Name: Produção e titulação de adeno-associados recombinantes Vetores Virais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprenda a produzir vetores virais rAAV para terapia gênica usando células HEK 293 e cromatografia de heparina. Este método eficiente evita ultracentrífuga e materiais tóxicos, garantindo altos rendimentos e titulação precisa por microscopia de imunofluorescência.

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Veja a Figura 1 para uma ilustração resumindo o seguinte protocolo. Nota de segurança: Todo o material que tem estado em contacto com partículas virais montado precisa ser desinfetado com solução de Virkon ou desinfetante adequado. 1. Preparação de estoques de DNA plasmidial (~ 2 dias) <ol><li> Os plasmídeos são necessários os seguintes 1: <ul><li> pRV1 - Contendo a Rep AAV2 e seqüências de Cap </li><li> PH21 - Contendo a Rep AAV1 e seqüências de Cap </li><li> pFdelta6 - Adenovirus helper-plasmídeo </li><li> AAV plasmídeo contendo o cassete de expressão recombinante ladeado por AAV2 sinais de embalagem (repete terminal invertido, ITRs) </li></ul></li><li> Enquanto pFdelta6 devem ser cultivadas em células Stbl2 competente para evitar a supressão parcial, e pRV1 PH21 podem ser cultivadas em células DH5alpha competente. Plasmídeos AAV podem ser cultivadas em células Stbl2 se deleções parciais ocorrem nas células DH5alpha. </li><li>Plasmídeo de DNA deve ser de alta qualidade e livre de contaminantes RNA. Plasmídeos podem ser rastreados para a integridade usando o seguinte digere: <ul><li> pRV1 - digerir com XbaI para dar as bandas de 7,5 kb e 3,8 kb </li><li> PH21 - digerir com EcoRI para dar as bandas de 4,5 kb, 2,8 kb e 0,2 kb </li><li> pFdelta6 - digerir com HindIII para dar as bandas de 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, 2,3 kb e 1,5 kb </li></ul></li></ol> 2. Preparação de células embrionárias humanas Kidney 293 (Hek293) para transfecção (2-3 dias) <ol><li> Placa de duas 80% confluentes 150 centímetros dois frascos de células em cinco Hek293 15 centímetros de diâmetro Nunc placas de cultura de tecido. As células devem ser 70-80% confluentes antes de transfecção (aproximadamente 48 horas após o plaqueamento). Cultura em células modificadas padrão Dulbecco Águia (DMEM) com glicose baixa contendo 10% de soro fetal bovino e 100 U / ml de penicilina / estreptomicina 100 mg / ml. </li><li> 3 horas antes de transfecção DMEM remover e substituir com Iscove'Medium s modificado Dulbecco (IMDM) contendo 5% de soro fetal bovino. </li></ol> 3. Transfecção de plasmídeos viral (~ 1 hora para transfecção, 3 dias para incubação) <ol><li> Prepare o seguinte para um único lote (5 x 15 cm placas de cultura de tecido) do vírus: <ul><li> 62,5 mg AAV plasmídeo </li><li> 125 mcg pFdelta6 </li><li> 31,25 mg pRV1 </li><li> 31,25 mg PH21 </li><li> 1650 mL 2,5 M CaCl 2 </li><li> 12 ml dH 2 O </li></ul></li><li> Em um filtro de tecido classe 2 capô cultura estéril a mistura de transfecção em um tubo de 50 ml. </li><li> Enquanto vórtex a solução, adicionar rapidamente 13 ml de 2 x HEPES solução salina tamponada (pH 7,05). Substituir a tampa do tubo de 50 ml e continuar a vortex por 15 segundos. Deixar repousar por 1 minuto 45 segundos, um precipitado branco fino deve formulário. </li><li> Delicadamente adicionar 5 ml da solução de transfecção para cada 15 centímetros placa de cultura de tecidos. Placas agite para misturar e voltar a incubadora. </li><li> 16 horas após a transfecção remova o meio de IMDM e substituir com DMEM. </li></ol> 4. Lise de células e colheita de rAAVs (2 horas) <ol><li> 72 horas após a transfecção, remova a mídia de placas de cultura de células e descarte. Todos os resíduos devem ser tratados com solução de Virkon ou desinfetante adequado. </li><li> Lavar cuidadosamente as células de fosfato de 1x quente solução salina tamponada (PBS, pH 7,4). </li><li> Adicionar 25 ml PBS quente para cada prato e retire cuidadosamente as células com um raspador de celular. Coletar suspensão em tubos de 50 ml. </li><li> Células pelota a 800 xg por 10 minutos. </li><li> Elimine o sobrenadante e ressuspender pellet em 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, use 10 ml por placa de cultura de tecidos. Dividido em dois tubos de 50 ml. </li><li> Prepare uma nova solução de desoxicolato de sódio a 10% em dH 2 O. Adicionar 1,25 ml desta a cada tubo para uma concentração final de 0,5%. Adicionar benzonase nuclease a uma concentração final de 50 unidades por ml. Mix tubo completamente. </li><li incubar a c por hora.><li> Remover os restos celulares por centrifugação a 3000 xg durante 15 minutos. Transferir para tubo de 50 ml fresco, garantir que todos os restos celulares foi removido para evitar o bloqueio de colunas heparina (ver passo 5). Nesta fase, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C antes de continuar. Temos armazenado amostras por várias semanas a -20 ° C sem uma redução na infectividade. </li></ol> 5. Purificação coluna de heparina rAAVs (2-3 horas) <ol><li> Setup colunas HiTrap heparina usando uma bomba peristáltica para que as soluções de fluxo através da coluna a 1 ml por minuto para as etapas de 5,2-5,4. É importante garantir que não haja bolhas de ar são introduzidas na coluna de heparina. </li><li> Equilibrar a coluna com 10 ml 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0. </li><li> Aplicar solução de 50 ml de vírus para a coluna e deixar fluir. </li><li> Lavar coluna com 20 ml 100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0. </li><li> Usando uma seringa de 5 ml continuar a lavar a coluna wom 1 ml 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0, seguido de 1 ml 300 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0. Descartar o escoamento. </li><li> Usando 5 ml seringas e eluir pressão suave o vírus da coluna através da aplicação: <ul><li> 1,5 ml 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 </li><li> 3,0 ml 450 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 </li><li> 1,5 ml 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 </li><li> Coletar esses em um tubo de centrifugação de 15 ml. </li></ul></li></ol> 6. Concentração e de filtração estéril de rAAVs (1 hora) <ol><li> Concentre-se vetor usando Amicon ultra-centrífugas quatro unidades de filtro com um corte de peso molecular 100.000. Carga 4 ml de eluído no concentrador e centrifugar a 2000 xg por 2 minutos (em temperatura ambiente). Descartar fluxo contínuo e concentrador de recarga com solução vírus restantes e centrifugação repetir. O volume concentrado deve ser de aproximadamente 250 mL. Se o volume concentrado é significativamente mais do que isso, descarte o fluxo de through e continuar a centrífuga em um minuto, até que medidas de volume é de aproximadamente 250 mL. </li><li> Adicionar 250 mL de PBS ao vírus para um volume final de 500 mL e retire do concentrador. </li><li> Vector através de um filtro de 13 mm de diâmetro de filtro de seringa 0,2 mm. Vector deve ser aliquotado e estocado a -80 ° C até serem necessárias. </li></ol> 7. A titulação de ações viral (3 dias) Isso requer um promotor que é ativo em células Hek293 dirigindo um gene repórter ou um produto de gene immunocytochemically detectável. Ao produzir um vetor que não é compatível com células Hek293 outras linhagens celulares ou culturas celulares primárias podem ser usados. <ol><li> Prepare 18 poli-L-lisina lamínulas de vidro revestida ou 18 poços de slides câmara Nunc semeando Hek293 células para que eles sejam 40-50% confluentes. Para a titulação de Cre-dependente rAAVs uso Hek293 células que expressam estavelmente Cre recombinase 2. </li><li> Infectar cada poço com série dilutions do vetor AAV (Fig 2A). Use 3 poços por diluição. Rotineiramente adicionar vírus diretamente a cada poço. </li><li> Após 72 horas fixar Hek293 células adicionando um volume igual de paraformaldeído a 4% (PFA) e médio (dando uma concentração final de PFA 2%) para 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Lavar celular três vezes em PBS, lavar em dH 2 O e lamela. </li><li> Contar o número de células transduzidas dos três poços que têm o maior fator de diluição, mas ainda contêm células infectadas, encontrar a média destes e multiplicar pelo fator de diluição para dar o número de unidades infecciosas por microlitro (Fig 2B). </li></ol> 8. Resultados antecipado Hek293 células transduzidas com uma codificação do vírus proteína verde fluorescente melhorada (eGFP) são mostrados na Figura 2B. Em geral, alcançar títulos consistentes em torno de 6 x 10 6 partículas infecciosas por micro litro. Nós usam rotineiramente esses vetores para estereotáxica injection no cérebro de roedores adultos. Isto proporciona uma técnica poderosa para a região específica de expressão gênica 2. Para combinar esta especificidade região com células-tipo de expressão gênica seletiva injetamos Cre recombinase-dependente rAAVs em regiões alvo de Cre-camundongos transgênicos 2. Figura 2C-E mostra exemplos de injeções estereotáxica de Cre-dependente rAAVs codificação eGFP em diferentes regiões do cérebro de adultos parvalbumina-Cre camundongos transgênicos 3. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Ilustração esquemática do protocolo para a produção rAAV. 1.) Hek293 células são banhados e cresceu para 70-80% confluência. 2.) Plasmídeos AAV e ajudante são preparados e transfectadas em células Hek293. 3.) Medium é alterado novamente para DMEM 16 horas após transfecção e Hek293 células são cultivadas por mais 56 horas. 4.) Hek293 células são colhidas e lisadas. rAAV vetores são separados de restos celulares por centrifugation. 5.) Partículas virais são purificados através de colunas de heparina antes da concentração e esterilização. 6.) Hek293 células são cultivadas em 24 placas bem e infectar com diluições seriadas do vetor AAV para determinar o número de unidades infecciosas. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Titulação e em aplicação in vivo de rAAV1 / 2. (A) Instalação de Hek293 células para medir a título de viral. Hek293 células são transduzidas com diluições em série de rAAVs. C, o controle não infectados; N, 1 ml de ações virais não diluído. (B) Hek293 células infectadas com rAAVs expressar eGFP. (CE) expressão eGFP Viral é restrito a Cre-expressando neurônios nas regiões-alvo diferentes de camundongos transgênicos parvalbumina-Cre após a injeção estereotáxica de Cre-activated rAAVs. Imagens mostram exemplos imunorreatividade GFP em (C) pallidus do tálamo reticular e globus, (D) o giro denteado e (E) a região CA1 do hipocampo. DG, dentate giro; RT, reticular talâmico núcleo; GP, globo pálido. Barras de escala: B, 500 mm; C, 100 mm; D, 100 mm; E, 500 mm.

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Não há conflitos de interesse declarados.

vetores rAAV estão se tornando cada vez mais valioso para estudos in vivo em animais. Aqui, nós descrevemos um protocolo simples e barato para produzir rAAVs, o que pode facilitar a aplicação generalizada deste vector útil, evitando a terceirização onerosa de produção de vírus para as empresas. O protocolo (com base na referência 1) descreve a produção de quimérico rAAV1 / 2 vetores contendo proteínas do capsídeo de ambos os sorotipos dos pais em proporções iguais 4. A purificação dos vetores rAAV por ligação a colunas de heparina depende da expressão de proteínas do capsídeo AAV2, mas pode ser combinado com outros sorotipos de AAV1 descritas aqui. Além disso, AAV6 tem sido relatada a ligam à heparina, embora com uma afinidade reduzida, e pode potencialmente ser purificados com colunas de heparina usando este procedimento 5,6. Deve-se notar no entanto, que outros sorotipos vai exigir diferentes concentrações de NaCl para a heparina de eluição coluna 5,7. Genomas embalagem rAAV mostrou-se ideal entre 4,1 e 4,9 kb com uma forte redução na eficiência de embalagens até 5,2 kb 8. Este limite de embalagem pode ser considerada a maior desvantagem do sistema rAAV, uma vez que células de tipo específico regulação da expressão do transgene é geralmente obtida por cis grande atuação elementos que não podem ser acomodados dentro de partículas de AAV de pequeno porte. Para superar lotes títulos baixos, tais como os resultantes da tentativa de genes pacote que estão perto do limite de embalagem AAV estamos combinando separar lotes viral concentrada a 250 mL em um lote 500 mL, ao invés de adicionar PBS, conforme descrito no passo 6.3. Transdução de células do tipo específico de confiança pode ser conseguido através da combinação de Cre-driver ratos e cassetes rAAV condicional (veja abaixo) para evitar esticar o limite de embalagem. De nota, enquanto que este protocolo tenta fornecer fácil de seguir as instruções para a produção de t de altaiter rAAV, requer a presença de AAV2 metades proteína capsidial de purificação por cromatografia de afinidade a heparina. Outros sorotipos que AAV2 deve ser purificado através de procedimentos alternativos 9. Uma vantagem de purificação coluna heparina é acredita-se para produzir vetores de AAV que têm maior taxa de infectividade do que aqueles produzidos através de um gradiente de cloreto de césio 10. No entanto, também existem algumas desvantagens para este método. Por exemplo, outras proteínas que se ligam a heparina também podem estar presentes no estoque purificada viral. Enquanto o tropismo de heparina-purificada vetores podem ser influenciados pelo título vector 10, a nossa abordagem especificamente alvo ou 20 excitatória ou inibitória neurônios (Fig. 2) emprega Cre induzida por ativação de AAV-mediada expressão do transgene e é independente do título. Uma alternativa para purificação coluna heparina é o uso de um gradiente de densidade iodixanol, que produz um título maior viral e preparação mais pura do que o uso deum gradiente de cloreto de césio 10. Este método também pode ser combinado com coluna de purificação de heparina para produzir um vetor que é superior a 99% de pureza 11. Portanto, a consideração cuidadosa deve ser tomado por grupos individuais a respeito de qual método de purificação viral é melhor para sua aplicação em particular a jusante. O problema mais comum associado a este protocolo é título de viral baixa. Em nossa experiência esta pode geralmente ser atribuída a eficiência de transfecção baixo, ou a eluição dos vírus das colunas heparina. Todos os materiais de transfecção devem estar à temperatura ambiente antes de transfecção e transfections teste deve ser realizado para encontrar as condições ideais em cada laboratório. Outros métodos de transfecção, como lipofectamine, são altamente eficientes, mas pode ser proibitivamente caro. Além disso, a concentração e pH das soluções de eluição heparina coluna é fundamental para a eluição completa de virions de witho colunas heparinadanos ut. Outro ponto importante é que as células de embalagem devem aderir bem à superfície das placas de cultura de tecido. Se as células destacar em algum momento durante o procedimento é aconselhável para encerrar o experimento e descongelar um novo frasco de células. Espaço-temporal de controle de expressão do transgene em roedores é facilmente alcançado por segmentação anatômica precisa e do estágio de desenvolvimento do animal. Transferência de genes mediada por AAV eficiente tem sido mostrado no útero 12,13. No cérebro adulto, a área infectada com partículas rAAV após a injeção estereotáxica pode ser ajustado de muito pequenas regiões-alvo, para áreas muito maiores, não só por mudanças no título viral, mas também alterando os parâmetros de injeção. Estes incluem o volume ea velocidade das injeções ea inclusão do manitol poliol com a suspensão de vírus 14. Manitol pode também ser usado para melhorar a infecção de uma variedade de tecidos após a injeção sistêmica rAAV 15 &lt;/ Sup&gt;. A capacidade de acondicionamento de rAAV (aproximadamente 4,7 kb) é provavelmente o fator mais limitante em termos de genes que podem ser expressas a partir destes vetores virais. No entanto, estudos recentes têm mostrado que isso pode ser parcialmente superada pela divisão de genes maiores ou cassetes de expressão em vetores separados rAAV e introduzindo uma seqüência de transição, iniciando a expressão do gene, quando virions infectam a mesma célula 16. Níveis de expressão de genes realizada por vetores rAAV também pode ser bastante reforçada, usando vetores auto-cortesia rAAV 17. Injeção estereotáxica de vetores rAAV fornece um método rápido, barato e eficaz para induzir a expressão do gene de uma forma específica da região. Em combinação com 2 ª geração estratégias de interferência de RNA 18 rAAVs também podem ser usados ​​para a região específica do gene-knock down. rAAVs pode ser combinado com Cre-transgênicas ratos ou de células do tipo promotores específicos para alcançar-circuito e célula-tipoEspecíficos de expressão gênica, permitindo manipulações genéticas com alta resolução espacial 2,19-21, enquanto rAAVs montagem com o sistema tet por exemplo, a soma de controle temporal sobre vírus mediada expressão gênica 22,23. Estes exemplos ilustram o enorme potencial combinatorial desses vetores e prever um rápido aumento na rAAV baseado em estudos ao longo dos anos por vir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Amicon Ultra filtros centrífugos </td><td> Millipore </td><td> UFC810024 </td><td> 100.000 MWCO </td></tr><tr><td> Benzonase nuclease </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E1014 </td><td></td></tr><tr><td> Modificado Dulbeco de Águia (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 10567014 </td><td> Suplemento com 10% SFB e 10 unidades / ml penicillin/100 estreptomicina mg / ml </td></tr><tr><td> Hek293 células </td><td> Americana colecção de culturas tipo </td><td> CRL-1573 </td><td> Use a passagem menos de 30 </td></tr><tr><td> HEPES solução salina tamponada </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 51558 </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap Heparina cartucho </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54836 </td><td></td></tr><tr><td> Meio modificado de Dulbecco Iscove </td><td> Invitrogen </td><td> 12440-053 </td><td> Suplemento com FCS 5% </td></tr><tr><td> Desoxicolato de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5670 </td><td> Faça solução nova para cada lote </td></tr><tr><td> 15 centímetros cultura pratos Tissue </td><td> Fisher Scientific </td><td> 157150 </td><td></td></tr><tr><td> Stbl2 células competentes </td><td> Invitrogen </td><td> 10268-019 </td><td></td></tr><tr><td> Solução Virkon </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9821357 </td><td> Deixe para desinfectar noite antes de descartar a drenar </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Reagentes específicos exigidos para protocolo

produção e titulação de adeno-associados recombinantes vetores virais

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Nos últimos anos recombinante adeno-associado vetores virais (AAV) tornaram-se cada vez mais valioso para estudos in vivo em animais, e também estão sendo testadas em ensaios clínicos humanos. Tipo selvagem AAV é um membro não-patogênico da família Parvoviridae e inerentemente replicação-deficiente. O perfil de transdução ampla, baixa resposta imune, bem como a expressão do transgene forte e persistente conseguido com esses vetores tornou-os uma ferramenta popular e versátil para in vitro e in vivo a entrega do gene. rAAVs pode ser fácil e barato produzido no laboratório e, com base em seu perfil de segurança favorável, são geralmente dada uma classificação de segurança baixos. Aqui, nós descrevemos um método para a produção e titulação de rAAVs quimérico que contenham as proteínas do capsídeo de ambos AAV1 e AAV2. O uso desses vetores chamados quimérico combina os benefícios de ambos os sorotipos dos pais, tais como estoques elevados títulos (AAV1) e purificaçãopor cromatografia de afinidade (AAV2). Esses sorotipos AAV são os melhores de todos os sorotipos estudados AAV, e individualmente têm um padrão de infectividade amplo. Os vetores quimérico descritas aqui devem ter as propriedades infecciosas do AAV1 e AAV2 e pode assim ser esperado para infectar uma grande variedade de tecidos, incluindo os neurônios, músculo esquelético, pâncreas, rim, entre outros. O método descrito aqui usa purificação coluna de heparina, um método acreditado para dar uma maior título viral e mais limpo preparação viral do que os métodos de purificação, tais como centrifugação num gradiente de cloreto de césio. Além disso, descrevemos como esses vetores podem ser rápida e facilmente tituladas para dar leitura exata do número de partículas infecciosas produzidas.

Recombinante adeno-associated virus (rAAVs) vetores estão se tornando cada vez mais valioso para<em&gt; In vivo</em&gt; Estudos em animais. Descrevemos como rAAVs pode ser produzido em laboratório e como esses vetores podem ser tituladas para dar uma leitura precisa do número de partículas infecciosas produzidas.

Produção e titulação de adeno-associados recombinantes Vetores Virais

Nos últimos anos, os vetores virais adenoassociados (AAV) recombinantes tornaram-se cada vez mais valiosos para estudos in vivo em animais, e estão também atualmente...

O objetivo deste procedimento é produzir vírus adeno-associados recombinantes ou rAAVs para entrega eficaz de transgenes in vitro ou in vivo. Isso é realizado primeiramente transfectando células HEK 293 com plasmídeos de DNA que codificam o transgene e os genes virais. As células transfectadas são então raspadas e lisadas para colher as partículas de rAAV montadas.Em seguida, os R AAVs são purificados do lisado celular por meio de purificação em coluna de heparina. O passo final é concentrar os estoques virais. Em última análise, os resultados mostram expressão forte e persistente de transgenes mediada por vírus, demonstrada por microscopia de imunofluorescência.Neste momento, os AAVs de RA estão prontos para aplicações in vitro ou in vivo. A principal vantagem do uso da nossa técnica em comparação com outros métodos de purificação, como a purificação por gradiente de cloreto de césio, é que não precisamos utilizar ultracentrífuga nem materiais tóxicos. Também obtemos vetores virais mais puros e em maior quantidade.Antes do início deste protocolo, prepare plasmídeo de alta qualidade, estoques de DNA e verifique a integridade conforme descrito no protocolo escrito. Para começar, plaque duas garrafas de cultura tecidual de 150 centímetros quadrados com 80% de confluência de células HEC 2 9 3 em cinco placas de cultura tecidual de 15 centímetros de diâmetro, cultive as células em DMEM padrão com baixa concentração de glicose contendo 10% de soro fetal bovino. Aproximadamente 48 horas após o plaqueamento, no dia da transfeção, as células devem apresentar 70 a 80% de confluência três horas antes da transfeção.Remova o DMEM e substitua por meio modificado de CHO's de Ice Cove ou meio IMDM contendo 5% de soro bovino fetal. Prepare a mistura de transfeção para um único lote de vírus conforme descrito no protocolo escrito. Em uma capela de cultura de tecidos classe dois, filtre esterilmente a mistura de transfeção em um tubo de 50 mililitros, enquanto adiciona rapidamente 13 mililitros de solução salina tamponada com HEPES duas vezes concentrada.Substitua a tampa do tubo de 50 mililitros e continue a vórtex por 15 segundos. Deixe em repouso por um minuto e 45 segundos. Deve-se formar um precipitado branco. Adicione cuidadosamente cinco mililitros da solução de transfeção a cada placa de cultura de tecidos de 15 centímetros.Agite as placas para misturar após a incubação por 16 horas. Remova o IMDM, substitua por DMEM e continue a incubação das células. Para colher os R AAVs.Remova o meio dos placas de cultura celular. 72 horas após a transfeção, os descartes sempre devem ser tratados com solução de vercon ou outro desinfetante apropriado. Lave suavemente as células uma vez com solução salina tamponada com fosfato morna.Adicione 25 mililitros de PBS morno a cada placa e remova suavemente as células com um espátula celular. Após coletar a suspensão em tubos de 50 mililitros, pelote as células a 800 vezes G durante 10 minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet.Em 10 mililitros de tampão de cloreto de sódio 150 milimolar por placa de cultura de tecidos, divida a suspensão em dois tubos de 50 mililitros. Em seguida, adicione às células uma solução recém-preparada de 10% de desoxicolato de sódio. Depois, adicione a nuclease benzonase para remoção dos ácidos nucleicos.Após misturar bem os tubos, incubar a 37 graus Celsius por uma hora. Após a incubação, remover os detritos celulares por centrifugação a 3000 ×g por 15 minutos. Transferir o sobrenadante para um tubo novo de 50 mililitros, garantindo que todos os detritos celulares tenham sido removidos para evitar o bloqueio da heparina.Colunas para purificação de AAVr. Adicione 10 mililitros de tampão de cloreto de sódio a uma seringa e monte as colunas de heparina high trap utilizando uma bomba peristáltica, de modo que as soluções fluam através da coluna a uma taxa de um mililitro por minuto. É importante garantir que nenhuma bolha de ar seja introduzida na coluna de heparina.Equilibre a coluna com 10 mililitros de tampão de cloreto de sódio 150 milimolar. Aplique 50 mililitros da solução de vírus na coluna e deixe a solução passar. Em seguida, lave a coluna com 20 mililitros de tampão de cloreto de sódio 100 milimolar.Usando uma seringa de cinco mililitros. Continue lavando a coluna com um mililitro de tampão de cloreto de sódio 20 milimolar, seguido por um mililitro de tampão 300 milimolar. Descarte o fluxo que passa.Utilize seringas de cinco mililitros e pressão suave para eluir o vírus da coluna, aplicando gradativamente tampões de eluição com alta força iônica. Colete o eluato em um tubo cônico de 15 mililitros. Concentre o vetor utilizando unidades de filtro centrífugo AmCon Ultra quatro com limite de peso molecular de 100.000.Carregue quatro mililitros do eluato da coluna no concentrador e centrifugue a 2000 vezes G durante dois minutos. Após repetir a centrifugação, o volume concentrado deve ser aproximadamente 250 microlitros. Descarte o fluxo passante e recarregue o concentrador com a solução viral restante.Adicione 250 microlitros de PBS ao vírus para um volume final de 500 microlitros e remova do concentrador. Como etapa final, filtre o vetor através de um filtro de seringa de 0,2 mícron de diâmetro de 13 milímetros para concentrar ainda mais o vírus estocado. Prepare 18 lamínulas de vidro revestidas com poliol lisina semeando células HEC 2 9 3 de modo que fiquem com 40 a 50% de confluência para titulação de RAAVs dependentes de Cree.Utilize células HEC 2 9 3 que expressam estavelmente a recombinase Cree. Infete cada poço com diluições seriadas do vetor RAAV conforme descrito no protocolo escrito, utilizando três poços por diluição. Após 72 horas, fixe as células HEC 2 9 3 adicionando um volume igual de formaldeído a 4%power ao meio durante 10 minutos à temperatura ambiente após a incubação, enxágue as células três vezes com PBS e uma vez com água destilada. Em seguida, utilizando meio de montagem, coloque as lamínulas sobre as lâminas.Lado da célula voltado para baixo. Conte o número de células infectadas nos três poços com o maior fator de diluição que ainda contenham células infectadas. Calcule a média desses valores e multiplique pelo fator de diluição para obter o número de unidades infecciosas por microlitro. Células HEC 2 9 3 transduzidas com um vírus que codifica a proteína verde fluorescente melhorada são mostradas.Títulos consistentes de cerca de seis vezes 10 elevado a seis partículas infecciosas por microlitro são geralmente obtidos. Aqui são mostrados exemplos de injeções estereotáxicas de AAVs dependentes de Cree que codificam a proteína verde fluorescente em diferentes regiões cerebrais de camundongos adultos transgênicos para Cree da parvalbumina. A expressão viral da proteína verde fluorescente restringe-se a neurônios que expressam Cree em diversas regiões-alvo.Neste exemplo, a imunorreatividade da proteína verde fluorescente é mostrada no tálamo reticular e no globo pálido, no giro denteado e na região CA1 do hipocampo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em sete a oito dias para a produção do vírus e três dias para a titulação, se realizada corretamente.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um protocolo para geração de vetores adenovirais de alta capacidade sem todas as sequências codificadoras virais é apresentado. A clonagem de transgenes contidos no genoma do vetor é baseada em endonucleases homing. A amplificação do vírus em células produtoras cultivadas como células aderentes e em suspensão depende de um vírus auxiliar que fornece genes virais em trans.

Clonagem e produção em larga escala de alta capacidade vetores adenovirais com base no tipo adenovírus humano 5

Aqui, descrevemos uma estratégia eficiente e reprodutível para produzir, título e lotes de qualidade-controle de vetores de vírus adeno-associado. Permite ao usuário obter uma preparação de vetor com alta-título (≥ 1 x 1013 vector genomas/mL) e um elevado grau de pureza, pronto para uso em vitro ou na vivo .

Produção, purificação e controle de qualidade para vetores de baseados em vírus Adeno-associado

Aqui fornecemos um procedimento detalhado para a produção em larga escala de vetores AAV de grau de pesquisa usando células hek 293 aderentes cultivadas em pilhas de células e purificação de cromatografia de afinidade. Este protocolo produz consistentemente &gt;1 x 1013 genomas vetoriais/mL, fornecendo quantidades vetoriais apropriadas para grandes estudos em animais.

Produção de vetores de vírus associados a Adeno em pilhas de células para estudos pré-clínicos em grandes modelos animais

Neste protocolo, o vetor AAV2 é produzido por células de insetos Spodoptera frugiperda (Sf9) com baculovírus (BV)-AAV2-green fluorescente protein (GFP) ou gene terapêutico e células Sf9 infectadas por BV-AAV2-rep-cap na cultura de suspensão. As partículas de AAV são liberadas das células usando detergente, clarificadas, purificadas pela cromatografia da coluna de afinidade, e concentradas pela filtragem de fluxo tangencial.

Desenvolvimento de processos para a produção e purificação do vírus associado ao Adeno (AAV)2 Vetor usando o sistema de cultura de células de baculovírus-inseto

O vírus adenoassociado recombinante (rAAV) é amplamente utilizado para liberação clínica e pré-clínica de genes. Um uso subestimado para rAAVs é a transdução robusta de células cultivadas sem a necessidade de purificação. Para pesquisadores iniciantes no rAAV, fornecemos um protocolo para clonagem de transgênico, produção bruta de vetores e transdução de cultura celular.

Expressão de Transgenes em Células Cultivadas Usando Vetores Virais Adenoassociados Recombinantes Não Purificados

O vírus adenoassociado é produzido em cultura de células de suspensão e purificado por centrifugação com duplo gradiente de densidade de iodixanol. Etapas são incluídas para aumentar o rendimento total do vírus, diminuir o risco de precipitação do vírus e concentrar ainda mais o produto final do vírus. Os títulos finais esperados atingem 10a 12 partículas virais/mL e são adequados para uso pré-clínico in vivo .

Produção e purificação de vírus adenoassociados em cultura de suspensão por centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol para aplicações in vivo

Aqui, um protocolo de produção de AAV baseado em células HEK293 de suspensão é apresentado, resultando em tempo e mão de obra reduzidos necessários para a produção de vetores usando componentes que estão disponíveis para fins de pesquisa de fornecedores comerciais.

Produção de lotes vetoriais associados a adeno de alto rendimento usando células de suspensão HEK293

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para a geração e purificação de vetores virais adeno-associados usando um método otimizado de cromatografia de afinidade à base de heparina. Apresenta uma abordagem simples, escalável e econômica, eliminando a necessidade de ultracentrifugação. Os vetores resultantes exibem alta pureza e atividade biológica, comprovando seu valor em estudos pré-clínicos.

Isolamento de vetores virais adeno-associados por meio de um protocolo de cromatografia de afinidade de heparina de etapa única e semiautomatizada

À medida que o campo da terapia gênica continua a evoluir, há uma necessidade crescente de métodos inovadores que possam enfrentar esses desafios. Aqui, é apresentado um método único, que agiliza o processo de geração de vetores AAV de alto rendimento e alta pureza usando uma plataforma de fábrica de células, atendendo aos padrões de qualidade para estudos in vivo .

Um procedimento simplificado e padronizado para gerar vetores de vírus adeno-associados de alto título e alta qualidade utilizando uma plataforma de fábrica de células

A quantificação precisa das cópias do genoma do vetor do vírus adeno-associado (AAV) é crítica, mas um protocolo padronizado ainda não foi estabelecido. Este protocolo descreve um método validado para preparar amostras de AAV purificadas e conduzir a reação em cadeia da polimerase de gotículas digitais (dd_PCR) para quantificar de forma confiável o título do genoma viral.

Quantificação de genomas virais adeno-associados em amostras de vetores purificados por reação em cadeia da polimerase por gotículas digitais

Aprenda a produzir vetores virais rAAV para terapia gênica usando células HEK 293 e cromatografia de heparina. Este método eficiente evita ultracentrífuga e materiais tóxicos, garantindo altos rendimentos e titulação precisa por microscopia de imunofluorescência.

Produção e titulação de adeno-associados recombinantes Vetores Virais

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