Name: Purificação de Proteínas ortogonais Facilitado por um Tag Affinity Pequenas Bispecific (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprenda a purificar proteínas recombinantes com alta pureza usando um tag bispecífico de afinidade em cromatografia de duas etapas. Este método simplificado utiliza E. coli e colunas com albumina sérica humana e domínio Z.

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Este projeto foi financiado pelo Knut e Alice Wallenberg Foundation eo Conselho de Pesquisa sueco.

1. Clonagem da fusão alvo gene/ABDz1-tagged construir <ol><li> Prepare fragmentos de PCR do gene ABDz1 ladeado por sítios de restrição adequados para N-terminal ligadura do gene alvo na expressão plasmídeo (um plasmídeo contendo ABDz1 está disponível gratuitamente através de um acordo de transferência de material). </li><li> Cleave expressão purificada vector e fragmentos de PCR com enzimas de restrição escolhida em um buffer de reacção adequados. Purificar os produtos antes da ligadura. </li><li> Ligadura do fragmento ABDz1 restrito no vetor de expressão contendo o gene de interesse e transformar o produto ligadura para E. coli (no método original da cepa RR1ΔM15 foi usado 8). Spread células transformadas em placas de ágar suplementado com antibióticos adequados para a seleção. </li><li> PCR tela algumas colónias e seqüência verificar a cassete de expressão resultante por seqüenciamento de DNA. </li><li> Prepare plasmídeo de uma cultura overnight de um verif seqüênciacolônia de IED e transformar a cepa expressão preferida (no método original E. coli Rosetta (DE3), que hospeda um pRARE plasmídeo para melhorar a produção de proteínas codificadas por genes humanos, foram usados). </li></ol> 2. Expressão da proteína <ol><li> Inocular uma única colônia de bactérias em 10 ml de caldo tripticase soja suplementado com extrato de levedura 5 g / l, e os antibióticos apropriados. Incubar a 150 rpm a 37 ° C durante a noite. </li><li> Inocular 1 ml da cultura durante a noite em 100 ml de meio fresco e induzir a expressão da proteína (originalmente 1 mM isopropil-β-D-thiogalactoside quando um operon lac foi utilizado), quando as células atingem a fase de crescimento logarítmica. </li><li> Incubar a 150 rpm a 25 ° C durante a noite células e colheita por centrifugação. </li></ol> 3. Purificação de afinidade ortogonais <ol><li> Ressuspender o pellet em 25 ml de tampão em execução (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% (w / v) Tween 20, pH 8,0) e interromper ªcélulas e por sonicação na amplitude de 60% e 1.0/1.0 pulsos por 3 min. Centrifugar a amostra e filtrar o sobrenadante contendo proteína-alvo (0,45 mm) antes de purificação suplementar. </li><li> Equilibrar um 1 ml HSA coluna Sepharose ou uma coluna de NHS-ativado, previamente combinada com HSA acordo com as recomendações do fornecedor, com 10 volumes de coluna (CV) de tampão de corrida em 1 ml / min em um sistema adequado de proteína de purificação. Carregue o lisado bacteriano de 0,5 ml / min e em seguida, redefinir a taxa de fluxo de 1 ml / min. </li><li> Lavar a coluna com 5 CV de tampão de corrida seguido por 5 CV de tampão de lavagem (5 mM NH 4 Ac, pH 5,5). </li><li> Eluir a amostra com tampão de eluição (0,5 M HAc, pH 2,5) a 1 ml / min e coletar frações, a absorção de monitor em 280 nm para selecionar frações do pico eluído para purificação adicional. </li><li> Piscina das frações com a maior concentração de proteína, dilua duas vezes em tampão de corrida Claro (20 de fosfato mM, 150 mM NaCl, pH 7,2) ecertifique-se o pH está em torno de neutro. Adicionar 1 M Tris-HCl pH 8 para aumentar o pH, se necessário. </li><li> Carga da amostra em 0,5 ml / min em uma coluna de um MabSelect HiTrap ml Claro que foi equilibrado, com 10 CV de tampão de corrida Claro em 1 ml / min. Redefinir a taxa de fluxo de 1 ml / min após o carregamento. </li><li> Lavar a coluna com 5 CV de tampão de corrida Claro (passo 5) e eluir as proteínas com 0,2 M HAc, pH 2.7. Para as proteínas-alvo sensíveis o eluído pode ser neutralizado diretamente no momento da recolha pela adição de Tris-HCl. </li></ol> Se as etapas cromatográficas são invertidos, o eluato da coluna MabSelect certeza pode ser diluído em tampão de corrida (passo 3.1) e do pH aumentou para cerca de 8 por adição de 1 M Tris-HCl. Em geral, os picos mais estreitos são observadas quando a matriz Claro é empregado na segunda etapa. 4. Avaliação de pureza por eletroforese de sódio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) <ol><li> Carga das frações purificadas em umredução da SDS-PAGE e, se desejado, analisar o peso molecular do produto purificado por espectrometria de massa. É importante reduzir completamente a amostra uma vez que uma cisteína livre no ABDz1 pode causar dimerização do produto em condições não-redução. </li></ol> 5. Resultados representativos: Como uma prova de princípio, a purificação de afinidade ortogonais facilitada pela tag ABDz1 foi avaliada por três proteínas alvo humano que representam as classes de solubilidade diferentes, pesos moleculares e pontos isoelétricos (Tabela 1). O gene ABDz1 foi geneticamente fundido aos genes-alvo e as construções foram expressas em E. coli, Figura 2 mostra um fluxograma para todas as etapas no método consecutivamente. Após a purificação pelo protocolo ortogonais, amostras coletadas em diferentes pontos foram analisados ​​por SDS-PAGE (Figura 3). Os resultados mostram claramente a utilidade de uma tag dupla e duas etapas de purificação altamente específicos. Apesar de pureza razoável é achieved após a etapa de purificação inicial, visto a partir do gel, o passo sucessivo produz um produto muito puro bem adequado para aplicações altamente exigentes. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Design da biblioteca combinatória usados ​​para a seleção do tag ABDz1 bispecific. Os 46 aminoácidos albumina de ligação de dobras de domínio em um pacote hélice estável três e ele contém um sítio de ligação para albumina sérica humana localizadas principalmente à hélice segundo. Por geneticamente randomizing eleven superfície exposta aminoácidos localizados na hélice de primeira e terceira, uma nova superfície de ligação foi projetado. Os onze posições são indicadas na figura e numerados de acordo com Kraulis et al. 9. Seguintes biopanning contra um dímero do Z-domínio da proteína A com a biblioteca combinatorial expressa em fago, a molécula ABDz1 bispecific foi identificado. <img alt='"Figura' src='"files/ftp_upload/3370/3370fig2.jpg'> Figura 2. Um fluxograma simplificado para o protocolo ortogonais afinidade purificação. A PCR de fragmento contendo a seqüência ABDz1 é ligada (N-terminal), com um gene de interesse em um vetor de expressão adequado. O produto ligadura é transformado em E. coli para a verificação de seqüência e preparação plasmídeo. Após a transformação para um host de expressão, uma cultura em grande escala para a expressão da proteína recombinante é criado a partir de uma cultura inicial durante a noite. As bactérias são colhidas por centrifugação e lisadas por sonicação para produzir lisado bacteriano contendo a proteína alvo. Depois de uma etapa de filtração para remover partículas sólidas residuais, o lisado é submetido a purificação de afinidade ortogonal em um sistema de manipulação de líquidos submetendo-se a dois passos de purificação em sucessão. Picos eluídos de ambas as etapas de purificação são amostrados e avaliados por SDS-PAGE para avaliar a pureza ea comparação com tlisado ele antes de purificação. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. SDS-PAGE análise de proteínas-alvo expressa e purificada em fusão com ABDz1. Amostras retiradas do lisado bacteriano de três proteínas expressas em fusão para ABDz1, representando diferentes propriedades, ea tag ABDz1 si foram coletados junto com as amostras dos picos correspondentes da purificação em uma coluna HSA-seguido por um MabSelect Claro-coluna (A) . Lanes 1-4 representam amostras de lisados ​​antes de purificação, pistas 08/05 do HSA-purificação (primeira etapa) e 12/09 pistas da purificação MabSelect Claro (segunda etapa). Amostras são carregadas na seguinte ordem: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, HT2375-ABDz1 e ABDz1. Além disso, amostras adquiridas a partir da mesma lisados ​​purificados na ordem inversa nas mesmas colunas foram analisados ​​(B). Lanes 1-3 representam amostras de lisados ​​antes de purificação, faixas 4-6 from MabSelect purificação-Sure (primeira etapa) e 09/07 a partir de pistas HSA-purificação (segunda etapa). As amostras foram carregados na mesma ordem como em (A), mas a marca em si não está incluída. A partir desses resultados, é claro que este método de duas etapas produz proteínas altamente purificadas, independentemente da ordem em que as etapas são aplicadas. <table border="1"><tbody><tr><td> B nome </td><td> Proteína alvo UniProt c </td><td> Molecular peso (kDa) </td><td> Solubilidade classe d </td><td> Peso molecular de produto de fusão (kDa) </td><td> Ponto isoelétrico de produto de fusão </td></tr><tr><td> 141377 </td><td> B7Z315 </td><td> 17,4 </td><td> 4 </td><td> 23,7 </td><td> 8,5 </td></tr><tr><td> HT875 </td><td> P01040 </td><td> 10,8 </td><td> 3 </td><td> 17,1 </td><td> 4,9 </td></tr><tr><td> HT2375 </td><td> P00740 </td><td> 8,9 </td><td> 5 </td><td> 15,2 </td><td> 6,8 </td></tr></tbody></table><ol class="lalpha"><li> Peso molecular de ABDz1 tag sozinhos é de 6,3 kDa, ponto isoelétrico 6,7. </li><li> Proteína-alvo representa uma parte da proteína UniProt. </li><li> <a href="http://www.uniprot.org">http://www.uniprot.org</a> . </li><li> Classe de solubilidade de um fragmento de proteína com N-terminal Seu seis ABP 10. </li></ol> Tabela 1. Proteínas-alvo e produtos de fusão com uma tag ABDz1 avaliada em um estudo de prova de princípio. Três únicas proteínas humanas com peso molecular diferente, solubilidade e ponto isoelétrico foram escolhidos para a expressão e purificação pela abordagem afinidade ortogonais.

<ol><li>Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+most+of+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Making the most of affinity tags.</a> Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+strategies+for+selective+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22CET%22%5BJournal%5D)">Protein engineering strategies for selective protein purification.</a> CET. 28, 1315-1325 (2005).</li>
<li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelate+affinity+chromatography%2C+a+new+approach+to+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258, 206-213 (1975).</li>
<li>Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+interaction+between+albumin-binding+domain+from+streptococcal+protein+G+and+human+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin.</a> Protein Sci. 11, 206-213 (2002).</li>
<li>Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+IgG-binding+domain+based+on+staphylococcal+protein%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein.</a> A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).</li>
<li>Alm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+bispecific+protein+selected+for+orthogonal+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification.</a> Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).</li>
<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+affinity+domains+for+the+detection%2C+purification+and+immobilization+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins.</a> J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).</li>
<li>Rüther, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pUR+250+allows+rapid+chemical+sequencing+of+both+DNA+strands+of+its+inserts%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts.</a> Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).</li>
<li>Kraulis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serum+albumin-binding+domain+of+streptococcal+protein+G+is+a+three-helical+bundle%3A+a+heteronuclear+NMR+study%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study.</a> FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+flow+cytometry-based+method+for+analysis+of+expression+levels+in+E+coli+giving+information+about+precipitated+and+soluble+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein.</a> J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).</li>
<li>Carter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+proteolysis+of+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sympos.+Ser%22%5BJournal%5D)">Site-specific proteolysis of fusion proteins.</a> ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negatively+charged+purification+tags+for+selective+anion-exchange+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22PEDS%22%5BJournal%5D)">Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery.</a> PEDS. 17, 779-786 (2004).</li>
<li>Gräslund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+engineering+of+a+protein+domain+to+allow+efficient+ion-exchange+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery.</a> Protein Eng. 13, 703-709 (2000).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo de purificação de ortogonais afinidade apresentada aqui permite purificação eficiente de uma ampla gama de proteínas-alvo. Ao combinar o local de ligação inerente do domínio albumina de ligação com uma nova superfície de ligação, uma pequena proteína tag bispecific foi desenvolvido. É muito simples de utilizar a tag uma vez que pode simplesmente ser clonados e expressos em fusão a qualquer proteína de interesse em qualquer vetor de expressão preferida. Equipamento padrão disponível na maioria dos laboratórios pode ser empregado para a purificação de proteínas em duas etapas. Uma vez que a função da tag ABDz1 depende de dobramento correto do domínio para expor sua eficiência duas superfícies de ligação, o método é limitado a proteínas expressas na forma solúvel e não adequado para purificações em condições de desnaturação. Agentes redutores também devem ser evitados, uma vez que interfere com a ligação de ABDz1 para o Z-domínio sobre a matriz MabSelect Claro. Ortogonais afinidade purificaçãoção fornece uma alternativa útil aos métodos tradicionais, a fim de satisfazer as exigências de proteínas altamente purificadas em muitas aplicações exigentes. Ao mesmo tempo, este método elimina a necessidade de marcação combinatória quando as estratégias de purificação diferentes são usados ​​em sucessão. Para aplicações que requerem uma proteína alvo nativo, um sítio de clivagem da protease podem ser introduzidas para tornar a remoção enzimática da tag ABDz1 possível 11. Além disso, a tag ABDz1 é o domínio primeira proteína bispecific pequenas e dobradas descritas até o momento. Ele é único, uma vez que fornece uma estratégia de purificação que depende de duas alvo interações afinidade específica. No futuro seria interessante para expandir este conceito através do desenvolvimento de novas etiquetas bispecific que carregam novas superfícies de ligação que são compatíveis com prontamente disponíveis e baratos resinas cromatográficas. Por exemplo, substituindo os aminoácidos envolvidos na ligação da albumina com resíduos básicos, uma tag compatível com iem cromatografia de troca pode ser obtida. Um conceito similar tem se mostrado eficaz pela engenharia responsável pela Z-domínio para gerar etiquetas conhecido como ácido Z 12 e 13 básicas Z compatível com anion e troca catiônica, respectivamente.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> E. coli RR1ΔM15 </td><td> Americana Culture Collection Tipo </td><td> 35102 </td></tr><tr><td> E. coli Rosetta (DE3) </td><td> Novagen </td><td> 70954 </td></tr><tr><td> Caldo tripticase soja </td><td> Difco </td><td> 211822 </td></tr><tr><td> Extrato de levedura </td><td> Difco </td><td> 212720 </td></tr><tr><td> Vibra sonicador celular </td><td> Sonics e materiais </td><td> - </td></tr><tr><td> HSA Sepharose </td><td> Pharmacia Biotech </td><td> Produto ex- </td></tr><tr><td> HiTrap MabSelect Claro </td><td> GE Healthcare </td><td> 11-0034-93 </td></tr><tr><td> HiTrap NHS-activated coluna HP </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0716-01 </td></tr></tbody></table>

purificação de proteínas ortogonais facilitado por um tag affinity pequenas bispecific

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Devido aos elevados custos associados com a purificação de proteínas recombinantes os protocolos precisam ser racionalizadas. Para high-throughput esforços há uma demanda por métodos gerais que não necessitam de proteína-alvo específicos de otimização 1. Para alcançar este objectivo, tags purificação que geneticamente pode ser fundida ao gene de interesse são comumente usados ​​2. A alça de afinidade mais utilizado é o tag hexa-histidina, que é adequado para a purificação sob as duas condições nativas e desnaturantes 3. A carga metabólica para a produção da marca é baixo, mas ele não fornece a alta especificidade como concorrentes afinidade 1,2 estratégias de cromatografia base. Aqui, uma tag de purificação bispecific com dois diferentes sítios de ligação em um ácido amino 46, de domínio pequena proteína tem sido desenvolvido. O domínio de ligação de albumina é derivada de proteína G estreptocócicas e tem uma forte afinidade inerente à albumina sérica humana(HSA). Onze superfície exposta aminoácidos, que não estão envolvidos em albumina de ligação de 4, foram randomizados geneticamente para produzir uma biblioteca combinatória. A biblioteca de proteína com o romance dispostas aleatoriamente superfície de ligação (Figura 1) foi expressa em partículas phage para facilitar a seleção de pastas pelo fago tecnologia de exibição. Através de várias rodadas de biopanning contra um dimérica Z domínio derivado da proteína estafilocócica A 5, uma molécula pequena, bispecific com afinidade para ambos HSA eo novo alvo foi identificado 6. O domínio de nova proteína, denominada ABDz1, foi avaliada como uma marca de purificação para uma seleção de proteínas-alvo com peso molecular diferente, solubilidade e ponto isoelétrico. Três proteínas-alvo foram expressas em Escherichia Escherishia com a tag romance fundidos aos seus N-terminais e, posteriormente, purificadas por afinidade. Purificação inicial em uma coluna com HSA imobilizados ou Z-domínio resultou em relatiprodutos vely puro. Duas etapas de purificação de afinidade com a tag bispecific resultaram em melhoria substancial da pureza da proteína. Media cromatográfica com a Z-domínio imobilizada, por exemplo MabSelect Claro, estão prontamente disponíveis para a purificação de anticorpos e HSA pode facilmente ser quimicamente ligado a meios de comunicação para fornecer a segunda matriz. Este método é especialmente vantajosa quando há uma alta demanda sobre a pureza da proteína-alvo recuperado. O bifunctionality da tag permite que dois diferentes passos cromatográficos para ser usado enquanto a carga metabólica no host expressão é limitada devido ao pequeno tamanho da tag. Ele fornece uma alternativa competitiva aos chamados tagging combinatória, onde várias marcas são usados ​​em combinação 1,7.

Um romance e altamente eficiente em duas etapas cromatografia de afinidade protocolo foi desenvolvido e é descrita em detalhes. O método é baseado em uma tag de purificação com duas pequenas afinidades inerentes e é aplicável a uma grande variedade de proteínas-alvo com propriedades diferentes.

Purificação de Proteínas ortogonais Facilitado por um Tag Affinity Pequenas Bispecific

Devido aos altos custos associados à purificação de proteínas recombinantes, os protocolos precisam ser racionalizados. Para esforços de alta produtividade, existe um...

O objetivo geral do experimento a seguir é produzir proteínas recombinantes muito puras por meio de um procedimento de purificação por afinidade em duas etapas. Para isso, uma marcação de purificação biespecífica baseada em um domínio de ligação à albumina é clonada em um vetor de expressão contendo o gene de interesse e, em seguida, a proteína de fusão é expressa em *E. coli*. Na segunda etapa, o lisado bacteriano contendo a proteína alvo é submetido à purificação em uma coluna cromatográfica com albumina sérica humana imobilizada ou HSA.Em seguida, realiza-se uma purificação adicional em uma coluna MAB select superior resistance ou sure, contendo o domínio Z imobilizado derivado da proteína A estafilocócica. Isso resulta em um produto altamente puro, adequado para aplicações exigentes. Em seguida, a pureza é avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e, se necessário, por espectrometria de massas, a fim de garantir que a proteína de interesse tenha sido purificada com sucesso até a homogeneidade. Os resultados demonstram uma purificação eficiente após duas etapas sucessivas, em comparação com uma única etapa utilizando a nova marcação de purificação bispecífica empregada neste protocolo. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a purificação por afinidade em um único passo, é que a proteína pura pode ser obtida por meio de um protocolo simples que utiliza apenas um único marcador de afinidade, independentemente das propriedades ou da proteína-alvo.Este método pode ser utilizado para proteínas com características muito diversas. Além disso, como a marcação é muito pequena, é facilmente produzida pelo hospedeiro bacteriano. Em geral, indivíduos novos neste procedimento de purificação o encontrarão muito simples e direto.Uma etapa crítica é ajustar o pH da sua amostra antes de carregá-la na segunda coluna. Uma pequena marcação de purificação com duas afinidades inerentes foi desenvolvida mediante a incorporação de um sítio de ligação adicional em um domínio de ligação à albumina existente, derivado da proteína G estreptocócica. O domínio de ligação à albumina de 46 aminoácidos se dobra em um feixe estável de três hélices e contém um sítio de ligação para a albumina sérica humana, localizado principalmente na segunda hélice; por meio da randomização genética de 11 aminoácidos expostos na superfície localizados nas primeira e terceira hélices, novas superfícies de ligação foram projetadas. Várias rodadas de biopaneamento contra um domínio zoma derivado da proteína A estafilocócica, utilizando uma biblioteca combinatória expressa em fago, resultaram em uma molécula bispecífica denominada A BDZ um, com afinidade tanto pela HSA quanto pelo domínio Z. Para preparar o plasmídeo de expressão da marcação de fusão bispecífica, prepare os fragmentos de PCR do gene A BDZ um, flanqueados por sítios de restrição apropriados para a clonagem e terminação do gene alvo no plasmídeo de expressão. Corte os fragmentos de PCR do A BDZ um e o vetor de expressão purificado contendo o gene de interesse com as enzimas de restrição escolhidas em tampão de reação apropriado e purifique os produtos antes da ligação.A seguir, ligue o fragmento A BDZ digerido ao vetor de expressão contendo o gene de interesse e transforme o produto de ligação em e coli. Plante as células transformadas em placas com ágar, suplementadas com antibióticos apropriados para seleção. Realize a triagem por PCR de algumas colônias e confirme por sequenciamento de DNA o cassete de expressão resultante.Por fim, prepare o plasmídeo a partir de uma cultura noturna de uma colônia com sequência verificada e transforme na linhagem de expressão preferida para expressar a proteína-alvo. Com a nova marcação fundida à sua extremidade, inicialmente inocule uma única colônia bacteriana em 10 mililitros de caldo de triptona e extrato de levedura suplementado com cinco gramas por litro de extrato de levedura e os antibióticos apropriados, e incube a 150 RPM e 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, inocule um mililitro da cultura noturna em 100 mililitros de meio fresco e induza a expressão proteica.Quando as células atingirem a fase de crescimento logarítmico, após a indução da proteína, incubar as células a 150 RPM e 25 graus Celsius durante a noite e colher as células no dia seguinte por centrifugação. A purificação por afinidade ortogonal da proteína de fusão A BDZ um é realizada por meio de uma purificação inicial em uma coluna com HSA imobilizada ou zoma. Em seguida, é realizado um segundo passo de purificação, empregando a segunda afinidade da marcação bispecífica.Meios cromatográficos com o domínio Z imobilizado, como o MA select sure, estão prontamente disponíveis para a purificação de anticorpos. Enquanto a HSA pode ser quimicamente acoplada a meios para fornecer a segunda matriz para prosseguir com a purificação por afinidade ortogonal, ressuspenda o pellet em 25 mililitros de tampão de corrida. Em seguida, rompa as células por sonicação com amplitude de 60% e pulsos de um segundo, seguidos por uma pausa de um segundo, durante um total de três minutos.Após centrifugar a amostra, filtre o sobrenadante contendo a proteína alvo por um filtro de 0,45 mícron antes da purificação adicional. Em seguida, equilibre uma coluna de esferas de HSA de um mililitro ou uma coluna ativada com NHS ligada à HSA com 10 volumes de coluna do tampão de corrida a um mililitro por minuto em um sistema apropriado de purificação de proteínas. Após a equilibração, aplique o lisado bacteriano a 0,5 mililitros por minuto, reajuste a vazão para um mililitro por minuto e lave a coluna com cinco volumes de coluna do tampão de corrida, seguidos por cinco volumes de coluna do tampão de lavagem.Elua a amostra com tampão de eluição a um mililitro por minuto e colete as frações. Monitore a absorção em 280 nanômetros para selecionar as frações do pico eluído. Para purificação adicional, reúna as frações com a maior concentração de proteína e, em seguida, dilua duas vezes.Assegure o tampão de corrida e verifique se o pH está em torno do neutro. Este passo é crítico para a ligação da proteína ao domínio Z. Adicione tris HCl 1 M, pH 8, para aumentar o pH, se necessário.Em seguida, carregue a amostra a 0,5 mililitros por minuto em uma coluna MA de aprisionamento alto de um mililitro que tenha sido equilibrada com sure. Após a vazão ter sido reajustada para um mililitro por minuto, a coluna é lavada com cinco volumes de coluna do tampão de corrida sure. Em seguida, elua as proteínas com ácido acético 0,2 molar pH 2,7 para proteínas-alvo sensíveis.O EIT pode ser neutralizado diretamente após a coleta pela adição de T tris. A página H-C-L-S-D-S pode ser utilizada para avaliar a pureza da proteína. É importante reduzir completamente a amostra, já que uma cisteína livre em A BDZ pode causar dimerização do produto em condições não redutoras.Como etapa final, o peso molecular do produto purificado pode ser analisado por espectrometria de massas após a purificação pelo protocolo ortogonal em uma coluna de HSA, seguida por uma coluna MA select sure. Diferentes amostras coletadas em vários pontos de purificação foram analisadas por eletroforese em gel de SDS-PAGE. As amostras incluíram a própria marcação AB DZ um, bem como três proteínas-alvo humanas diferentes fundidas à AB DZ um, representando diferentes classes de solubilidade, pesos moleculares e pontos isoelétricos.As pistas de um a quatro mostram lisados proteicos antes da purificação para as três diferentes proteínas de fusão AB DZ um e a própria marcação AB DZ um. As pistas de cinco a oito mostram os resultados da etapa de purificação de HSA das proteínas. Finalmente, as pistas de nove a doze resultam da etapa final de purificação por seleção de mAbs Sure.Além disso, amostras obtidas dos mesmos lisados purificados em ordem inversa nas mesmas colunas foram analisadas aqui. As pistas de um a três mostram lisados antes da purificação, enquanto as pistas de quatro a seis foram coletadas após a primeira etapa de purificação na coluna MAB Select Sure. Os produtos de alta pureza nas pistas de sete a nove resultam da purificação final de HSA.Os resultados demonstram claramente a utilidade de uma dupla marcação e de duas etapas altamente específicas de purificação. Embora uma pureza razoável seja alcançada após a etapa inicial de purificação, conforme observado nos géis, a etapa subsequente produz um produto muito puro, bem adequado para aplicações altamente exigentes. Uma vez dominada, a etapa de purificação central neste método pode ser realizada em poucas horas por uma única pessoa, obtendo-se uma proteína recombinante altamente pura, adequada para diversas aplicações.Por exemplo, após seguir este procedimento, as biomoléculas purificadas podem ser utilizadas em outras aplicações, como estudos de interação, com o objetivo de responder perguntas como a força de ligação de um complexo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão muito clara de como obter um produto proteico verdadeiramente puro utilizando esta marcação de afinidade dupla.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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 Uma técnica de cromatografia de afinidade para a purificação de uma proteína bacteriana recombinante

Neste vídeo, demonstramos a técnica de cromatografia de afinidade de níquel para purificar enzimas pirofosfoquinase marcadas com histidina da bactéria Clostridium difficile.

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No presente protocolo, demonstramos um método altamente eficiente e de baixo custo purificação de proteínas em pequena escala, que permite a purificação de proteínas recombinantes, combinando de forma única um GST-tag quebrável e uma pequena His-tag.

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Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Neste procedimento, um ligante de epítopo baseado em DsRed é imobilizado para produzir uma resina de afinidade altamente seletiva para a captação de anticorpos monoclonais de extratos de plantas brutas ou sobrenadantes de cultura celular, como uma alternativa à proteína A.

Agarose reticulada ativada para o rápido desenvolvimento de resinas de cromatografia de afinidade-captura de anticorpos como um estudo de caso

Este artigo fornece um procedimento para a purificação de afinidade de uma proteína recombinante humana, a endonuclease 1 (FEN1), que foi marcada com uma marca de 6X-histidina. O protocolo envolve a utilização de duas colunas distintas de íons metálicos imobilizados para a purificação da proteína marcada.

Purificação de afinidade de uma proteína marcada com 6X-His usando um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida 

Aprenda a purificar proteínas recombinantes com alta pureza usando um tag bispecífico de afinidade em cromatografia de duas etapas. Este método simplificado utiliza E. coli e colunas com albumina sérica humana e domínio Z.

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