Um método simples para criação de imagens Arabidopsis Folhas Usando Perfluorodecalin como um meio de imagem infiltrativas

O objetivo geral deste procedimento é minimizar a degradação das imagens biológicas causadas pelos espaços aéreos nas folhas das plantas para adquirir imagens mais claras das células vivas dentro da folha. Se a folha for montada em um meio de montagem aquoso e um fluoróforo for excitado por um laser, muitos espaços de ar não preenchidos e mudanças no índice de refração dentro do tecido mostrado em laranja limitam a força do sinal profundo de dentro do tecido na imagem resultante. Se a folha for montada por delineamento de flúor ou PFD, a excitação do laser resultante do fluoróforo é menos atenuada e permite uma melhor transmissão dos sinais emitidos.

Em última análise, o uso da microscopia confocal a laser de varredura com o meio de montagem PFD fornece imagens claras de células vivas dentro da folha da planta a uma profundidade que é mais do que o dobro do possível quando um meio de montagem aquoso é usado. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como fixação ou montagem de folhas e meios aquosos, é que ela reduz a refração dentro do preenchimento meso e permite imagens mais precisas de células vivas mais profundas na folha, o que tem sido problemático. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na ciência das plantas, como abordar o preenchimento meso, a biologia celular e a sinalização in vivo, a colonização das folhas por patógenos e as interações de preenchimento de patógenos, embora este método possa fornecer informações sobre a biologia vegetal fundamental.

Também pode ser aplicado a outros tecidos altamente refrativos que são ricos em espaço aéreo, como espirais de insight ou pulmão de vertebrados. Demonstrando este procedimento estará o Dr. George Littlejohn do meu laboratório To Mount Leaf. As amostras no PFD começam com a preparação de uma lâmina de microscópio com uma junta permeável a gás de poli dimetil Sloane ou P-D-M-S-P-D-M-S é um polímero viscoelástico que pode ser moldado para fornecer uma câmara adaptada aos requisitos experimentais.

Equilibre o PFD com o ar agitando um pequeno volume de PFD em uma garrafa cheia de ar. Isso também pode ser conseguido borbulhando ar através do PFD em seguida, decantando o PFD em uma placa de Petri aberta e flutuando uma muda inteira ou folha de extirpação no líquido por cinco minutos. O tecido deve se tornar translúcido, lembrando o tecido vitrificado.

As folhas podem parecer mais escuras ou mais claras do que antes da exposição ao PFD, dependendo das condições de iluminação e da idade do tecido usado. Finalmente, encha a câmara PDMS com PFD aero equacionado e transfira cuidadosamente as amostras de tecido da placa de Petri de incubação para a câmara PDMS. Sele o slide com uma tampa, deslizamento e imagem.

De acordo com os requisitos experimentais, as folhas de meses foram incubadas por cinco minutos em uma suspensão de proteína fluorescente verde recombinante ou GFP. Na PFD, a inspeção microscópica de amostras de folhas incubadas com PFD mostra que a maioria dos espaços aéreos é inundada com GFP recombinante suspensa em PFD. A GFP está em verde e o vermelho representa clorofila, fluorescência de loteria e delita células de preenchimento meso.

É evidente que a folha é inundada após a incubação com PFD, mas que bolsas ocasionais de ar podem permanecer A água não inunda a folha nessas condições. Aqui, uma folha de ópsia expressando Vênus, uma variante do YFP, que se localiza no citosol, é incubada e montada em varredura a laser de ar, água ou PFD. A microscopia confocal das amostras mostra uma vantagem do PFD sobre o ar e a água, com um aumento aproximado de duas vezes na profundidade da imagem.

Ao comparar PFD e água Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cinco a 10 minutos, se executada corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a delin periférica dissolve o esmalte e o Teflon, mas é compatível com a graxa de silicone. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o per fluro delin como meio de montagem para melhorar a imagem em células de folhas de plantas.

Não se esqueça de que, embora a delina por flúor não seja tóxica, recomendamos que práticas de segurança padrão sejam adotadas ao realizar este procedimento.