Name: Uma técnica simplificada para a produção de um modelo de ferida isquêmica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Aprenda uma técnica minimamente invasiva para criar feridas isquêmicas em orelhas de coelhos, especialmente adequada para modelos diabéticos. Este método simplificado permite estudar a cicatrização de feridas com mínima disrupção cutânea.

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Este estudo foi financiado em parte pelo NIH concede 1RO1DK74566 e 1RO1AM52984. Os autores gostariam de agradecer a Sra. Jacqueline McCarty em RRC por sua ajuda durante a cirurgia, os drs. Jianpu Wang e Harshini Sarojini por sua ajuda na cirurgia e no pós-operatório de cuidados de alguns coelhos, Dr. Wan Rong por seu trabalho, histologia e Sra. Ming Li para medições de seus HPLC de fosfatos de alta energia.

1. Base anatômica A orelha de coelho tem sido um material de estudo privilegiado para o tratamento de feridas desde o século 20. O ouvido é fornecida por três feixes vasculares (central, cranial e caudal), o feixe central é o maior, enquanto os navios nos pacotes cranial e caudal variam em tamanho. Ocasionalmente, a artéria caudal pode estar ausente. 1 Todos estes vasos são facilmente identificadas no lado dorsal após a orelha é raspada (Fig. 1). No lado ventral, a pele distai não recebe fornecimento de sangue a partir dos vasos proximais. Os três feixes de vasos na orelha dorsal têm numerosos ramos que penetram através da cartilagem para fornecimento de sangue para a pele distai ventral (Fig. 2). Em alguns coelhos, uma muito pequena vaso subcutânea também ocorre no lado ventral, que fornece sangue a não mais do que 1/3 da pele ventral. Em uma incisão na pele aberta circunferencial, há Essencialmente sangramento NO a partir de uma incisão ventral. 2. Procedimento Cirúrgico <ol><li> O coelho é pesado e as orelhas são raspadas, juntamente com a parte de trás do pescoço. </li><li> Um pré-medicação de buprenorfina (0,01 mg / kg) é administrada por via IM, uma hora antes da cirurgia. </li><li> A anestesia é induzida por uma mistura de cetamina (50 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) por via IM. </li><li> O coelho é protegido com uma almofada de aquecimento durante a cirurgia, os olhos são protegidos com pomada, e os seus sinais vitais são monitorados durante a cirurgia. </li><li> O campo cirúrgico é preparado assepticamente com uma paramentação e envolto de modo que as duas orelhas estão expostos. </li><li> Uma orelha é processado isquémica, enquanto a outra orelha serve como um controlo emparelhado não-isquémica. </li><li> Os três pedículos vasculares são identificados pelas artérias e veias. </li><li> Usando uma lâmina # 15, três pequenas incisões verticais (1-1,5 cm) são feitas sobre os pedículos vasculares, cerca de 1-2 cm da base da orelha. </li><li> A veia central éisolado a partir dos tecidos circundantes e uma sutura é usado para a rodeiam para a retracção. A artéria central está ligado com suturas 4-0 e dividido. </li><li> O nervo acompanha central também está cortado. </li><li> O pedículo cranial toda é ligada e dividida. </li><li> O pedículo caudal é preservada. </li><li> Um túnel subcutâneo é feito através das 3 incisões. Isto é conseguido por meio de dissecção romba com um grampo e dissecações cortantes com uma faca e tesoura. Todos os tecidos subcutâneos, músculos, nervos e pequenos ramos vasculares são interrompidas. Os vasculatures pequena debaixo da derme são totalmente dividido. Todos os tecidos subcutâneos são cortadas ao nível da cartilagem, com a lâmina. </li><li> Dissecções mais nítidas e sem corte são usados ​​para limpar a base, deixando uma cartilagem nua sobre 5-10 mm de largura. </li><li> Este procedimento interrompe todos os ramos vasculares subcutâneas para impedi-los de rápido estabelecimento de garantias. </li><li> O sangramento émínima. Se não houver qualquer, é facilmente controlada por compressão de gaze, sem a necessidade de electrocauterização. </li><li> A pele no interior do ouvido não carrega suprimento de sangue muito e, portanto, não é incisada. </li><li> Os 3 incisões na pele são fechadas com suturas 4-0 ou 5-0, e coberto com gaze estéril. </li><li> Os resultados do procedimento em 3 pequenas incisões na pele e incorre em danos a pele muito menos de uma cirurgia aberta. </li><li> Quatro circulares feridas de espessura total de pele são criados no lado ventral de cada orelha com um 6-mm de aço inoxidável perfurador. A distância entre as feridas é de pelo menos 20-30 mm. A pele dentro da ferida perfurador é removido da cartilagem. O pericôndrio também é removido, com a pele ou separadamente. A base em que granulação e epitelização ter lugar é a cartilagem, mas a cartilagem não é perfurada (Fig. 3). </li><li> Quando as feridas em ambas as orelhas são completadas, a droga de teste é aplicado a um lado de duas feridas enquanto a droga de controlo é applied para as feridas do outro lado. Um penso oclusivo (Tegaderm, 3M) é usado para cobrir o local da ferida. Isso impede que as feridas de se tornar dessecado. </li><li> As feridas na porção inferior da orelha normalmente curar mais rápido do que as feridas na parte superior da orelha. Para ferida estudo de comparação de cura, é recomendado para comparar os dois feridas de um lado com as duas feridas no outro lado, ou para comparar o topo e de fundo feridas separadamente. </li></ol> 3. Cuidados Pós-Operatórios <ol><li> Um adesivo Duragesic é ligado à pele de volta para libertação de fentanilo (25 ug / hora) durante 2-3 dias para reduzir a dor possível. </li><li> Os coelhos têm acesso livre à comida e à bebida. </li><li> As trocas de curativos são realizados diariamente. Os pensos antigos são removidos e as feridas são limpos com cotonetes estéreis. As fotos digitais são tiradas para comparação. Pensos novos são aplicados, e as feridas são cobertas novamente por Tegaderm. Nenhum anestésico é necessário durante a vestir changes. </li><li> A temperatura da pele é medida diariamente em cada orelha para comparação. </li><li> A circulação de sangue adicional orelha pode ser medido com um medidor de tensão transcutânea de oxigénio ou um laser caudalímetro Doppler. </li><li> As suturas podem ser removidos após uma semana. </li><li> Para animais não diabéticos, a maioria das feridas da orelha geralmente curar dentro de 2-3 semanas. </li></ol> 4. Complicações potenciais e como evitá-los Esta cirurgia minimamente invasiva é seguro e as complicações são raras. Exceto por um período de transição pós-operatório edema de orelha leve, nenhum dos nossos coelhos teve quaisquer complicações graves cirúrgicos. No entanto, existem diversas complicações potenciais para este procedimento: <ol><li> Sangramento. A hemorragia pode ocorrer nas incisões se hemostasia é incompleta ou se um vaso de sangue maior (tal como um dos vasos principais pediculares) está danificado. Isso é facilmente evitada por dissecção cuidadosa. Para além das três principais feixes vasculares, ali umre muitos ramos menores subcutâneos vasculares. Quando o túnel subcutâneo é feita, estes vasos estão a ser cortado, mas não amarrar é necessário. A hemostasia pode ser alcançada simplesmente pressionando gaze. Isto é feito facilmente através da inserção de um canto da gaze para dentro do túnel durante alguns minutos. Antes de fechar a incisão, certifique-se sem sangramento ativo está presente. </li><li> Infecção da ferida e deiscência: Estas complicações podem ocorrer se as incisões são contaminados. Isto pode ser evitado pelo uso de uma técnica asséptica rigorosas e nenhum antibiótico é necessário. No entanto, se a infecção ocorre drenagem, apropriado e mudanças de pensos são necessários. </li><li> Edema de orelha: Devido à ligadura vascular e interrupção da circulação linfática, edema de orelha leve podem apresentar por alguns dias. No entanto, desaparece por si só e não é necessário tratamento. </li></ol> 5. Os resultados representativos Desde 2007, temos usado este procedimento em mais de 70 coelhos, incluindo 23 diabéticos umimals. No grupo de diabéticos, a cirurgia foi realizada em dois tempos diabéticos diferentes: sete coelhos tiveram duas semanas de tempo diabético, quatro tinham dois meses, dez tinham 12 meses e 2 tinha 24 meses de tempo de diabetes. Imediatamente após a cirurgia, a orelha isquêmica pareceu fria e cianótica, com edema leve. A orelha mais importante da artéria central da artéria--tinha um forte impulso na orelha normal, mas este pulso não estava presente no ouvido isquémico. Movimento orelha foi reduzida, mas não desaparecer totalmente. A pele mostrou depressões claros ao longo do túnel, mas sem isquemia ou necrose foi encontrada em qualquer animal (Fig. 4). As temperaturas da pele das orelhas normais e isquêmicas foram medidas com um termômetro digital (por Omron Omron Healthcare, Bannockburn, IL, ou um tipo K termômetro infravermelho local por Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). As diferenças de temperatura entre a orelha não-isquémica e isquémica variou de 1 a 10 ° C, with a maioria dos coelhos que caem dentro da gama de 2-6 ° C. Fig. 5 mostra as diferenças de temperatura média de 30 coelhos. A diferença de temperatura foi maior nos primeiros dias após a cirurgia, decresceu gradualmente após dia 15, mas foi ainda mantido no fim de um mês. Conteúdo de tecidos de alta energia de fosfato foram medidos em alguns animais depois de terem sido sacrificados. Seis amostras de tecido foram tomadas de cada ouvido e conteúdo de alta energia de fosfato foram medidos por HPLC. Tanto o ATP e as concentrações totais de energia eram mais elevados nos ouvidos normais do que nos ouvidos isquémicos. Fig. 6 mostra um exemplo de um coelho sacrificados 23 dias após a cirurgia. O conteúdo de tecidos médios de ATP foram 0,349 ± 0,047 mmol / g (média ± DP) na orelha normal vs 0,237 ± 0,059 mmol / g no ouvido isquêmica (p &lt;0,005). A energia média (ATP + ADP + AMP) foi 0,882 ± 0,137 mmol / g, na orelha normal versus 0,556 ± 0,115 mmol / g, na isquemia microfone auricular (p &lt;0,001). Tempos de cura de feridas eram sempre mais longo para o ouvido isquémica do que para o ouvido não-isquémica em todos os grupos (não-diabéticos ou diabética). Fig. 7 mostra uma comparação de cura entre 26 pares de feridas nas orelhas isquémicos e não-isquémica. Tempos de cura variou de 13 a 18 dias, com média de 14,9 ± 1,6 dias) nas orelhas normais vs 17 a 27 dias, com média de 20,5 ± 3,4 dias) nas orelhas isquêmica (p = 0,001). Vezes cicatrização de feridas em coelhos idade e diabético foram muito mais tempo, especialmente quando o tempo diabética era mais do que 12 meses. Nestes coelhos, todas as incisões curadas normalmente sem quaisquer complicações, incluindo os coelhos com 24 meses de tempo de diabético. A Figura 8 é uma amostra que mostra a histologia curado túnel subcutâneo em que o músculo está ausente e é substituído por tecido fibroso. No entanto, a pele está intacta. / 3341fig1.jpg "/&gt; Figura 1. A orelha de coelho é fornecido por três feixes vasculares. O central é o maior, o crânio é menor, eo feixe é o menor caudal. Estes vasos são facilmente visíveis na superfície após o ouvido é raspada. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3341/3341fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Os três feixes de vasos no sangue dorsal da orelha de abastecimento não só para a pele dorsal, mas também para a pele ventral através dos vasos penetrantes. A seta mostra os vasos penetrantes através da cartilagem. Os shows de inserção seção transversal destes navios. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3341/3341fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Quatro 6 mm-feridas são criados no lado ventral da orelha, eo pericôndrio também é removida. A base em que granulação e epitelização ter lugar é a cartilagem, mas a cartilagem não é perfurada. O smal 3 incisões na pele l estão fechados com o rompimento da pele muito pouco. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3341/3341fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Após as incisões na pele estão fechados, o recuo ao longo do túnel subcutâneo é claramente visto. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3341/3341fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. A diferença de temperatura média da pele entre a orelha normal e isquémica em 30 coelhos. As gamas de diferença iniciais a partir de 7 ° C a 10 ° C após a cirurgia. A diferença diminui gradualmente, mas ainda mantido no fim de um mês. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3341/3341fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Ouvido tecido conteúdo fosfatos de alta energia são reduzidos no ouvido isquêmico, em comparação com não-isquêmica ouvido em 23 dias após a cirurgia (p &lt;0,001). 41/3341fig7.jpg "/&gt; Figura 7. Tempo de cura de feridas é mais tempo nas orelhas isquémicas do que as orelhas não-isquêmicos (26 feridas cada). A cura é definida como a restauração da integridade dos tecidos danificados, ie, a reepitelização completa dos locais de feridas. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3341/3341fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Histologia exemplo mostrando a porção de orelha contendo túnel subcutâneo. O tecido curado é mais fino do que orelha normal, o músculo esquelético inicial está ausente e é substituído por tecido fibroso. No entanto, a pele está intacta.

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Não há conflito de interesse financeiro envolvido neste estudo.

Diabetes afeta 23,6 milhões de pessoas em os EUA, 2,3 e 15-20% desses pacientes desenvolvem úlceras nos pés em sua vida, 4,5, a um custo anual de tratamento de mais de US $ 25 bilhões. 3,6 No entanto, mesmo o melhor disponível tratamentos alcançar somente uma taxa de cura de 50% e esta é geralmente temporária, 7, com taxas de recorrência tão altos quanto 66% em diabéticos 3,6. Quando ocorrer úlceras em pacientes diabéticos, as principais complicações, como infecção ...

Para o monitoramento durante a cirurgia <ol><li> A almofada de aquecimento para manter a temperatura normal. </li><li> Um monitor de oxigênio. </li><li> Um monitor de temperatura. </li></ol> Para a cirurgia <ol><li> Uma faca # 3 com # lâmina 15. </li><li> Dois pares de pinças (uma para a pele e outro para outros tecidos moles). </li><li> 2-3 pares de pinças de pequenas dimensões. </li><li> Um ou dois pares de tesoura micro (para o corte de tecido). </li><li> Um par de tesouras pequenas (para cortar suturas). </li><li> Um porta-agulha. </li><li> Alguns golpes de aço inoxidável (para fazer feridas). </li></ol>

uma técnica simplificada para a produção de um modelo de ferida isquêmica

A Simplified Technique for Producing an Ischemic Wound Model

Um obstáculo importante na investigação da ferida corrente diabética é a falta de um modelo de ferida isquémico que podem ser utilizados com segurança em animais diabéticos. As drogas que funcionam bem em não-isquêmicas feridas podem não funcionar em feridas diabéticas humanos porque vasculopatia é um importante fator que dificulta a cura dessas feridas. Nós publicamos um artigo em 2007 descrevendo uma orelha de coelho modelo ferida isquêmica criado por uma técnica cirúrgica minimamente invasiva. Desde então, têm ainda mais simplificado o procedimento para facilitar a operação. Em uma orelha, três pequenas incisões na pele foram feitas nos pedículos vasculares, 1-2 cm da base da orelha. A artéria central foi ligado e corte ao longo com o nervo. O pacote inteiro craniana foi cortado e ligado, deixando apenas o ramo caudal intacta. Um túnel subcutâneo circunferencial foi feita através das incisões, para cortar tecidos subcutâneos, músculos, nervos e vasos pequenos. A outra orelha foi utilizado como um controlo não-isquémica. Quatro feridas foram feitas na parte ventral of cada orelha. Esta técnica produz 4 feridas isquêmicas e 4 não-isquêmicas feridas em um animal para comparações pareadas. Após a cirurgia, a orelha isquêmica foi legal e cianótica, e mostrou o movimento reduzido e falta de pulso na artéria da orelha. A temperatura da pele da orelha isquémica foi 1-10 ° C mais baixa do que na orelha normal e esta diferença foi mantida por mais de um mês. Ear tecido conteúdo fosfatos de alta energia foram menores na orelha isquémica do que a orelha de controlo. Vezes da cicatrização de feridas eram mais longos na orelha isquémica do que no ouvido não-isquémica, quando o mesmo tratamento foi usado. A técnica foi agora utilizado em mais de 80 coelhos em que 23 eram diabéticos (tempo diabetes variando de 2 semanas a 2 anos). No coelho única desenvolveu complicações cirúrgicas, tais como hemorragia, infecção ou ruptura nas incisões na pele. O modelo tem muitas vantagens, tais como perturbação de pele pouco, tempo de isquemia, e maior taxa de sucesso, quando em comparação com muitos outros modelos. É can ser utilizado com segurança em animais com resistência reduzida, e também pode ser modificado para satisfazer os requisitos de testes diferentes.

Nós desenvolvemos uma técnica minimamente invasiva para criar um modelo de ferida de coelho isquémica orelha dividindo a artéria central e do nervo e do feixe neurovascular craniana. Um túnel subcutâneo, em seguida, corta todos os tecidos subcutâneos. Este procedimento causa um transtorno pele mínimo e pode ser utilizado com segurança em animais diabéticos.

Uma técnica simplificada para a produção de um modelo de ferida isquêmica

Um dos principais obstáculos nas pesquisas atuais sobre feridas diabéticas é a ausência de um modelo de ferida isquêmica que possa ser utilizado com segurança em animais diabéticos. Fármacos que funcionam...

O objetivo geral do seguinte experimento é possibilitar a criação de feridas isquêmicas, não apenas em coelhos normais, mas também em coelhos com resistência reduzida, como os idosos ou diabéticos. Todas as técnicas atualmente utilizadas para a criação de feridas isquêmicas são altamente invasivas, e até o momento, nenhuma dessas técnicas pode ser usada em animais diabéticos. Este procedimento utiliza cirurgia minimamente invasiva que começa com a realização de três pequenas incisões na pele sobre os três feixes vasculares.O próximo passo é isolar e proteger a veia central e o feixe vascular coddle, de modo que a circulação sanguínea para a orelha seja reduzida, mas não totalmente eliminada. Por fim, os demais vasos, nervos e tecidos subcutâneos são todos seccionados ou ligados por meio das incisões na pele. A isquemia da orelha é confirmada pela ausência de pulso arterial, aparência da orelha, diferença de temperatura e saturação subcutânea de oxigênio.Esta cirurgia minimamente invasiva pode parecer difícil de realizar, mas na verdade é muito fácil. A principal vantagem dessa técnica é que ela causa mínima perturbação na pele. Desde que publicamos esta técnica pela primeira vez em

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Medicine

Medicina

O trauma cirúrgico induz uma resposta inflamatória. As citocinas e ligandos endógenos são conhecidos para modular o tamanho do enfarte do miocárdio após isquemia e reperfusão. Apresentamos um modelo modificado fechado de tórax murino de isquemia e reperfusão utilizando pesos pendurados para minimizar os efeitos de toracotomia.

Um modelo fechado de tórax murino de isquemia do miocárdio e reperfusão

Um modelo murino de cicatrização de feridas cutâneas que podem ser utilizados para avaliar compostos terapêuticos em contextos fisiológicos e patológicos.

Modelo Murino de Cicatrização

A janela da câmara de dobras cutâneas dorsal murino apresentado visualiza uma zona de isquemia aguda persistente de um retalho musculocutâneo. Intravital epi-fluorescência licenças de microscopia para avaliação direta e repetitiva da microcirculação e quantificação de hemodinâmica. Morfológica e resultados hemodinâmicos podem ainda ser correlacionados com análises histológicas e moleculares.

Lesão tecido isquêmico na Skinfold Câmara do mouse Dorsal: Um Modelo retalho de pele para investigar aguda isquemia persistente

Durante o desenvolvimento dos mamíferos, as feridas cutâneas gestacionais precoces cicatrizam sem cicatriz. Aqui, detalhamos um modelo confiável e reprodutível de cicatrização de feridas sem cicatrizes fetais no dorso cutâneo de embriões de camundongos E16.5 (sem cicatrizes) e E18.5 (cicatrizes).

Um modelo de pele Rato Fetal de reparação de feridas Scarless

O objetivo deste protocolo é construir um equivalente tridimensional de pele de espessura total, que se assemelhe à pele natural. Com um dispositivo de ferimento automatizado especificamente construído, feridas precisas e reprodutíveis podem ser geradas sob manutenção de esterilidade.

Geração de espessura completa tridimensional Pele Equivalente e Automated Ferimento

O rato, devido ao seu tamanho, disponibilidade e de comportamento e dócil, tem sido utilizada como um modelo de pesquisa durante muitos anos. O objetivo deste protocolo é para utilizar o rato como modelo isquêmico cura de feridas cutâneas de fornecer informações valiosas sobre a fisiopatologia das feridas crônicas.

Demonstração da Wound modelo de pele de rato Isquêmico

Este protocolo descreve como gerar feridas excisionais bilaterais e de espessura total em camundongos e como monitorar, colher e preparar as feridas para análise morfométrica. Incluído é uma descrição aprofundada de como usar seções histológicas seriais para definir, quantificar e detectar defeitos morfométricos.

Modelo de cura da ferida excisional de Murine e Análise de Ferida Morfômica Histológica

Este artigo demonstra uma abordagem cirúrgica eficiente para estabelecer isquemia aguda em camundongos com uma pequena incisão. Essa abordagem pode ser aplicada pela maioria dos grupos de pesquisa sem quaisquer atualizações laboratoriais.

Um modelo cirúrgico modificado de isquemia de membros traseiros em ApoE-/- Ratos usando uma incisão em miniatura

Um protocolo simplificado é apresentado para estabelecer um modelo de cicatrização de queimaduras em camundongos usando um dispositivo de aquecimento digital. Os locais experimentais semelhantes a tabuleiros de xadrez criados na pele facilitam uma análise funcional adicional para o ensaio de cicatrização de feridas.

Modelo de cicatrização de feridas de queimadura semelhante a um tabuleiro de xadrez de camundongos baseado em dispositivo de aquecimento digital

É descrito um modelo de ferida na pele de rato que permite a avaliação de vários agentes terapêuticos sob condições fisiológicas ou patológicas ao longo das distintas etapas do processo de cicatrização. Além disso, é detalhado um protocolo para realizar planimetria manual e monitorar a taxa de contração da ferida durante o reparo tecidual.

Um Modelo de Ferida Cirúrgica de Pele de Rato: Uma Abordagem para Estudos de Cicatrização de Feridas e Avaliação de Biomateriais

Aprenda uma técnica minimamente invasiva para criar feridas isquêmicas em orelhas de coelhos, especialmente adequada para modelos diabéticos. Este método simplificado permite estudar a cicatrização de feridas com mínima disrupção cutânea.

Uma técnica simplificada para a produção de um modelo de ferida isquêmica

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