Name: Comparação quantitativa de Cis-Regulamentação elemento (CRE) Atividades em transgênicos Drosophila melanogaster /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprenda a medir atividades regulatórias de elementos cis-reguladores em Drosophila melanogaster usando linhagens transgênicas com microscopia confocal. Este método permite quantificar padrões de expressão gênica durante o desenvolvimento metamórfico.

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Agradecemos: Nicolas Gompel e Benjamim Prud&#39;homme por suas contribuições para o desenvolvimento deste protocolo; Melissa Williams e quatro revisores anônimos pelos comentários sobre o manuscrito; da Universidade de Dayton Graduate School para bolsas de pesquisa a guerra, e da Universidade de Dayton Biologia Departamento e Instituto de Pesquisa (UDRI) para apoio à investigação em TMW. Este trabalho foi financiado pela American Heart Association Grant 11BGIA7280000 a TMW.

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Não temos nada a revelar.

cis-regulatórias elementos codificar o programa de genômica que especifica padrões de expressão gênica e, assim, o processo de desenvolvimento 1, e são locais importantes para ambas as mutações subjacentes evolução morfológica 2-4 e variação fenotípica de traços humanos 5,6,19. Apesar desta importância, a lógica regulamentar para CREs continuam a ser mal compreendido. Uma razão importante para a compreensão desse déficit tem sido a falta de métodos adequados para comparar quanti...

comparação quantitativa de cis-regulamentação elemento (cre) atividades em transgênicos drosophila melanogaster</em

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Padrões de expressão gênica são especificados por cis-regulatórias elemento (CRE) seqüências, que são também chamados enhancers ou cis-regulatórias módulos. A CRE típico possui um arranjo de sítios de ligação para proteínas de transcrição vários fatores que conferem uma lógica de regulamentação especificando quando, onde e em que nível o gene regulado (s) é expressa. O conjunto completo de CREs dentro de um genoma animal codifica programa do organismo para o desenvolvimento de um, e empírica, bem como estudos teóricos indicam que mutações nos CREs desempenhou um papel proeminente na evolução morfológica 2-4. Além disso, estudos do genoma humano largo da associação indicam que a variação genética nas CREs contribuir substancialmente para a variação fenotípica 5,6. Assim, a compreensão da lógica de regulação e como as mutações afetam essa lógica é um objectivo central da genética. Transgenes repórter fornecer um método poderoso para estudar a função in vivoção de CREs. Aqui, um conhecido ou suspeito seqüência CRE é acoplado ao promotor heterólogo e seqüências que codificam um gene repórter que codifica para uma proteína de produtos facilmente observáveis. Quando um repórter transgene é inserido em um organismo hospedeiro, a actividade do CRE se torna visível na forma da proteína codificada repórter. P-elemento transgênese mediada na mosca da fruta Drosophila espécies (D.) melanogaster 7 tem sido usada há décadas para introduzir transgenes repórter para este organismo modelo, embora a colocação de genômica de transgenes é aleatória. Assim, a atividade do gene repórter é fortemente influenciada pela cromatina local e do ambiente gene, limitando comparações CRE para ser qualitativa. Nos últimos anos, o sistema de integração baseado phiC31 foi adaptado para uso em D. melanogaster para inserir transgenes em sítios específicos do genoma 10/08 pouso. Esta capacidade fez a medição quantitativa do gene e, relevante aqui, a atividade CRE 13/11 feasible. A produção de moscas de frutas transgênicas podem ser terceirizados, incluindo phiC31 integração baseada, eliminando a necessidade de comprar equipamentos caros e / ou ter proficiência em protocolos de injeção especializados transgene. Aqui, apresentamos um protocolo geral para avaliar quantitativamente uma atividade CRE, e mostrar como essa abordagem pode ser usada para medir os efeitos de uma mutação introduzida em uma atividade CRE e comparar as atividades das CREs ortólogos. Embora os exemplos dados são de um ativo CRE durante a metamorfose de frutas voar, a abordagem pode ser aplicada a outros estágios de desenvolvimento, as espécies de mosca da fruta, ou organismos modelo. Em última análise, uma utilização mais generalizada desta abordagem para CREs estudo deve avançar a compreensão da lógica de regulação e como a lógica pode variar e evoluir.

Variação fenotípica para características podem resultar de mutações em cis-regulatórias elemento (CRE) seqüências que controlam os padrões de expressão gênica. Métodos derivados para uso em Drosophila melanogaster pode comparar quantitativamente os níveis de padrões espaciais e temporais de expressão genética mediada por variantes modificadas ou que ocorre naturalmente CRE.

Comparação quantitativa de Cis-Regulamentação elemento (CRE) Atividades em transgênicos Drosophila melanogaster</em

Os padrões de expressão gênica são especificados por sequências de elementos cis-regulatórios (CRE), também chamados de enhancers ou módulos cis-regulatórios. Um CRE típico...

O objetivo geral deste procedimento é medir quantitativamente as atividades reguladoras de genes em elementos reguladores CIS ou CREs ativos durante o desenvolvimento metamórfico de drosophila melan gastro. Inicie com métodos de integração em sítios específicos para gerar linhagens de CREs incorporados transgênicamente como transgenes repórter. Utilizando um microscópio estereoscópico, obtenha espécimes transgênicos do estágio de desenvolvimento correto.Remova os espécimes do pub externo e monte-os em um microscópio de vidro. Prossiga para registrar o nível e o padrão de expressão da proteína repórter fluorescente em amostras inteiras por meio de análise microscópica confocal. Por fim, quantifique o nível de expressão da proteína repórter fluorescente nas imagens confocais registradas utilizando a ferramenta de software Image J.Esses resultados atribuem um nível de atividade regulatória gênica ao elemento regulatório auxiliar e facilitam estudos comparativos adicionais de expressão gênica em versões modificadas de CRE. Este procedimento pode ajudar a responder perguntas fundamentais e interessa-se pela regulação gênica e por como essa regulação gênica é codificada. O DNA interessa-

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Biology

Biologia

Este protocolo descreve uma maneira simples e barata para quantificar a atividade de cis-regulatórias elementos (ie, enhancer / promotores) na vida retinas do mouse via eletroporação explante. Preparação de DNA, a dissecção da retina, eletroporação, a cultura de explantes de retina, e pós-fixação análise e quantificação são descritos.

Quantificar a atividade de Cis Elements-Regulação na retina do rato por Eletroporação Remoção

Drosophila melanogaster é um excelente organismo modelo para estudar o sistema imunológico inato e as consequências fisiológicas de infecções e doenças. Este protocolo descreve como fornecer infecções bacterianas robustas e quantitativamente repetíveis a D. melanogaster e como medir subsequentemente a gravidade da infecção e quantificar a resposta imune do hospedeiro.

Infecção bacteriana sistêmica e Imune Defesa Phenotypes em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Neste trabalho, fornecemos um fluxo de trabalho experimental de como os intensificadores ativos podem ser identificados e validados experimentalmente.

Previsão e Validação de elementos reguladores de genes ativada durante ácido retinóico induzida estaminais embrionárias Diferenciação Celular

Este protocolo demonstra como gerar tumores clonais fluorescente marcada, geneticamente definidas no Drosophila olho / discos imaginais antenares (DAE). Ele descreve como dissecar o EAD e do cérebro a partir do terceiro larvas e como processá-los para visualizar e quantificar as mudanças de expressão gênica e invasão tumoral.

o<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

Regulamento do ambiente da cromatina é um processo essencial, necessário para a expressão do gene apropriado. Aqui, descrevemos um método para controlar a expressão do gene através do recrutamento de cromatina-modificando máquinas de forma gene-específico e reversível.

Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

Apresentamos um protocolo para um ensaio colorirétrico da atividade de sintese de citrato para quantificação de massa mitocondrial intacta no tecido Drosophila homogeneia.

Um ensaio colorimétrico da atividade de sinteta de citrato em Drosophila Melanogaster

Este artigo descreve um protocolo detalhado para o uso da enzima Cas13D com destino a RNA (RfxCas13D) em moscas.

RNA onipresente e específico para tecidos em Drosophila Melanogaster usando CRISPR/CasRx

Este artigo toma como exemplo a transgênese mediada por integrase phiC31 em Drosophila e apresenta um protocolo otimizado para microinjeção de embriões, uma etapa crucial para a criação de moscas transgênicas.

Microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila

Este protocolo fornece um pipeline computacional simplificado para quantificar transcritos de intensificadores nascentes. Ao integrar a acessibilidade da cromatina, a característica da cromatina e os dados transcricionais, ele permite a detecção precisa e a análise específica da atividade do intensificador em regiões intragênicas complexas, mantendo-se acessível a pesquisadores sem treinamento extensivo em bioinformática.

Um pipeline computacional para quantificação de RNA intensificador intergênico/intragênico em células-tronco embrionárias de camundongo

Neste artigo vamos demonstrar como dissecar o sistema nervoso central do terceiro instar as larvas Drosophila.

Dissecção do CNS Larval em Drosophila melanogaster

Aprenda a medir atividades regulatórias de elementos cis-reguladores em Drosophila melanogaster usando linhagens transgênicas com microscopia confocal. Este método permite quantificar padrões de expressão gênica durante o desenvolvimento metamórfico.

Comparação quantitativa de Cis-Regulamentação elemento (CRE) Atividades em transgênicos Drosophila melanogaster

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