Purificação de Proteínas ortogonais Facilitado por um Tag Affinity Pequenas Bispecific

O objetivo geral do experimento a seguir é produzir proteínas recombinantes muito puras por meio de um procedimento de purificação por afinidade em duas etapas. Para isso, uma marcação de purificação biespecífica baseada em um domínio de ligação à albumina é clonada em um vetor de expressão contendo o gene de interesse e, em seguida, a proteína de fusão é expressa em *E. coli*. Na segunda etapa, o lisado bacteriano contendo a proteína alvo é submetido à purificação em uma coluna cromatográfica com albumina sérica humana imobilizada ou HSA.

Em seguida, realiza-se uma purificação adicional em uma coluna MAB select superior resistance ou sure, contendo o domínio Z imobilizado derivado da proteína A estafilocócica. Isso resulta em um produto altamente puro, adequado para aplicações exigentes. Em seguida, a pureza é avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e, se necessário, por espectrometria de massas, a fim de garantir que a proteína de interesse tenha sido purificada com sucesso até a homogeneidade. Os resultados demonstram uma purificação eficiente após duas etapas sucessivas, em comparação com uma única etapa utilizando a nova marcação de purificação bispecífica empregada neste protocolo. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a purificação por afinidade em um único passo, é que a proteína pura pode ser obtida por meio de um protocolo simples que utiliza apenas um único marcador de afinidade, independentemente das propriedades ou da proteína-alvo.

Este método pode ser utilizado para proteínas com características muito diversas. Além disso, como a marcação é muito pequena, é facilmente produzida pelo hospedeiro bacteriano. Em geral, indivíduos novos neste procedimento de purificação o encontrarão muito simples e direto.

Uma etapa crítica é ajustar o pH da sua amostra antes de carregá-la na segunda coluna. Uma pequena marcação de purificação com duas afinidades inerentes foi desenvolvida mediante a incorporação de um sítio de ligação adicional em um domínio de ligação à albumina existente, derivado da proteína G estreptocócica. O domínio de ligação à albumina de 46 aminoácidos se dobra em um feixe estável de três hélices e contém um sítio de ligação para a albumina sérica humana, localizado principalmente na segunda hélice; por meio da randomização genética de 11 aminoácidos expostos na superfície localizados nas primeira e terceira hélices, novas superfícies de ligação foram projetadas. Várias rodadas de biopaneamento contra um domínio zoma derivado da proteína A estafilocócica, utilizando uma biblioteca combinatória expressa em fago, resultaram em uma molécula bispecífica denominada A BDZ um, com afinidade tanto pela HSA quanto pelo domínio Z. Para preparar o plasmídeo de expressão da marcação de fusão bispecífica, prepare os fragmentos de PCR do gene A BDZ um, flanqueados por sítios de restrição apropriados para a clonagem e terminação do gene alvo no plasmídeo de expressão. Corte os fragmentos de PCR do A BDZ um e o vetor de expressão purificado contendo o gene de interesse com as enzimas de restrição escolhidas em tampão de reação apropriado e purifique os produtos antes da ligação.

A seguir, ligue o fragmento A BDZ digerido ao vetor de expressão contendo o gene de interesse e transforme o produto de ligação em e coli. Plante as células transformadas em placas com ágar, suplementadas com antibióticos apropriados para seleção. Realize a triagem por PCR de algumas colônias e confirme por sequenciamento de DNA o cassete de expressão resultante.

Por fim, prepare o plasmídeo a partir de uma cultura noturna de uma colônia com sequência verificada e transforme na linhagem de expressão preferida para expressar a proteína-alvo. Com a nova marcação fundida à sua extremidade, inicialmente inocule uma única colônia bacteriana em 10 mililitros de caldo de triptona e extrato de levedura suplementado com cinco gramas por litro de extrato de levedura e os antibióticos apropriados, e incube a 150 RPM e 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, inocule um mililitro da cultura noturna em 100 mililitros de meio fresco e induza a expressão proteica.

Quando as células atingirem a fase de crescimento logarítmico, após a indução da proteína, incubar as células a 150 RPM e 25 graus Celsius durante a noite e colher as células no dia seguinte por centrifugação. A purificação por afinidade ortogonal da proteína de fusão A BDZ um é realizada por meio de uma purificação inicial em uma coluna com HSA imobilizada ou zoma. Em seguida, é realizado um segundo passo de purificação, empregando a segunda afinidade da marcação bispecífica.

Meios cromatográficos com o domínio Z imobilizado, como o MA select sure, estão prontamente disponíveis para a purificação de anticorpos. Enquanto a HSA pode ser quimicamente acoplada a meios para fornecer a segunda matriz para prosseguir com a purificação por afinidade ortogonal, ressuspenda o pellet em 25 mililitros de tampão de corrida. Em seguida, rompa as células por sonicação com amplitude de 60% e pulsos de um segundo, seguidos por uma pausa de um segundo, durante um total de três minutos.

Após centrifugar a amostra, filtre o sobrenadante contendo a proteína alvo por um filtro de 0,45 mícron antes da purificação adicional. Em seguida, equilibre uma coluna de esferas de HSA de um mililitro ou uma coluna ativada com NHS ligada à HSA com 10 volumes de coluna do tampão de corrida a um mililitro por minuto em um sistema apropriado de purificação de proteínas. Após a equilibração, aplique o lisado bacteriano a 0,5 mililitros por minuto, reajuste a vazão para um mililitro por minuto e lave a coluna com cinco volumes de coluna do tampão de corrida, seguidos por cinco volumes de coluna do tampão de lavagem.

Elua a amostra com tampão de eluição a um mililitro por minuto e colete as frações. Monitore a absorção em 280 nanômetros para selecionar as frações do pico eluído. Para purificação adicional, reúna as frações com a maior concentração de proteína e, em seguida, dilua duas vezes.

Assegure o tampão de corrida e verifique se o pH está em torno do neutro. Este passo é crítico para a ligação da proteína ao domínio Z. Adicione tris HCl 1 M, pH 8, para aumentar o pH, se necessário.

Em seguida, carregue a amostra a 0,5 mililitros por minuto em uma coluna MA de aprisionamento alto de um mililitro que tenha sido equilibrada com sure. Após a vazão ter sido reajustada para um mililitro por minuto, a coluna é lavada com cinco volumes de coluna do tampão de corrida sure. Em seguida, elua as proteínas com ácido acético 0,2 molar pH 2,7 para proteínas-alvo sensíveis.

O EIT pode ser neutralizado diretamente após a coleta pela adição de T tris. A página H-C-L-S-D-S pode ser utilizada para avaliar a pureza da proteína. É importante reduzir completamente a amostra, já que uma cisteína livre em A BDZ pode causar dimerização do produto em condições não redutoras.

Como etapa final, o peso molecular do produto purificado pode ser analisado por espectrometria de massas após a purificação pelo protocolo ortogonal em uma coluna de HSA, seguida por uma coluna MA select sure. Diferentes amostras coletadas em vários pontos de purificação foram analisadas por eletroforese em gel de SDS-PAGE. As amostras incluíram a própria marcação AB DZ um, bem como três proteínas-alvo humanas diferentes fundidas à AB DZ um, representando diferentes classes de solubilidade, pesos moleculares e pontos isoelétricos.

As pistas de um a quatro mostram lisados proteicos antes da purificação para as três diferentes proteínas de fusão AB DZ um e a própria marcação AB DZ um. As pistas de cinco a oito mostram os resultados da etapa de purificação de HSA das proteínas. Finalmente, as pistas de nove a doze resultam da etapa final de purificação por seleção de mAbs Sure.

Além disso, amostras obtidas dos mesmos lisados purificados em ordem inversa nas mesmas colunas foram analisadas aqui. As pistas de um a três mostram lisados antes da purificação, enquanto as pistas de quatro a seis foram coletadas após a primeira etapa de purificação na coluna MAB Select Sure. Os produtos de alta pureza nas pistas de sete a nove resultam da purificação final de HSA.

Os resultados demonstram claramente a utilidade de uma dupla marcação e de duas etapas altamente específicas de purificação. Embora uma pureza razoável seja alcançada após a etapa inicial de purificação, conforme observado nos géis, a etapa subsequente produz um produto muito puro, bem adequado para aplicações altamente exigentes. Uma vez dominada, a etapa de purificação central neste método pode ser realizada em poucas horas por uma única pessoa, obtendo-se uma proteína recombinante altamente pura, adequada para diversas aplicações.

Por exemplo, após seguir este procedimento, as biomoléculas purificadas podem ser utilizadas em outras aplicações, como estudos de interação, com o objetivo de responder perguntas como a força de ligação de um complexo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão muito clara de como obter um produto proteico verdadeiramente puro utilizando esta marcação de afinidade dupla.