um anticorpo monoclonal contra o antígeno de superfície celular. Para preparar a matriz de anticorpos, mergulhe-a em uma bandeja com PBS para umedecer a nitrocelulose e limpe a borda de vidro da matriz. Com lenços de papel Kim, tomando cuidado para não tocar a seção de nitrocelulose, coloque a matriz em uma bandeja e pipete a suspensão celular sobre a nitrocelulose.

Uma distribuição uniforme da suspensão celular garantirá que todos os anticorpos tenham potencial para capturar células. Incube o micromatriz a 37 graus Celsius por uma hora. Durante a incubação, diferentes células tenderão a sedimentar e entrar em contato com os anticorpos nas células da matriz.

Apresentar antígenos de superfície correspondentes aos quais o anticorpo se ligará e capturará a célula após a incubação. Lave as células não ligadas mergulhando suavemente as matrizes em três mudanças de PPS fresco. Fixe as células aderidas em solução de PPS a 10% a partir da altura externa.

Pipete suavemente uma quantidade generosa de fixador para cobrir a seção com carga de células nitrificantes. Incube por 20 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, mergulhe as micromatrizes três vezes em PBS fresco.

Deixe as matrizes em PBS para imergir por 30 segundos a cada lavagem, pois o excesso de altura anterior pode interferir na multiplexação de fluorescência. Podemos verificar agora se temos ligação celular mantendo uma micromatriz sob alguma luz para uma análise muito mais precisa. O scanner DOT e o software de análise permitem escanear o padrão de ligação e produzir resultados quantificados da expressão de antígenos em uma população mista de células.

O software compara a intensidade da ligação celular ao ruído de fundo em uma escala de grãos de oito bits. As unidades de intensidade são normalizadas para um valor máximo de 256. Para facilitar a comparação entre um arranjo, qualquer ligação positiva do controle do tipo gelo é subtraída dos anticorpos com os isotipos IG correspondentes.

Adicione 200 microlitros de tampão bloqueador ao microarranjo e incube por 20 minutos à temperatura ambiente. Em preparação para a multiplexação por fluorescência, em 118 microlitros de tampão bloqueador, adicione 10 microlitros de CD três conjugado com fiery e 20 microlitros de epam conjugado com Alexa. Além disso, dois microlitros de soro inativado com he também são adicionados à mistura para prevenir ligação não específica.

Após a conclusão do bloqueio, o tampão de bloqueio é substituído pela solução de multiplexação e incubado no escuro por 30 minutos, à temperatura ambiente. Durante a incubação, os anticorpos conjugados contra CD3 se ligarão às células T que expressam CD3 e estão aderidas ao arranjo, enquanto o anticorpo conjugado contra EPAM se ligará às células epiteliais ou às células de câncer colorretal presentes no arranjo. Em seguida, lave o microrrevestimento três vezes em PBS fresco, deixe secar no escuro e, então, realize a leitura de fluorescência.

A fluorescência é detectada com um scanner Typhoon FLA 9.000. O perfil FICO ery é escaneado usando um laser de 523 nanômetros e filtro de emissão 580 BP 30. EP camm Alexa 647 é escaneado usando um laser de 633 nanômetros e um filtro de emissão 670 BP 30. As imagens fluorescentes resultantes são convertidas para o formato tip para análise.

Utilizando um software de análise de pontos. A multiplexação fluorescente permite-nos distinguir os perfis de antígenos de diferentes populações celulares dentro da mesma amostra de tecido. As imagens mostradas aqui são de uma amostra de câncer colorretal.

Essas três imagens são de uma varredura óptica, uma varredura fluorescente para células que expressam CD3 e uma varredura fluorescente para células que expressam EPAM. Os resultados da micromatriz de varredura por ponto devem mostrar padrões de ligação celular consistentes entre os dois lâminas duplicados. A ligação intensa dos pontos de alinhamento ao longo da borda da lâmina indica que quantidades adequadas de células foram capturadas.

Pode-se gerar um relatório em PDF para fornecer valores quantitativos da ligação celular. O gráfico de barras. Representação da ligação celular mostra uma diferença na expressão do antígeno entre a mucosa normal e a amostra tumoral.

Os resultados ópticos fornecem uma representação geral da expressão de antígenos em todos os tipos celulares dentro da amostra; os resultados da multiplexação AAM mostram um quadro mais claro da diferença na expressão de antígenos entre células epiteliais normais e células cancerosas. Embora muitos dos antígenos diferencialmente expressos sejam biomarcadores conhecidos de câncer colorretal como grupo, eles proporcionam uma assinatura de doença muito mais precisa para estratificação do que qualquer biomarcador isolado poderia alcançar. Os resultados da multiplexação CD três mostram maior quantidade de células T na amostra tumoral em comparação com a amostra normal.

Muitas vezes, os linfócitos T do câncer expressam marcadores de ativação, o que sugere a possibilidade de que esses linfócitos T sejam linfócitos infiltrantes tumorais ou linfócitos T associados à inflamação. Uma análise em larga escala pode ser realizada com o Multi Experiment Viewer versão 4.4, um software aberto para análise de dados e mapas de calor. A agrupamento hierárquico de amostras de câncer colorretal pode ser utilizado para correlacionar com o estágio da doença ou o prognóstico do paciente.

Uma biblioteca extensa de assinaturas de doenças é uma ferramenta valiosa na predição do prognóstico em pacientes com câncer colorretal ou na determinação do curso do tratamento pós-operatório. Acabamos de mostrar o seu procedimento para o perfil de expressão de antígenos de superfície em uma população mista de células em tecido de câncer colorretal, utilizando o microarranjo de anticorpos DOT scan e fluorescência múltipla. Um aspecto importante deste experimento a ser lembrado é que sempre se deve usar tecido fresco e pelo menos 4 milhões de células viáveis são necessários para que este experimento funcione. Obrigado por assistir a este vídeo e boa sorte com os seus experimentos.