Name: Eletroporação de Mesênquima Craniofacial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprenda a eletroporar macromoléculas no mesênquima craniofacial de embriões Xenopus laevis. Esta técnica permite controle temporal e espacial para estudar desenvolvimento craniofacial in vivo com microscopia de fluorescência.

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Somos gratos a Nancy Papalopulu e Bonev Boyan de assistência com eletroporação Xenopus. Agradecemos também a Marc Dionne para a leitura crítica, Green Jeremy e John Wallingford para discussões úteis e os membros do laboratório de Liu pelo seu apoio. Este trabalho foi financiado por concessões do BBSRC (BB/E013872/1) e do Wellcome Trust (081880/Z/06/Z) para KJL.

Parte 1A. Equipamento Microscópio: escopo estéreo dissecar ereta com o objectivo de baixa potência <ul><li> Tensão / Gerador de Pulso: BTX ECM 830 Sistema de Eletroporação Onda Quadrada </li><li> Extrator da pipeta: P-87 Micropipeta Puller (Sutter Instrument Company, CA) </li><li> Manipulator: grossa, ou combinado grosso e fino dependendo da preparação. </li><li> Micropipeta titular: Ferramentas Ciência Belas </li><li> Eletrodo: homemade </li><li> Eletroporação câmara: homemade </li></ul> Eletrodos em forma de L: <ol><li> Corte 8 cm de alta pureza fio de tungstênio 0,4 mm (Goodfellow) e apor no ponto médio de uma seringa de 1ml utilizando putty (usamos Blu-Tack). Deixe a 4 fios de tungstênio centímetros expostos a partir da ponta da seringa e ponta curva em forma de L, 1 cm de ponta (Fig. 1A). </li><li> Apare a ponta de modo que o fim de medidas de 0,5 mm de comprimento. Tsua dica é o término do eletrodo. </li><li> Correm paralelas excesso de fio de tungstênio para seringa e usá-lo para ligar o gerador de pulso eletrodo. </li><li> Repita o processo fazendo um par de eletrodos. </li><li> Anexar eletrodos ao gerador de pulso de onda quadrada através de cabos DC. </li></ol> Eletroporação câmara <ol><li> Linha de fundo de 90 mm com prato ~ 5 plasticina non-toxic mm. </li><li> Preencha prato com media eletroporação. </li><li> Usando No. 5 relojoeiro pinça de esculpir um poço em forma de T (Fig. 2). O bem longa deve medir ~ 2 mm x 2 mm x 10 mm e a curto ~ 2 mm x 2 mm x 5 mm. O prato eletroporação pode ser lavado e reutilizado. </li></ol> 1B parte. Reagentes DNA ou macromoléculas cobrado <ul><li> Micropipetas: 1 mm de largura 4 "de comprimento vidro borosilicato capilares (WPI, TW100-F) </li><li> Cultura da mídia: Normal Amphibian Media (NAM) </li><li> &gt; 10 ações X: 1100 mM NaCl, 20mM KCL, 10 mM Ca (NO 3) 2 4H • 2 O, 1 mM EDTA. <ul><li> Autoclave e armazenar a 4 ° C. </li><li> 1 X NAM: Diluir a partir de 10x estoque regulador, com 0,1 mM NaHCO 3 e 0,2 mM Na 3 PO 4. </li></ul></li><li> Xenopus laevis girinos, estágio 28 </li></ul> Preparação de DNA: <ol><li> Prepare plasmídeos de expressão, utilizando protocolos padrão. </li><li> Ressuspender o DNA para uma concentração final de 1 mg / mL em nuclease livre H 2 0. </li></ol> * Temos tido sucesso com vetores contendo um promotor CMV fortes, como pCS2 + [16]. Para a análise de linhagem, que geralmente incluem DNA de codificação de uma proteína fluorescente verde (GFP pCS2 +) em uma concentração final de 0,1 g / mL. Concentrações [DNA entre 0,1-3 mg / mL também foram testados. Descobrimos que as concentrações abaixo de 0,8 mcg / mL células ineficiente rotulados, enquanto que as concentrações de DNA maior que 2 mg / m &amp;u; l não melhorar a eficiência eletroporação]. Morfolino preparação de oligonucleotídeos: (Nota:. MOs precisam ser fluoresceinated (3'-carboxifluoresceína modificada) ou carregada) <ol><li> Oligonucleotídeos ressuspender morfolino (MOs) (Genetools, <a href="http://www.genetools.com" target="_blank">www.genetools.com</a> ) a uma concentração de 2 mM em nuclease livre H 2 0. </li><li> Alíquota da solução de reserva de calor a 65 ° C por 5 minutos. </li><li> Diluir a concentração final de 0,5 mM em água livre de nuclease. </li></ol> * 0.1-1mM MO soluções foram testadas. 0,5 mM soluções MO foram suficientes para eletroporação de muitas células mesenquimais. Micropipetas <ol><li> Prepare micropipetas de vidro borosilicato capilares (1 mm de largura, 4 "de comprimento, WPI não. TW100-F). Use extrator de agulhas para preparar micropipetas com um cone 12/08 mm de comprimento e ponta fina. </li><li> Ponta esmagar ~ mm 2da ponta com a pinça, criando uma ruptura irregulares. </li></ol> Mídia <ol><li> Meio de incubação: Prepare fresco 04/03 normal Amphibian Media (NAM) de 1x estoque. Adicionar 0,025 mg / ml de gentamicina. </li><li> Eletroporação media: como acima, com 0,1% benzocaína (Sigma, 06950). </li></ol> 2. Eletroporação Micropipeta configuração <ol><li> Preencha micropipeta com ~ 1 ml solução injectável. </li><li> Micropipeta segura em micromanipulador e anexar a microinjetor (Picospritzer II). </li><li> Micropipeta ângulo de 50 ° a partir da mesa. </li><li> Ajuste a pressão de injeção de 20 PSI. </li><li> Calibrar micropipeta para injetar 30 nl por pulso. </li></ol> Preparação de girino <ol><li> Anestesiar estágio 28 larvas por incubação de Xenopus na mídia eletroporação por 5 minutos. </li><li> Transferência de girino anestesiados em câmara de eletroporação cheia de mídia eletroporação. Embrião posiçãodentro do prazo também para que a cabeça repousa no entroncamento com a face dorsal baixo e de lado ventral exposta. A cabeça deve ser ligeiramente elevada em comparação com a cauda. </li><li> Utilizando uma pinça, gentilmente segura girino bem com em torno de plasticina. (Nota:.. Se o girino não é garantido, pode se contorcer e contato do eletrodo durante a eletroporação Neste caso, descartar o girino como tecidos faciais será severamente danificado) </li></ol> Eletroporação <ol><li> Introduza a ponta micropipeta imediatamente posterior à glândula de cimento e em mesênquima facial. </li><li> Injetar 30 nl solução em mesênquima. </li><li> Retrair micropipeta. </li><li> Alinhar rapidamente dicas eletrodo paralelo à cabeça do embrião (Fig. 3). </li><li> Aplicar 8 50 ms pulsos, 20mV quadrados. </li><li> Retrair eletrodos. </li><li> Utilizando uma pinça cuidadosamente liberação de girinos de bem e transfira para 04/03 NAM, 0.025 gentamicina mg / ml. </li><li> Girinos podem ser incubadas em 04/03 NAM, 0,025 mg / ml overnight, ou mais. </li><li> Embriões tela para eletroporação eficiente por microscopia de fluorescência, após 24 horas. </li></ol> 3. Resultados representativos: O uso de moléculas fluorescentes permite a triagem de embriões electroporated fácil. A Figura 4 mostra um lote típico de MO electroporated girinos ~ 12, 48 e 96 horas após a eletroporação, incubados a 14,5 ° C. Usando microscopia de fluorescência, MOs podem ser visualizados imediatamente após eletroporação e persistir por vários dias após a eletroporação. Em nossa experiência, a fluorescência é fracamente evidente na fase 46 (~ 5 dias depois). Nas cartilagens, fluorescência diminui drasticamente após o início da diferenciação (~ 42 º), no entanto, MO fluorescência persiste mais fortemente em outros tipos celulares, como a endoderme da faringe. Microscopia de fluorescência mostra que oligonucleotídeos são incorporados em vários tecidos craniofacial, incluindo cartilagem. Oligonucleotídeo fluorescência cmuitas vezes um ser visualizado no tecido de cada lado da cabeça. Este é provavelmente devido a rápida difusão da solução injectável em todo o mesênquima frouxo craniofacial antes de eletroporação. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig1.jpg"> Figura 1 Homemade eletrodos. L-shaped fio de tungstênio é anexado a uma seringa de 1 ml usando non-toxic da argila ou massa de vidraceiro. (A) O término do eletrodo mede 5 mm. (B) Anexar um par de eletrodos, de modo que os términos correm paralelas. Eletrodos são ligados ao gerador de pulsos por cabos DC. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig2.jpg"> Figura 2 câmara de eletroporação. (A) 90 milímetros prato forrado com plasticina é preenchido com a mídia e uma câmara em forma de T esculpida com uma pinça Não é relojoeiro 5. (B) O lado mais comprido mede 2 mm X 2 milímetros X10 milímetroenquanto as medidas de curto 2 milímetros X 2 mm X 5 mm. A cabeça do embrião repousa no entroncamento, parte ventral para cima. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig3.jpg"> Figura 3 Esquema ilustrando procedimento eletroporação. St. 28 de girinos é colocado na câmara de eletroporação, lado ventral para cima. Micropipeta é inserida em glândula de cimento facial mesênquima subjacente. Injetar. Micropipeta é removido e em forma de L eletrodos são alinhados em paralelo de acompanhamento da cabeça. Aplicar oito de 50 ms, 20 pulsos mV quadrados. Retrair eletrodos. Girinos crescem para estágios desejado. Visualize MOs ou GFP expressão usando microscopia de fluorescência. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig4.jpg"> Figura 4 girinos Representante 12 (A), 48 (B), e 96 (C) horas após eletroporação (etapas 30, 34 e 44 respectivamente). (A "-B") Fluorescente MO pode ser visualizado no mesênquima craniofacial em stages 30 e 34. Fluorescência pode ser detectada nas cartilagens na fase 44 (ponta de seta,'c C "). O intestino é altamente autofluorescent.

<ol><li>Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-9+reveals+regional+diversity+of+neural+progenitors+along+the+anterior-posterior+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis.</a> Dev. Cell. 20, 19-32 (2011).</li>
<li>Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
<li>Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+RNA+interference+in+post-implantation+mouse+embryos+using+directional+electroporation+and+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture.</a> Differentiation. 72, 92-102 (2004).</li>
<li>Drinjakovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3+ligase+Nedd4+promotes+axon+branching+by+downregulating+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">E3 ligase Nedd4 promotes axon branching by downregulating PTEN.</a> Neuron. 65, 341-357 (2010).</li>
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<li>Khoury, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+intra-articular+versus+systemic+gene+electrotransfer+in+experimental+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene.+Med%22%5BJournal%5D)">A comparative study on intra-articular versus systemic gene electrotransfer in experimental arthritis.</a> J. Gene. Med. 8, 1027-1036 (2006).</li>
<li>Takahashi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+cathepsin+K+in+synovium+leads+to+progression+of+osteoarthritis+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis.+Rheum%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of cathepsin K in synovium leads to progression of osteoarthritis in rabbits.</a> Arthritis. Rheum. 60, 2372-2380 (2009).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis%3A+A+Laboratory+Manual%22">Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbour Laboratories Press. (2000).</li>
<li>Wheeler, G. N., Brandli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+vertebrate+models+for+chemical+genetics+and+drug+discovery+screens%3A+lessons+from+zebrafish+and+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: lessons from zebrafish and Xenopus.</a> Dev. Dyn. 238, 1287-1308 (2009).</li>
<li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes. Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li>
</ol>

Os autores não têm conflito de interesses.

Neste vídeo, demonstramos a viabilidade de eletroporação mediada entrega do gene para o mesênquima facial de Xenopus girinos. Usando essa abordagem, podemos contornar primeiros efeitos no desenvolvimento de manipular a função do gene que nos permite atingir tecidos específicos em momento posterior. Nossos estudos mostram que as populações heterogêneas de células mesenquimais craniofacial pode ser afetado, o que nos permite analisar a linhagem de células electroporated, bem como requisitos de células autônomas para as proteínas de interesse. Combinado com imagens ao vivo, podemos usar essa abordagem para estudar a função do gene, ao longo do tempo, durante o desenvolvimento craniofacial. Esse novo método destaca a rastreabilidade de Xenopus para o estudo da organogênese. Nós antecipamos que este método pode ser amplamente adaptados para estudar a morfogênese e diferenciação de outros tecidos também.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3381">Electroporation of Craniofacial Mesenchyme</a>. There was an incorrect unit used for the voltage.

Erratum: Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

eletroporação de mesênquima craniofacial

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Eletroporação é um método eficiente de entrega de DNA e outras macromoléculas cobrados nos tecidos em momentos precisos e em locais precisos. Por exemplo, eletroporação tem sido utilizado com grande sucesso para estudar o desenvolvimento neural e da retina em Xenopus, frango e mouse 1-10. No entanto, é importante notar que em todos esses estudos, os investigadores não foram alvo de tecidos moles. Porque estamos interessados ​​no desenvolvimento craniofacial, adaptamos um método para alvejar mesênquima facial. Quando buscamos a literatura, encontramos, para nossa surpresa, poucos relatos de transferência de genes de sucesso no tecido cartilaginoso. A maioria destes estudos foram os estudos de terapia genética, como siRNA ou proteína entrega em linhagens de células condrogênicos, ou, modelos animais de artrite 11-13. Em outros sistemas, tais como a galinha ou o mouse, eletroporação de mesênquima facial tem sido um desafio (pessoal comunicandoíons, Departamento de Desenvolvimento Craniofacial, KCL). Nossa hipótese é que eletroporação em tecidos procartilaginous e cartilaginosa em Xenopus poderia funcionar melhor. Em nossos estudos, nós mostramos que a transferência de genes nas cartilagens faciais ocorre de forma eficiente nas fases iniciais (28), quando o primórdio facial ainda é composta por tecido mole antes da diferenciação da cartilagem. Xenopus é um sistema muito acessível vertebrados e para análise do desenvolvimento craniofacial. Estruturas craniofaciais são mais facilmente visível em Xenopus do que em qualquer outro modelo de vertebrados, principalmente porque os embriões Xenopus são fertilizados externamente, permitindo análises das primeiras etapas, e facilitando a imagem ao vivo na resolução única célula, assim como a reutilização das 14 mães. Entre os modelos de desenvolvimento de vertebrados externamente, Xenopus é mais útil para a análise craniofacial de peixe-zebra, como larvas Xenopus são maiores e mais fácil de dissect, ea região em desenvolvimento facial é mais acessível à imagem do que a região equivalente em peixe. Além disso, Xenopus é evolutivamente mais próximos do homem do que peixe-zebra (~ 100 milhões ano mais próximo) 15. Finalmente, nestes estágios, girinos Xenopus são transparentes, e expressão simultânea de proteínas fluorescentes ou moléculas permitirá uma fácil visualização das cartilagens em desenvolvimento. Nós antecipamos que esta abordagem irá permitir-nos rapidamente e eficientemente teste moléculas candidato em um sistema modelo in vivo.

Cartilagens craniofacial desenvolver em estreito contato com outros tecidos e são difíceis de manipular em animais vivos. Estamos usando eletroporação para entregar ferramentas moleculares durante o crescimento do esqueleto craniofacial, enquanto ignorando cedo efeitos embrionárias. Esta abordagem irá permitir-nos testar de forma eficiente as moléculas de candidato<em&gt; In vivo.</em

Eletroporação de Mesênquima Craniofacial

A electroporação é um método eficiente de entrega de DNA e outras macromoléculas carregadas em tecidos em pontos temporais e locais precisos.

O objetivo geral deste procedimento é eletroinjetar macromoléculas carregadas no mesênquima craniofacial. Isso é realizado posicionando-se primeiro um embrião anestesiado do estágio 28 dentro da câmara de eletroporação. O próximo passo é microinjetar a solução contendo macromoléculas carregadas no mesênquima craniofacial C.Isso é rapidamente seguido pela aplicação de uma corrente elétrica, introduzindo assim os nucleotídeos carregados nas células. O passo final do procedimento é visualizar o tecido eletroporado por microscopia de fluorescência. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram alterações nos tecidos craniofaciais.Esses resultados podem ser analisados in vivo ou em tecido fixado utilizando fluorescência, microscopia ou imunohistoquímica. A principal vantagem da eletroporação em comparação com métodos existentes, como microinjeção e mutação, é o controle tecidual e temporal de nossas ferramentas moleculares, demonstrando que nosso procedimento hoje será realizado por Jackie Tabler, uma pós-doutoranda no meu laboratório. O par de eletrodos em forma de L necessário para este procedimento é feito de fio de tungstênio de alta pureza, com 0,4 milímetro de diâmetro, sendo que cada eletrodo deve ser cortado com oito centímetros de comprimento do fio.Em seguida, usando massa moldável, como massa adesiva azul, fixe uma seringa de um mililitro no ponto médio do fio de tungstênio, deixando quatro centímetros do fio expostos a partir da ponta da seringa. Dobre a ponta em formato de L a um centímetro da extremidade. Corte a ponta para que a extremidade tenha 0,5 centímetro de comprimento.Dica: este terminal é o eletrodo terminal; passe o excesso de fio de tungstênio paralelamente à seringa. Ele será usado para conectar o gerador de pulsos do eletrodo após o segundo eletrodo ter sido confeccionado. Prenda o par de eletrodos um ao outro usando fita, de modo que os terminais dos eletrodos fiquem paralelos, separados por um centímetro.Por fim, conecte os eletrodos a um gerador de pulso em onda quadrada por meio de cabos DC. Para preparar a câmara de eletroporação personalizada, forre o fundo de uma placa de 90 milímetros com cerca de cinco milímetros de massa de argila não tóxica para modelagem de cenários. Encha a placa com meio de eletroporação, imergindo completamente a massa de argila.Em seguida, utilize uma pinça de relojoeiro número cinco para esculpir um poço em formato de T na cena de gesso para formar a eletroporação. O poço deve ter, aproximadamente, dois milímetros por dois milímetros por 10 milímetros no lado longo, e dois milímetros por dois milímetros por cinco milímetros no lado curto. As micropipetas para este procedimento são feitas a partir de capilares de vidro de silicato.Use um puxador de agulhas para preparar micropipetas com uma ponta afilada de oito a 12 milímetros de comprimento e uma ponta fina, quebre a ponta a cerca de dois milímetros da extremidade usando pinças, criando uma fratura irregular para preparar a micropipeta. Primeiro, preencha-a com cerca de um microlitro de solução de injeção, que, nesta demonstração, contém oligonucleotídeos marcados com fluorescência. Em seguida, fixe a micropipeta em um micromanipulador e posicione a micropipeta em um ângulo de 50 graus em relação à superfície da mesa.Defina a pressão de injeção em 20 PSI e calibre a micropipeta para injetar 30 litros por pulso. Em preparação para eletroporação, anestesie uma larva de xeno no estágio 28 incubando-a por cinco minutos. Em meio de eletroporação, que é o meio anfíbio normal contendo 0,1% de benzocaína, transfira a rã-touro anestesiada para a câmara de eletroporação.Isso é preenchido com meio de eletroporação. A parte mais difícil do procedimento é inserir o microeletrodo na girina. Para garantir o sucesso, é necessário fixar bem firmemente o embrião e, em seguida, aplicar rapidamente a corrente após a microinjeção.Posicione o embrião dentro do poço longo de modo que a cabeça repouse na junção em T. Com o lado dorsal para baixo e o lado ventral exposto, a cabeça deve ser levemente elevada em relação à cauda usando pinças; fixe suavemente o girino no poço com o reboco ao redor. É importante fixar bem o girino para evitar que ele se contorça durante a eletroporação, o que poderia resultar em danos graves aos tecidos faciais.Para iniciar este procedimento, insira a ponta da micropipeta imediatamente posterior à glândula cementária e dentro do mesênquima facial. Injete 30 nanolitros de solução no mesênquima, retire a micropipeta. Alinhe rapidamente as pontas dos eletrodos paralelamente à cabeça do embrião e aplique oito pulsos quadrados de 50 milissegundos e 20 milivolts.Em seguida, retire os eletrodos utilizando pin&ccedil;as. Libere cuidadosamente o girino do po&ccedil;o. Em seguida, use uma pipeta para transferir o girino para nom tr&ecirc;s quartos com 0,025 miligramas por mililitro.Os girinos podem ser incubados neste meio durante a noite ou por períodos mais longos após 24 horas. Analise os girinos por microscopia de fluorescência para verificar a eletroporação eficiente. O uso de moléculas fluorescentes permite a triagem fácil de embriões eletroporados.Esta figura mostra um lote típico de girinos eletroporados com oligonucleotídeos morph por volta de 12, 48 e 96 horas após a eletroporação, respectivamente nos estágios 30, 34 e 44. Oligonucleotídeos morph fluorescentes podem ser visualizados dentro da mesênquima craniofacial nos estágios 30 e 34.No estágio 44, a fluorescência pode ser detectada nas cartilagens indicadas pelas cabeças de seta brancas. A região altamente autofluorescente é o intestino. Após este procedimento, podemos rastrear a linhagem de células eletro, bem como os requisitos moleculares para proteínas de interesse.Essa abordagem pode ser combinada com técnicas de imagem em tempo real para estudar a função gênica ao longo do tempo durante o desenvolvimento craniofacial.

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Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

Para realizar uma avaliação rápida da função de genes no desenvolvimento de córtex cerebral, que descrevem métodos que envolvem...

Métodos de Estudo da morfogênese neuronal:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Eletroporação RNAi no Cortex Cerebral Murina embrionárias

Como as redes neuronais são estabelecidas no cérebro embrionário é uma questão fundamental no desenvolvimento da neurobiologia. Aqui nós combinamos uma técnica de eletroporação com novas ferramentas genéticas, como Cre / Lox-plasmídeos e sistema de transposição de DNA PiggyBac mediada no hindbrain aviária para rotular interneurons dorsal e rastrear suas projeções axonais e metas sinápticas em diferentes estágios de desenvolvimento.

Eletroporação do rombencéfalo rastrear Trajetórias axonal e Metas Synaptic no embrião de galinha

A superfície pial é uma zona de progenitor original no SNC, que está a receber cada vez mais atenção. Aqui, detalhamos um método para manipulação genética rápida desta zona progenitor usando um método de eletroporação modificado. Este procedimento pode ser usado para investigações celulares e moleculares de linhagens celulares e vias de sinalização envolvidas na diferenciação celular e para esclarecer o destino e as propriedades das células-filhas.

Neonatal Pial Superfície Eletroporação

Apresentamos um método que descreve o isolamento e a cultura de explantes cocleares da orelha interna embrionária de camundongos.  Também demonstramos um método para transferência de genes em explantes cocleares por meio de eletroporação de onda quadrada. A cultura de explantes in vitro, juntamente com a técnica de transferência de genes, permite que os pesquisadores estudem os efeitos da alteração da expressão gênica durante o desenvolvimento.

Cultura da embrionárias mouse cocleares explantes e Gene Transferência de Eletroporação

O dobro na eletroporação uteral permite atingir populações celulares que são separadas espacial e temporalmente. Esta técnica é útil para visualizar interações entre essas populações celulares usando proteínas fluorescentes em condições normais, mas também após experimentos funcionais para perturbado genes de interesse.

Dupla em Eletroporação utero para atingir populações celulares temporais e espacialmente separadas

Aqui, apresentamos um protocolo que combina eletroporação in vivo e desnervação do músculo levantador do auro longo do crânio (LAL). Este procedimento permite o estudo do papel potencial das proteínas derivadas do músculo na regeneração da sinapse neuromuscular.

Eletroporação In Vivo Combinada e Reinervação de Curto Prazo do Músculo Esquelético do Elevador do Crânio Longo do Auris

Aqui, apresentamos a manipulação genética aguda de organoides corticais humanos fatiados por eletroporação. Esses modelos organoides corticais são particularmente passíveis de injeção, pois estruturas semelhantes a ventrículos podem ser prontamente identificadas após o corte, permitindo a investigação funcional do desenvolvimento cortical humano, distúrbios do neurodesenvolvimento e evolução cortical.

Eletroporação de organoides corticais humanos fatiados para estudos da função gênica

Aprenda a eletroporar macromoléculas no mesênquima craniofacial de embriões Xenopus laevis. Esta técnica permite controle temporal e espacial para estudar desenvolvimento craniofacial in vivo com microscopia de fluorescência.

Eletroporação de Mesênquima Craniofacial

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