De alto rendimento cristalização de proteínas de membrana Usando o método Bicelle lipídico

Este vídeo demonstrará um método para configurar testes de cristalização de alto rendimento de proteínas de membrana purificadas usando células Lipic B. As primeiras células B são preparadas misturando um lipídio e uma proteína de membrana purificada em detergente é incorporada à mistura de células B e os testes de cristalização são realizados usando uma inspeção visual de robô de nanolitros. O uso de um microscópio de luz padrão revela a presença de cristais.

Uma vez formados, os cristais de proteína podem ser extraídos e congelados para coleta de dados e determinação estruturada. A principal vantagem dessa técnica é que, devido ao comportamento de fase exclusivo das células B, equipamentos padrão e robótica disponíveis no laboratório podem ser utilizados para cristalização. A configuração das células B é uma técnica tão simples e permite que você retire a proteína de membrana alvo do detergente da célula e coloque-a em um meio líbico.

Isso lhe dá um conjunto totalmente novo de condições para a tela. É um método tão simples que tem sido usado com sucesso em muitas proteínas de membrana que simplesmente não há razão para não experimentá-lo. O primeiro passo na cristalização baseada em células B é a preparação de uma mistura de anfia lipídica formadora de células B.

Este processo requer um esforço considerável e é o mais demorado. Observe que pode levar várias horas para ser concluído. As células B podem se formar em uma variedade de combinações de anfíbios lipídicos e em uma ampla gama de concentrações.

Para pontos de partida sugeridos, consulte a tabela um no protocolo escrito que acompanha e comece preparando um mililitro de mistura de capso de 35% DMPC em uma proporção de 2,8 para um molar. Para fazer isso, pese 0,26 gramas de DMPC e 0,09 gramas de Chapo em um tubo. Aumente o volume para 1,0 mililitros usando o vórtice de água deionizada da mistura.

Em seguida, aqueça a mistura a cerca de 40 graus Celsius em banho-maria até que se torne gelatinosa. Coloque o tubo no gelo. A amostra deve tornar-se fluida novamente.

Em seguida, vórtice novamente por alguns minutos, continue percorrendo as etapas de aquecimento, resfriamento e vórtice até que o lipídio esteja completamente dissolvido. Observe que, à medida que mais ciclos são realizados, a mistura pode ficar turva após o resfriamento após a conclusão. A mistura será um gel transparente à temperatura ambiente ou acima, e um líquido viscoso no gelo pelas células pode ser colocado a menos 20 graus Celsius para armazenamento a longo prazo.

Em seguida, as proteínas purificadas são incorporadas ao meio das células B. Este é um processo simples e deve ser realizado no mesmo dia da cristalização, que é mostrado na próxima seção do vídeo. Descongele a mistura de células B DMPC capso à temperatura ambiente até que a fase mude para um gel transparente.

Coloque a mistura no gelo para liquefazê-la e, em seguida, faça um vórtice breve para restabelecer uma fase homogênea de células B. Deste ponto em diante, mantenha a mistura de células B e a proteína purificada no gelo. Isso manterá a célula B em fase líquida, tornando-a passível de pipetagem.

Em seguida, adicione a mistura de células B à proteína solubilizada em detergente purificado na proporção de um para quatro, volume a volume. Em seguida, pipete suavemente para cima e para baixo até que a solução se torne límpida e homogênea. Se aparecerem bolhas, brevemente, gire-as em uma centrífuga de mesa.

Incube a mistura no gelo por pelo menos 30 minutos para promover a incorporação completa da proteína nas células. A mistura proteína por célula está agora pronta para testes de cristalização. Os testes de cristalização serão demonstrados usando um robô de cristalização de mosquitos.

Legal, uma placa inferior em V de 96 poços, colocando-a no gelo. Pipete a mistura de proteína por célula para a placa para garantir que a viscosidade da solução seja mínima. Mantenha a mistura de proteína por célula no gelo até a etapa final.

O robô usado aqui tem cinco plataformas. Coloque a microplaca contendo o reservatório na plataforma três e a tampa de cristalização na qual as gotas serão dispensadas na plataforma cinco. Em seguida, coloque a proteína por placa celular na plataforma quatro mais próxima da posição de distribuição.

Isso garante que a mistura de proteína por célula seja a última a ser captada pelo robô e seja imediatamente liberada. Usando o software para iniciar a execução, o robô pegará a solução do reservatório seguida pela mistura de proteína por célula e as dispensará na tampa como gotas para evitar o aquecimento e o aumento da viscosidade durante a distribuição. Não programe o mosquito para misturar o reservatório com a mistura de proteína por célula assim que a corrida estiver concluída.

Remova a placa de proteína de célula de compra do instrumento e coloque-a no gelo. Retire a tampa do instrumento e coloque-a na placa que contém a solução do reservatório de forma que as gotas fiquem invertidas. Incube a placa a 20 graus Celsius.

Observe que outras temperaturas também podem ser testadas para formação e otimização de cristais. Temperaturas mais altas induzem a fase lamelar, que tem a vantagem de pré-organizar a proteína em camadas. Temperaturas entre quatro graus Celsius e 20 graus Celsius podem ser rastreadas.

Temperaturas abaixo de quatro graus Celsius podem fazer com que os lipídios precipitem por longos períodos de tempo no primeiro, terceiro dia e semanalmente a partir de então, avalie a aparência e o crescimento do cristal usando um microscópio de luz padrão. Aqui são mostradas uma imagem de campo claro e uma imagem UV de cristais em forma de agulha observados apenas na condição de assalto. A fluorescência não foi detectada nos cristais, indicando um falso positivo nesta imagem.

Um cristal em forma de haste se formou quando o metil propanodiol foi usado como precipitante. O cristal fluoresce semanalmente, indicando que pode ser um cristal de proteína, mas foi considerado não tenaz usando difração de raios-x. Aqui é mostrado um cristal observado cerca de quatro semanas após a criação dos testes.

A forte fluorescência sob luz UV confirma que é um cristal de proteína. Como você assistiu neste vídeo. Uma vez que as células B estejam disponíveis, elas podem ser misturadas diretamente com proteínas purificadas e, a partir deste ponto, a cristalização prossegue quase exatamente como protocolos padrão baseados em detergente.

Outra vantagem distinta é a capacidade de dopar células B com lipídios específicos para fins de otimização. Há realmente muita versatilidade com a técnica e é tão simples de usar que deve ser testada para todos os projetos de cristalização de proteínas de membrana.