Um método simples para criação de imagens Arabidopsis Folhas Usando Perfluorodecalin como um meio de imagem infiltrativas

O objetivo geral deste procedimento é minimizar a degradação de imagens biológicas causada pelos espaços aéreos nas folhas de plantas, a fim de obter imagens mais nítidas de células vivas no interior da folha. Se a folha for montada em um meio de montagem aquoso e um fluoróforo for excitado por um laser, muitos espaços aéreos não preenchidos e alterações no índice de refração dentro do tecido, mostrados em laranja, limitam a intensidade do sinal proveniente de camadas mais profundas do tecido na imagem resultante. Se, ao invés disso, a folha for montada em perfluorodecalina (PFD), a excitação a laser do fluoróforo resultante é menos atenuada e permite uma melhor transmissão dos sinais emitidos.

No final, o uso de microscopia confocal a laser com meio de montagem PFD fornece imagens nítidas de células vivas dentro da folha da planta a uma profundidade superior ao dobro daquela possível com meio de montagem aquoso. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como fixação ou montagem de folhas em meios aquosos, é que ela reduz a refração dentro do mesófilo e permite uma visualização mais precisa de células vivas mais profundas na folha, o que tem sido um desafio até agora. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na ciência das plantas, como o estudo do mesófilo, biologia celular e sinalização in vivo, a colonização de folhas por patógenos e as interações entre patógenos e o mesófilo, embora este método também possa fornecer informações sobre a biologia vegetal fundamental.

Também pode ser aplicado a outros tecidos altamente refrativos que são ricos em espaços aéreos, como espirais de insetos ou o pulmão de vertebrados. Demonstrará este procedimento o Dr. George Littlejohn do meu laboratório To Mount Leaf. As amostras em PFD começam com o preparo de uma lâmina de microscópio com uma junta permeável a gases de poli dimetil siloxano ou P-D-M-S. O P-D-M-S é um polímero viscoelástico que pode ser moldado para fornecer uma câmara adaptada às exigências experimentais.

Equilibre o PFD com ar agitando um pequeno volume de PFD em um frasco cheio de ar. Isso também pode ser feito borbulhando ar através do PFD; em seguida, decante o PFD em uma placa de Petri aberta e coloque uma plântula inteira ou uma folha destacada a flutuar sobre o líquido por cinco minutos. O tecido deve tornar-se translúcido, lembrando um tecido vitrificado.

As folhas podem parecer mais escuras ou mais claras do que antes da exposição ao DFP, dependendo das condições de iluminação e da idade do tecido utilizado. Por fim, preencha a câmara de PDMS com DFP equilibrado com ar e transfira cuidadosamente as amostras de tecido da placa de Petri de incubação para a câmara de PDMS. Selle o lâmina com uma lamínula e realize a aquisição de imagens.

De acordo com os requisitos experimentais, folhas de meses foram incubadas por cinco minutos em uma suspensão de proteína verde fluorescente recombinante ou GFP. Na inspeção microscópica de PFD, amostras de folhas incubadas em PFD mostram que a maioria dos espaços aéreos está inundada com GFP recombinante suspensa em PFD. A GFP aparece em verde, e o vermelho representa clorofila, fluorescência lotto e delits nas células do mesófilo.

É evidente que a folha é inundada após incubação com DFP, mas que bolsos ocasionais de ar podem permanecer. A água não inunda a folha sob essas condições. Aqui, folhas de opsys que expressam Venus, uma variante da YFP, que se localiza no citosol, são incubadas e montadas no ar, em água ou em DFP para varredura a laser. A microscopia confocal das amostras mostra uma vantagem do DFP em relação ao ar e à água, com um aumento aproximado de duas vezes na profundidade de imagem.

Ao comparar PFD e água, uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cinco a dez minutos, se executada corretamente. Durante a realização deste procedimento, é importante lembrar que o perfluordelina dissolve esmalte de unha e teflon, mas é compatível com graxa de silicone. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar o perfluordelina como meio de montagem para melhorar a imagem em células de folhas de plantas.

Não se esqueça de que, embora o perfluorodecalina seja não tóxico, recomendamos que práticas padrão de segurança sejam adotadas ao realizar este procedimento.