Eletroporação de Mesênquima Craniofacial

O objetivo geral deste procedimento é eletrooperar macromoléculas carregadas no mesênquima facial craniano. Isso é feito posicionando primeiro um embrião anestesiado no estágio 28 dentro da câmara de eletroporação. O próximo passo é microinjetar a solução contendo macromoléculas carregadas no mesênquima craniofacial C.

Isso é rapidamente seguido pela aplicação de uma corrente elétrica, introduzindo assim os nucleotídeos de carga nas células. A etapa final do procedimento é visualizar o tecido eletroporado por microscopia de fluorescência. Em última análise, podem ser obtidos resultados mostrando alterações nos tecidos faciais cranianos.

Esses resultados podem ser analisados in vivo ou em tecido fixo usando fluorescência, microscopia ou imuno-histoquímica. A principal vantagem da eletroporação sobre os métodos existentes, como microinjeção e mutação, é o controle tecidual e temporal de nossas ferramentas moleculares, demonstrando que nosso procedimento hoje será Jackie Tabler, um pós-doutorado em meu laboratório. O par de eletrodos em forma de L necessários para este procedimento é feito de fio de tungstênio de alta pureza de 0,4 milímetro para cada eletrodo cortado primeiro oito centímetros do fio.

Em seguida, o uso de massa como a aderência azul afeta uma seringa de um mililitro no ponto médio do fio de tungstênio, deixando quatro centímetros de fio expostos na ponta da seringa. Dobre a ponta em forma de L a um centímetro da extremidade. Apare a ponta de forma que a ponta meça 0,5 centímetros de comprimento.

Esta dica é o terminal do eletrodo passar o excesso de fio de tungstênio paralelo à seringa. Ele será usado para conectar o gerador de pulso do eletrodo após a fabricação do segundo eletrodo. Prenda o par de eletrodos um ao outro usando fita adesiva para que o terminal do eletrodo eu corra em paralelo, com um centímetro de distância.

Por fim, conecte os eletrodos a um gerador de pulso de onda quadrada por meio de cabos CC. Para preparar a câmara de eletroporação personalizada, forre o fundo de um prato de 90 milímetros com cerca de cinco milímetros de argila de modelagem de cena de gesso não tóxica. Encha o prato com meio de eletroporação imergindo a cena de gesso.

Em seguida, use a pinça de relojoeiro número cinco para esculpir um poço em forma de T na cena de gesso para formar a eletroporação. Bem, o lado longo do poço deve medir cerca de dois milímetros por dois milímetros por 10 milímetros, e o lado curto deve ser de dois milímetros por dois milímetros por cinco milímetros. As micropipetas para este procedimento são feitas de capilares de vidro de silicato.

Use um extrator de agulha para preparar micropipetas com um cone de oito a 12 milímetros de comprimento e uma ponta fina, esmague a ponta a cerca de dois milímetros da ponta usando uma pinça, criando uma quebra irregular para configurar a micropipeta. Primeiro, preencha-o com cerca de um microlitro de solução de injeção, que nesta demonstração contém oligonucleotídeos marcados com fluorescência. Em seguida, prenda a micropipeta em um micro manipulador, incline a micropipeta a 50 graus do tampo da mesa.

Defina a pressão de injeção em 20 PSI e calibre a micropipeta para injetar 30 litros por pulso. Em preparação para a eletroporação, anestesiar uma larva de xeno estágio 28 incubando-a por cinco minutos. Em meios de eletroporação, que são meios anfíbios normais contendo 0,1% de benzocaína, transfira o girino anestesiado para a câmara de eletroporação.

Isso é preenchido com meios de eletroporação. A parte mais complicada do procedimento é inserir o micro animal de estimação no girino. Portanto, para garantir o sucesso, você deve prender o embrião com muita força e, em seguida, aplicar rapidamente a corrente após a microinjeção.

Posicione o embrião dentro do poço longo de modo que a cabeça fique na junção T. Com o lado dorsal para baixo e o lado ventral exposto, a cabeça deve ser ligeiramente elevada em comparação com a cauda usando uma pinça, prenda suavemente o girino no poço com a cena de gesso ao redor. É importante proteger o girino para evitar que ele se contorça durante a eletroporação, o que pode resultar em danos graves aos tecidos faciais.

Para iniciar este procedimento, insira a ponta da micropipeta imediatamente posterior à glândula cimentícia e na mecânica facial. Injete 30 nanolitros de solução no mesênquima, retraia a micropipeta. Alinhe rapidamente as pontas dos eletrodos paralelamente à cabeça do embrião e aplique oito pulsos quadrados de 50 milissegundos e 20 milivolts.

Em seguida, retraia os eletrodos usando uma pinça. Solte cuidadosamente o girino do poço. Em seguida, use uma pipeta para transferir o girino para três quartos de nom com 0,025 miligramas por mililitro.

Os girinos de gentamicina podem ser incubados neste meio durante a noite ou mais após 24 horas. Filtre girinos por microscopia fluorescente para eletroporação eficiente. O uso de moléculas fluorescentes permite fácil triagem de embriões eletroporados.

Esta figura mostra um lote típico de girinos eletroporados de oligonucleotídeos de morfonucleotídeo por volta de 1248 e 96 horas após a eletroporação. Nos estágios 30, 34 e 44, respectivamente. Os oligonucleotídeos de morfo fluorescentes podem ser visualizados dentro do meen facial craniano nos estágios 30 e 34.

No estágio 44, a fluorescência pode ser detectada nas cartilagens indicadas pelas pontas das setas brancas. A área altamente autofluorescente é o intestino. Seguindo este procedimento, podemos rastrear a linhagem de células elétricas, bem como os requisitos moleculares para proteínas de interesse.

Essa abordagem pode ser combinada com técnicas de imagem ao vivo para estudar a função do gene ao longo do tempo durante o desenvolvimento craniofacial.