Comparação quantitativa de Cis-Regulamentação elemento (CRE) Atividades em transgênicos Drosophila melanogaster

O objetivo geral deste procedimento é medir quantitativamente as atividades regulatórias gênicas dos elementos reguladores do CIS ou CRE ativo durante o desenvolvimento gastrometamórfico da drosophila melan. Comece com métodos de integração específicos do local para gerar linhas de CREs Transgenicamente Incorporadas como transgenes repórteres. Usando um microscópio estereoscópico, obtenha amostras transgênicas do estágio de desenvolvimento correto.

Remova as amostras do pub externo e monte-as em um microscópio de vidro. Deslize para registrar o nível e o padrão de expressão da proteína repórter fluorescente em amostras de montagem inteira por análise microscópica confocal. Finalmente, quantifique o nível de expressão da proteína repórter fluorescente para imagens confocais gravadas usando a ferramenta de software Image J.

Esses resultados atribuem um nível de atividade regulatória gênica para auxiliar o elemento regulador e facilitar novos estudos comparativos de expressão gênica em versões modificadas de CRE. Este procedimento pode ajudar a responder a perguntas-chave e se sentir interessado na regulação do gene e em como essa regulação do gene está codificando. O DNA parece biologia evolutiva e de desenvolvimento.

Este procedimento foi desenvolvido para fornecer informações sobre os elementos reguladores cis que funcionam durante o desenvolvimento metamórfico da drosophila melanogaster. Em princípio, no entanto, pode ser aplicado a elementos reguladores cis que funcionam durante outros estágios de desenvolvimento e outras espécies de moscas da fruta, ou mesmo outros organismos modelo. Para expandir as linhas transgênicas, instale dois frascos com várias moscas machos e fêmeas em dias alternados.

Transfira as moscas de um dos frascos para injetáveis para um novo frasco. Repita isso por uma semana. Ao final de duas semanas, verifique se as moscas-das-frutas transgênicas variam de estágios de desenvolvimento larval a adulto.

Comece a preparar os espécimes no final do estágio larval do terceiro ínstar, quando o RE é formado. Observe que a amostra não é móvel. O ER é branco amolecido e as esféricas evitaram especificar este ponto de tempo.

Como zero HAPF. Distinguiu machos de fêmeas pela presença de gônadas situadas bilateralmente perto do ponto médio do corpo que aparecem como círculos translúcidos para estadiamento com base no comprimento da metamorfose. Em zero HAPF, transfira as amostras para um frasco fresco usando um pincel umedecido.

Adicione um pedaço de lenço umedecido e umedeça com água para evitar que os espécimes sequem. Agora, incube o frasco a 25 graus Celsius até o HAPF desejado. Alternativamente, espécimes de estágio por classificação com base na identificação da presença e posição de vários marcadores morfológicos, conforme detalhado no texto anexo.

Com fita adesiva de laboratório, cole um pedaço de fita adesiva em uma placa de dissecação com a superfície da fita adesiva voltada para cima. Molhe um pincel e aplique umidade nas amostras com um pincel. Transfira as amostras para um lenço umedecido.

Transfira as amostras para a fita adesiva e adira com a superfície dorsal voltada para cima. Deixe as amostras secarem por 15 minutos. Abra progressivamente o pronto-socorro usando uma pinça.

Comece na extremidade anterior ou permanente e prossiga em direção à extremidade posterior. Em seguida, transfira pui para uma gota de óleo viscoso em uma lâmina de microscópio e avalie a amostra microscopicamente para amostras de montagem inteira. Use o Forex ou o objetivo 10 x para colocar o espécime em foco.

Usando o software do microscópio confocal, ajuste o comprimento de onda de excitação para a proteína fluorescente desejada para evitar o fotobranqueamento. Comece com uma intensidade de laser de cinco a 10%Se o sinal estiver abaixo do esperado, aumente a intensidade conforme necessário para melhorar a relação sinal-ruído. Para imagens confocais, ative as configurações de software que calculam a média das medições de pixels de varreduras replicadas, como a média de kalman para comparações quantitativas da atividade CRE, usa cesariana onde a fluorescência parece mais intensa.

Mude para uma tabela de pesquisa de aviso de saturação e ajuste o ganho e o deslocamento da tensão do canal para configurações em que poucos pixels estão saturados. Se necessário, ajuste a abertura confocal. Depois que as configurações ideais forem determinadas, execute a varredura ZS para obter uma série de imagens ao longo do eixo Z.

Quando a digitalização estiver concluída, converta a pilha de imagens em uma projeção e salve este arquivo de imagem no formato TIF. Para comparação quantitativa das atividades CRE, use as mesmas configurações confocais para todas as amostras replicadas e linhas de transgene repórter. Para o experimento com o programa Image J iniciado abra uma imagem TIFF a ser avaliada.

Clique no botão de seleção à mão livre e contorne a área da amostra onde a quantificação é desejada. Para obter uma estatística de valor de pixel, clique na guia analisar e selecione medir. Registre a pontuação média do valor do pixel na caixa de resultados.

Colete também um segundo valor médio de pixel de uma região de fundo onde o CRE não está ativo. Para derivar um valor médio de pixel ajustado, continue a gerar estatísticas de valor de pixel para espécimes replicados. Em seguida, a partir dos valores médios de pixel ajustados pela réplica, determine a atividade regulatória média para A CRE e também calcule o erro padrão da média.

Este experimento usa a intensidade do fenótipo do olho de resgate branco para tornar as linhas transgênicas homozigóticas. Um fundo genético mutante de gene branco com uma sequência de local de pouso A TTP é utilizado para integração de transgenes específicos do local. Indivíduos transgênicos, hemizigotos e homozigotos para o vetor integrado são distinguidos pela intensidade do fenótipo da cor dos olhos resgatados pelo número de cópias do gene mini branco integrado.

As linhas homozigóticas são então estabelecidas pelo cruzamento de moscas machos e fêmeas com o fenótipo de cor dos olhos mais escuro. Marcadores morfológicos são usados para determinar o estágio metamórfico da drosófila durante a metamorfose de larva em mosca-da-fruta adulta. O espécime transita por uma série de morfologias estereotipadas que podem ser usadas para determinar o sexo e aproximar o estágio de desenvolvimento. Aqui.

Uma versão de tipo selvagem de A CRE, conhecida como elemento dimórfico, conduz a altos níveis de expressão do repórter EGFP no segmento abdominal ASIC da fêmea puy. Uma sequência de 13 pares de bases dentro deste CRE foi considerada um local de ligação para o fator de transcrição DSX e a importância in vivo dessa sequência é demonstrada quantificando a atividade regulatória para o CRE quando este local de ligação é mutado. Análises quantitativas indicam que a mutação deste sítio DSX reduziu a atividade regulatória para 28 mais ou menos 3% da expressão do tipo selvagem no contexto do local de inserção do transgene usado aqui.

Comparações semelhantes avaliam atividades regulatórias para alelos CRE intraespecíficos ou entre CREs autólogos de espécies separadas, por exemplo, em comparação com os níveis de EGFP no segmento feminino. A seis impulsionados pela cepa G Melin gástrica Canin S, CREs autólogos para as espécies D estimulantes e D willi possuem atividades regulatórias iguais a 75 mais ou menos 4% e zero mais ou menos 0%, respectivamente. Os seguintes métodos de procedimento, como interferência de RNA, podem ser usados com genes de fatores de transcrição para responder a perguntas adicionais sobre como esses genes de fatores de transcrição interagem com os elementos reguladores do CYS.

Isso seria indicado pelo aumento e diminuição da expressão da proteína repórter fluorescente que são impulsionados por elementos reguladores do CIS após seu desenvolvimento. Este procedimento abriu caminho para pesquisadores no campo da regulação gênica explorarem a importância funcional que os motivos dos elementos reguladores cis e as mutações evoluídas têm sobre a expressão gênica.