Name: Um Ensaio de sangue Funcional inteiro para medir a viabilidade de micobactérias, utilizando-Reporter Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprenda a medir a atividade metabólica de micobactérias em sangue total usando micobactérias marcadas com genes repórter. Este ensaio funcional avalia as interações entre micobactérias e células imunes do hospedeiro em tempo real.

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Este trabalho foi financiado por bolsas pessoal do Wellcome Trust para Beate Kampmann (056.608, GRO77273).

1. Preparação de BCG estoque repórter lux micobactérias <ol><li> Crescer BCG lux (M. bovis BCG cepa Montreal transformado com o plasmídeo pSMT1 shuttle) com agitação a 200 rpm até meados de logarítmica fase em Middlebrook 7H9 caldo contendo 0,2% de glicerol, 0,05% entre 80 e 10% de enriquecimento ADC. </li><li> Prepare 1 ml de uma diluição de 1:10 de BCG cultura lux em PBS estéril em um tubo de luminômetro (900μl de PBS + 100μl BCG cultura lux) em duplicata. </li><li> Carga tubo contendo N-decyl aldeído (substrato da enzima luciferase) na parte traseira da máquina e garantir a tampa é presa e tubos no local. </li><li> Primeiro luminômetro injector com substrato através do programa principal, definido para injectar 100 ucl x 3 em cada um dos três tubos de priming vazias colocadas no luminômetro. </li><li> Carregar os dois tubos no luminômetro e fazer leituras através de um programa conjunto de injectar 100 ucl de substrato em cada tubo e ler por 20 segundos em intervalos de 1 seg. </li><li> Quando o estoque atingiu 1x10 8 RLU / ml a 2x10 8 RLU / ml (isso leva cerca de 3-4 dias de crescimento), adicionar igual volume de glicerol 30% estéril para a cultura em um tubo falcon de 50ml e misture delicadamente. </li><li> Alíquota de 1,5 ml em volumes rotulados microtubo tampa de rosca 2 ml e armazenar a -80 ° C. </li></ol> 2. Determinar ações RLU / UFC correlação e conteúdo de alíquotas <ol><li> Adicionar 15ml de Middlebrook 7H9 meio de cultura com 10% de suplemento ADC para um balão Erlenmeyer 200ml com tampa ventilada. </li><li> Adicionar 15μl de higromicina e 30μl de Tween 20%. </li><li> Remover um frasco de BCG lux do freezer e descongele em temperatura ambiente (RT) no gabinete de segurança. Adicionar o conteúdo do frasco para o meio e apertar a tampa. </li><li> Incube com agitação a 200 rpm a 37 ° C por 4 dias. </li><li> Em cada dia, tornar-se série de 10 diluições (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000 e 1:100.000) para determinação UFC. </li><li> Configurar as diluições mesmo em paralelo e duplicar para determinar luminescência (ver parte 1,2-1,6). </li><li> Prepare dois 3 compartimentos placas de ágar Middlebrook 7H11 (1 l de meio líquido contendo glicerol 0,5%, 10% suplemento OADC, 1 ml de Tween 20% e 1 ml de higromicina). </li><li> Placa fora 100μl de cada diluição em um segmento de cada placa usando propagadores separadas, distribuindo o líquido igualmente através da câmara individual. </li><li> Selar cada placa com parafilme, coloque em um saco plástico estéril, vedação com fita autoclave, e incubar a 37 ° C por 2 semanas com tampa virada para baixo. </li><li> Inspecionar regularmente até aparecer UFC (2-3 semanas). </li><li> Para contar colônias, retire as placas da incubadora e coloque em um contador de colônias. Calcular a média para cada diluição das placas duplicadas. </li><li> Calcular a relação RLU / UFC usando RLU equivalentes e contagem de CFU para cada diluição. A relação deve estar entre 3 e 5 RLU / UFC. </li></ol> 3. Preparação de BCG cultura lux para inoculação em sangue total <ol><li> Adicionar 15ml de Middlebrook 7H9 meio de cultura com 10% de suplemento ADC para um balão Erlenmeyer 200ml com tampa ventilada. </li><li> Adicionar 15μl de higromicina e 30μl de Tween 20%. </li><li> Remover um frasco de BCG lux do freezer e descongele em temperatura ambiente no gabinete de segurança. Adicionar o conteúdo do frasco para o meio e apertar a tampa. </li><li> Incube com agitação a 200 rpm a 37 ° C durante 2 a 4 dias. </li><li> Prepare 1 ml de uma diluição de 1:10 de BCG cultura lux em PBS estéril em um tubo de luminômetro (900μl de PBS + 100μl BCG cultura lux) em duplicata. </li><li> Luminômetro privilegiada, com substrato (como descrito acima), gentilmente vortex os 2 tubos e carregar no luminômetro e fazer leituras (como descrito acima). </li><li> Use esta leitura para diluir até a cultura em PBS para dar o equivalente a 7x10 6 RLU (isso vai dar um inóculo de cerca de 2x10 5 de sangue UFC / ml e um rácio de BCG para os monócitos de cerca de 1:1, assumindo uma contagem de monócitos de cerca de 2x10 5 a 4x10 5 monócitos por ml de sangue). </li></ol> 4. Preparação de sangue total <ol><li> Levar de 3 a 5 ml de sangue venoso em tubo contendo heparina sem conservantes. </li><li> Transferir o sangue para um tubo falcon de 50ml e diluir com um volume igual de RPMI 1640 contendo HEPES glutamina e 25mm (sem pen / strep). </li><li> Alíquota de 900μl de sangue diluída em triplicata em tubos estéreis bijou para cada ponto de tempo (6 tubos no total:. 3 para 0hrs e 3 para 96h Configure tubos adicionais para timepoints adicionais, se necessário. </li><li> Alíquota de 900μl Middlebrooks meio de cultura 7H9 com 10% ADC suplemento + 50μg/ml higromicina (mesmo meio utilizado para a cultura da BCG lux) em duplicata para os controles de crescimento. </li><li> Adicionar 100μl do BCG diluído lux a cada tubo de sangue, e para o controle de duas crescimentotubos. </li><li> Misture bem e coloque os 3 bijous 96h para o ponto do tempo e os 2 controla o crescimento do seu lado na incubadora de balanço a 37 ° C, 20 rev / min (CO 2 não obrigatório). </li></ol> 5. Luminescência de medição (em 0hr e 96h) <ol><li> Centrifugar a 3 bijous em 2000g por 10 min. </li><li> Remova cuidadosamente 300 ul do sobrenadante sem perturbar o sedimento e coloque em 2ml tampa de rosca microtubos para congelar a -80 ° C para análise de citocinas subseqüentes. </li><li> Adicionar 300 ul de PBS a cada bijou para substituir o volume de sobrenadante removido. </li><li> Aspirar o conteúdo de cada bijou para a correspondente tubo falcon de 50ml e adicionar água destilada a cada tubo de 8ml. Iniciar um temporizador de 10 min. NB: Este é um passo sensíveis ao tempo, e esta incubação não deve ser qualquer mais de 10 min, começando a partir de quando as primeiras células entram em contato com a água. </li><li> Enxaguar cada bijou com 2 ml de água destilada e vortex por 5 segundos antes de derrubar para dentro do tubo falcon correspondente. </li><li> No final da incubação de 10 minutos, centrifugar os tubos falcon de 2000g por 10 minutos. </li><li> Decantar o sobrenadante em desinfetante Surfanios. </li><li> Adicionar algumas esferas de vidro a cada pellet e vortex. </li><li> Adicionar 1 ml de PBS estéril para cada tubo e vortex. </li><li> Em tubos luminômetro, fazer diluições 1:10 de cada amostra em duplicata com PBS (amostra + 900μl PBS 100μl) e no tempo 96h-ponto. Fazer as diluições mesmo para cada um dos controles de crescimento. </li><li> Suavemente os tubos vortex e carregar no luminômetro e fazer leituras (como descrito acima) Nb: Leituras entre triplicatas de uma mesma amostra deve ser de 15% uma da outra. </li></ol> 6. Resultados representativos: É importante o uso de bactérias na fase logarítmica de crescimento para os ensaios de sangue total lux, ou seja, cresceu mais de 48-72 horas antes da inoculação das amostras, como atividade metabólica é suboptimal se qualquer direto para fora do freezer ou em fase estacionária. O crescimento, antes deve ser padronizado para uma série de experimentos a 48 ou 72 horas para evitar a variabilidade. A Figura 1 mostra a curva de crescimento de uma cultura representativa da BCG lux. O tempo de duplicação é de cerca de 24 horas até fase estacionária é alcançado. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Curva de crescimento Representante do BCG lux mais de 96 horas em meio 7H9 e correlação de RLU e UFC. Embora os valores de RLU sempre se correlacionam com UFC, o número de RLU correspondente a um único UFC pode variar dependendo do estoque, que é por isso que é boa prática usar o mesmo estoque congelado durante uma série de experimentos para garantir uma multiplicidade consistente de infecção ( MOI). A Tabela 1 mostra um exemplo de data-primas no momento da inoculação (T 0) e em 96 horas. Os rácios de crescimento são calculadas usando a fórmula T 96 / T 0, mas outros intervalos de tempo, claro, também pode ser medido. É, no entanto, não aconselhável a utilização de culturas para além das 96 horas, como a morte celular significativa ocorra. <img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/3332/3332table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabela 1"> Tabela 1. Exemplo de dados brutos em tempo de inoculação (T0) e em 96 horas (T96) e rácios de crescimento calculados a partir de 3 dadores adultos. Dependendo do antígeno específico disponível respostas de memória ea contagem de neutrófilos, possivelmente, também, os rácios de crescimento variam entre indivíduos, como mostrado aqui na Figura 2 no sangue de crianças com e sem infecção pelo HIV. Em média, as crianças têm maiores taxas de crescimento do que os adultos, teste tuberculínico (TST) + ve indivíduos têm relações um crescimento inferior ao TST ve-indivíduos, e pacientes infectados pelo HIV tem rácios de crescimento devido à deficiência da população de células CD4 T, um dos principais mediadores da resposta imune celular de micobactérias. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 Inter-doador variabilidade:. Índices de crescimento de T 0 versus 96 horas de um conjunto de pacientes, dependendo do estado HIV subjacente. Reprodutibilidade dos índices de crescimento ao longo de um período de tempo é mostrado na Figura 3, que resume os resultados de 64 doadores sangrou duas vezes durante um período de 12 meses e de um único doador sangrou várias vezes para experimentos de controle. Causas potenciais de variabilidade podem ser mudanças na sensibilização por micobactérias ou variabilidade dentro de níveis de citocinas host, como observado em bioensaios de muitos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. (A) único doador em 12 ocasiões em 12 meses. (B) múltiplas (64) doadores em 2 ocasiões com mais de 12 meses.

<ol><li>Cheng, S. H., Walker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+increased+anti-mycobacterial+activity+in+peripheral+blood+monocytes+after+BCG+vaccination+in+British+school+children%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children.</a> Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).</li>
<li>Cheng, S. H., Walker, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+antimycobacterial+activity+before+and+after+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+in+Chingleput%2C+India%2C+and+London%2C+United+Kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom.</a> Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).</li>
<li>Silver, R. F., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+human+monocytes%3A+virulence+correlates+with+intracellular+growth+and+induction+of+tumor+necrosis+factor+alpha+but+not+with+evasion+of+lymphocyte-dependent+monocyte+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions.</a> Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).</li>
<li>Hoft, D. F., Worku, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+relationships+between+immune-mediated+inhibition+of+mycobacterial+growth+and+other+potential+surrogate+markers+of+protective+Mycobacterium+tuberculosis+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity.</a> J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).</li>
<li>Worku, S., Hoft, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+control+and+antigen-specific+T+cells+on+intracellular+mycobacterial+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth.</a> Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).</li>
<li>Kampmann, B., Gaora, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+human+antimycobacterial+immunity+using+recombinant+reporter+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria.</a> J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).</li>
<li>Cheon, S. H., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactericidal+activity+in+whole+blood+as+a+potential+surrogate+marker+of+immunity+after+vaccination+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).</li>
<li>Janulionis, E., Sofer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+activity+of+orally+administered+clofazimine+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis+in+whole-blood+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).</li>
<li>Kampmann, B., Tena, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+human+in+vitro+system+for+evaluating+antimycobacterial+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines.</a> Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).</li>
<li>Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+antimycobacterial+immune+responses+in+HIV-infected+children+receiving+HAART%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART.</a> Aids. 20, 1011-1018 Forthcoming.</li>
<li>Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+dose+of+vitamin+D+enhances+immunity+to+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria.</a> Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Ensaios bactericida no contexto da pesquisa vacina contra a tuberculose estão bem estabelecidos em modelos animais, onde são aplicados para a tela vacinas candidatas potencialmente promissoras. Redução da carga bacteriana em várias funções órgãos como a principal leitura de imunogenicidade. A primeira geração de humanos ensaios bactericida foram projetados usando macrófagos sozinho, infectados com M. tuberculose. CFU serviu como a principal leitura de sobrevivência de micobactérias ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Companhia </td><td> Cat Não </td></tr><tr><td> BCG lux </td><td> Vários </td><td> n / a </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H11 agar </td><td> Becton Dickinson </td><td> 283810 </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H9 caldo </td><td> BD Biosciences </td><td> 271310 (500g) </td></tr><tr><td> Middlebrook enriquecimento ADC </td><td> BD Biosciences </td><td> 212352 </td></tr><tr><td> Middlebrook suplemento OADC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 212240 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 274364 </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G5150 </td></tr><tr><td> Higromicina B </td><td> Roche </td><td> 10843555001 (20ml) </td></tr><tr><td> N-decyl aldeído </td><td> Sigma </td><td> D7384-100G </td></tr><tr><td> Etanol (&gt; 99,7%) </td><td> VWR </td><td> 101077 </td></tr><tr><td> PBS estéril </td><td> Em Casa </td><td> n / a </td></tr><tr><td> RPMI-1640 com HEPES, L-Glutamina 25mM </td><td> Sigma </td><td> R0883 </td></tr><tr><td> Água destilada estéril </td><td> Em Casa </td><td> n / a </td></tr><tr><td colspan="3"> Equipamento </td></tr><tr><td> Luminômetro tubo (porta injetável obrigatório) </td><td> Berthold AutoLumat LB953 ou single-tubo luminômetro Sirius </td><td></td></tr><tr><td> Tubos luminômetro, 12 x 75mm, pirex sem aro </td><td> Corning da VWR </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> Erlenmeyers com tampas ventiladas, estéril policarbonato 250ml </td><td> Corning via Fisher Scientific </td><td> 2150329 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Sangue Coleta Tubes (isenta de conservantes heparina) </td><td> BD </td><td> 367676 </td></tr><tr><td> Falcon 50ml tubos, cônico </td><td> BD </td><td> 352077 </td></tr><tr><td> 7ml espécime STERILIN polipropileno bijou tubos </td><td> VWR </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> STERILIN Universal recipientes (30 ml) </td><td> Laboratório de Análises LTD </td><td> 128C </td></tr><tr><td> Contas de vidro 2mm de diâmetro </td><td> SigmaAldrich </td><td> Z143928 </td></tr><tr><td> 10ml pipetas e um menino de pipeta </td><td> qualquer </td><td></td></tr><tr><td> 1000μl e 200μl pipetas e pontas com filtro </td><td> qualquer </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Equipamento geral de laboratório: </td></tr><tr><td> Classe II de segurança gabinete gabinete </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Geladeira (4 ° C) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Centrifugador </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rocking shaker plataforma (180 0) para misturar os tubos </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Orbital Shaker incubadora a 37 ° C para crescer culturas bacterianas </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio de sangue funcional inteiro para medir a viabilidade de micobactérias, utilizando-reporter gene tagged bcg ou m. tb (bcg lux / m. tb lux)

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Ensaios funcionais há muito tempo desempenhou um papel fundamental na medição da imunogenicidade de uma vacina dada. Este é convencionalmente expressa como soro títulos bactericida. Estudos de soro títulos bactericida em resposta a vacinas infantis nos permitiram desenvolver e validar níveis de corte para respostas imunes protetoras e tal cut-offs estão em uso rotineiro. Sem tais ensaios foram levadas adiante na avaliação de rotina de vacinas que induzem principalmente a imunidade mediada por células em forma de respostas de células T efetoras, tais como vacinas contra a tuberculose. No modelo animal, o desempenho de um candidato a vacina dada é rotineiramente avaliada em ensaios padronizados bactericida, e todos os atuais romance TB vacina candidatos foram submetidos a esta etapa na sua avaliação antes da fase 1 de testes em humanos. A avaliação da imunogenicidade e, portanto, a probabilidade de eficácia protectora do romance de vacinas anti-TB deve idealmente submetidos a uma avaliação por etapas semelhantes nos modelos humanos agora, incluindo medidas em ensaios bactericida. Ensaios bactericida no contexto da pesquisa vacina contra a tuberculose já estão bem estabelecidos em modelos animais, onde eles são aplicados a tela de vacinas candidatas potencialmente promissoras. Redução da carga bacteriana em várias funções órgãos como a principal leitura de imunogenicidade. No entanto, nenhum de tais ensaios foram incorporados ensaios clínicos para novos medicamentos anti-TB vacinas até o momento. Embora ainda haja incerteza sobre os mecanismos exatos que levam à morte de micobactérias no interior dos macrófagos humanos, a interação de macrófagos e células T com micobactérias é claramente necessária. O ensaio descrito neste trabalho representa uma geração nova de ensaios bactericida que permite estudos de tal chave componentes celulares com todos os outros fatores celular e humoral presentes no sangue inteiro sem fazer suposições sobre sua contribuição relativa individual. O ensaio descrito pelo nosso grupo utiliza pequenos volumes de sangue total e já foi empregada em estudos com adultos e crianças em TB endêmica configurações. Nós mostramos imunogenicidade da vacina BCG, aumento do crescimento de micobactérias em pacientes HIV-positivos, bem como o efeito da terapia anti-retroviral e vitamina D sobre a sobrevivência de micobactérias in vitro. Aqui resumimos a metodologia e apresentar os nossos dados de reprodutibilidade usando este modelo relativamente simples, de baixo custo e de campo-friendly. Nota: Definições / Abreviaturas BCG lux = M. bovis BCG, cepa Montreal, transformada com pSMT1 shuttle plasmídeo carregando a genes de Vibrio harveyi luxAB, sob o controle do GroEL micobactérias (Hsp60) promotor. UFC = Unidade Colony Forming (uma medida de viabilidade de micobactérias).

Descrevemos uma abordagem alternativa para a enumeração de micobactérias<em&gt; In vitro</em&gt;, Que usa repórter gene-tagged micobactérias em vez de unidades formadoras de colônia (UFC). &quot;Survival&quot; de organismos, bem como anfitrião-resposta marcadores são medidos simultaneamente, proporcionando um sistema de baixo custo, versátil e funcional para os estudos de host / patógeno interações no contexto da tuberculose.

Um Ensaio de sangue Funcional inteiro para medir a viabilidade de micobactérias, utilizando-Reporter Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Ensaios funcionais desempenham há muito tempo um papel fundamental na medição da imunogenicidade de uma determinada vacina. Isso é convencionalmente expresso como bactericida sérico...

Este ensaio in vitro mede a atividade metabólica de micobactérias em sangue total para avaliar o efeito das interações entre micobactérias e células imunes do hospedeiro. Primeiro, adicione micobactérias marcadas com gene relator ao sangue humano total, a fim de obter uma leitura em tempo real ao longo de um período. Colete os sobrenadantes das amostras para medições de citocinas e os pellets celulares para análises de RNA, continue lisando os glóbulos vermelhos e, utilizando diluições seriadas e bioluminescência, meça a atividade metabólica das micobactérias.Por fim, calcule a razão entre o sinal final de bioluminescência, expresso em unidades relativas de luz, e o sinal de bioluminescência no momento da inoculação. Os resultados indicam a capacidade do hospedeiro de conter as micobactérias. Este ensaio gênico relatado em sangue total pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área.Por exemplo, a presença de certas células imunes efetoras em uma amostra de sangue tem um impacto funcional sobre os organismos neste caso? Microbactérias. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que a enumeração de micobactérias pode ser obtida em tempo real, ao in

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra a preparação e quantificação do inóculo lux de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin usando ensaio de bioluminescência e a enumeração de unidades formadoras de colônias. O inóculo preparado pode ser usado para estudos de infecção.

Preparação e quantificação do inóculo de Mycobacterium bovis BCG lux para infecção

Este vídeo mostra a medição da carga bacteriana in vivo usando Bacillus Calmette-Guérin, BCG, larvas de insetos infectados com lux. O processo envolve homogeneização larval, tratamento com substrato de luciferase e medição de bioluminescência para determinar unidades de luz relativas que se correlacionam com a carga bacteriana.

Medição da carga in vivo de bactérias que expressam luciferase em uma larva de inseto

Descreve-se um método para controlar a ruptura endomembranar provocada pelas bactérias...

Medidas de ruptura vacuolar única célula causadas por patógenos intracelulares

Aqui, descrevemos um ensaio fenotípico aplicável às telas de alto rendimento/alto conteúdo de pequenas interfissões de RNA sintético (siRNA), composto químico e bibliotecas mutantes mycobacterium tuberculosis. Este método baseia-se na detecção de Mycobacterium tuberculosis rotulado fluorescentemente dentro de célula hospedeira fluorescente rotulada usando microscopia confocal automatizada.

Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

Nós desenvolvemos um sistema de rastreio de alto rendimento modular para descobrir novos compostos contra o Mycobacterium tuberculosis, direccionamento intracelular e em caldo de crescimento de bactérias, bem como a citotoxicidade contra a célula hospedeira de mamífero.

Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Novos modelos e ensaios que melhorariam o processo inicial de desenvolvimento de medicamentos para a próxima geração de medicamentos antituberculose são altamente desejáveis. Aqui, descrevemos um ensaio rápido, barato e compatível com BSL-2 para avaliar a eficácia do medicamento contra Mycobacterium tuberculosis que pode ser facilmente adaptado para triagem de alto rendimento.

Um ensaio Compatível de alta capacidade para avaliar droga Eficácia contra macrófagos passadas<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Uma nova técnica para antígeno rápida exposição sobre uma superfície bacteriana é apresentada, que envolve a superfície biotinylation seguido por exposição às proteínas de interesse em fusão com avidin monomérico. Carregando a BCG com antígenos selecionados com êxito melhora sua imunogenicidade, sugerindo que a decoração de superfície pode substituir abordagens genéticas tradicionais.

Expressão de antígenos exógenos a Mycobacterium bovis BCG através da decoração de superfície Non-genética com o sistema de avidina-biotina

A Galleria mellonella foi recentemente estabelecida como um modelo de infecção reprodutível, barato e eticamente aceitável para o complexo Mycobacterium tuberculosis . Aqui nós descrevemos e demonstramos as etapas tomadas para estabelecer a infecção bem sucedida de G. mellonella com o Lux bioluminescente do Mycobacterium bovis BCG .

Uso do invertebrado Galleria mellonella como modelo de infecção para estudo do complexo Mycobacterium tuberculosis

Descrevemos um teste de ensaio de carga bacteriana molecular de tuberculose realizado após a inativação do calor da escória. A inativação do calor torna as amostras de espelo não infecciosas e evita a necessidade de laboratórios de nível de contenção 3 para testes moleculares de tuberculose.

Um ensaio de carga bacteriana molecular de tuberculose (TB-MBLA)

A determinação de unidades formadoras de colônias (UFC) é a técnica padrão-ouro para quantificar bactérias, incluindo o Mycobacterium tuberculosis , que pode levar semanas para formar colônias visíveis. Aqui descrevemos uma micro-UFC para determinação de UFC com maior eficiência de tempo, redução do espaço de laboratório e custo do reagente, e escalabilidade para experimentos de médio e alto rendimento.

Ensaio de Unidade Formadora de Microcolônias para Avaliação da Eficácia de Vacinas Contra Tuberculose

Este estudo desenvolveu um ensaio para triagem de alto rendimento contra Mycobacterium abscessus com uma cepa repórter dupla recém-criada, usando fluorescência e luminescência para avaliar a viabilidade bacteriana rapidamente. Este protocolo será relevante para pesquisadores que pretendem rastrear novos medicamentos contra essa bactéria resistente a medicamentos.

Desenvolvimento de ensaio para triagem de medicamentos de alto rendimento contra micobactérias

Aprenda a medir a atividade metabólica de micobactérias em sangue total usando micobactérias marcadas com genes repórter. Este ensaio funcional avalia as interações entre micobactérias e células imunes do hospedeiro em tempo real.

Um Ensaio de sangue Funcional inteiro para medir a viabilidade de micobactérias, utilizando-Reporter Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux) (Vídeo) | JoVE Journal

Um Ensaio de sangue Funcional inteiro para medir a viabilidade de micobactérias, utilizando-Reporter Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

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