Usando genética reversa para manipular o NSS Gene do vírus da febre Rift Valley MP-12 Strain para melhorar a segurança e eficácia da vacina

Este procedimento gera cepa MP 12 do vírus da febre do vale do rift recombinante que codifica o NSS mutado por genética reversa e visa caracterizar os fenótipos para o desenvolvimento de vacinas. Primeiro, usando um sistema de transfecção em Bhk T sete nove células, que expressam de forma estável T sete RNA polimerase, recuperam mutantes de cepa MP 12 recombinante, em seguida, amplificam o mutante de cepa MP 12 recombinante recuperado em Vero E seis células e titulam os mutantes MP 12 amplificados por ensaio de placa. A etapa final do procedimento é rastrear a falta de supressão de interferon, alfa ou beta por proteínas NS mutantes.

Em última análise, os resultados podem facilitar a preparação de uma vacina viva atenuada candidata para a febre do Vale do Rift por meio de um sistema de genética reversa. A principal vantagem desta técnica sobre o método existente, como a introdução aleatória de mutação no genoma viral usando nitrogênio químico ou passagem serial, é a capacidade de introduzir a mutação de designação no genoma viral usando o sistema gênico. Este método pode ajudar a abordar questões-chave no campo das vacinas contra a febre do vale, como a importância do fator principal NSS na imunogenicidade das vacinas candidatas.

Em geral, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque o vírus da febre da água rápida, como em blocos de alvo de forma e visualização de blocos, exigiu uma técnica otimizada. A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas de recuperação viral e hidratação são difíceis de aprender porque o protocolo passo a passo para este método não foi relatado. Usando pratos de seis centímetros, coloque as células renais T sete nove de hamster bebê, que expressam de forma estável a RNA polimerase T sete e coloque uma incubadora a 70 a 80% Meio de mudança de fluência celular para completar o MEM alfa sem higromicina B. Dentro de uma hora, inicie o processo de transfecção para recuperação do vírus da febre do vale do rift.

Crie um conjunto de plasmídeos que codificam RNAs genômicos virais para expressão de RNA viral de comprimento total e um segundo conjunto que codifica quadros de leitura abertos de genes virais para expressão de proteínas virais. Agora adicione 30 microlitros de trânsito LT um a 385 microlitros de Optum em um tubo de 1,5 mililitro. Vortex brevemente e incubar por cinco minutos.

À temperatura ambiente, adicione lentamente os lipossomas resultantes aos conjuntos de plasmídeos de 10 microgramas misturados suavemente por pipetagem e incube por 15 minutos à temperatura ambiente gota a gota, adicione a mistura de transfecção a bhk T sete nove células e incube por 24 horas. Substitua o sobrenadante da cultura por alfa MEM completo e cultura por mais quatro dias. Colher os sobrenadantes da cultura num tubo de 50 mililitros e remover os restos celulares por centrifugação.

Agora Eloqua os sobrenadantes em tubos criogênicos de cinco mililitros com tampa de rosca e armazene essa passagem. Zero estoque de vírus a menos 80 graus Celsius para facilitar os experimentos a jusante. Amplificar o vírus P zero em células sem genes interferon alfa e beta crescer 80% confluente Vero E seis culturas em DMEM completo, substituir o meio pelo vírus P zero diluído e incubar por uma hora.

Remover o inóculo e cultivar em 10 mililitros de DMEM completo durante três a quatro dias até que o efeito citopático das células Vero E seis se torne evidente. Colha o sobrenadante conforme descrito anteriormente e designe as amostras como E seis P um usando seis placas de poços para cultivar Vero E seis células até 80% de fluência em DMEM completo. Aspire o meio das seis células Vero E e adicione 400 microlitros de diluições seriais dez vezes da preparação do vírus E seis P uma incubação por uma hora.

Enquanto isso, prepare dois tubos de 15 mililitros para o tubo de revestimento de ágar. A contendo sete mililitros de ágar 1,2% nobre em água e dois B contendo sete mililitros de dois x MEM completo e 10% de caldo de fosfato de dose de viagem após 15 minutos nos banhos-maria, decantar o tubo B no tubo A e usar uma pipeta para misturá-los. Substitua o inóculo viral por dois mililitros por poço de uma mistura um-para-um de tubos A e B.Continue a cultivar células por três a quatro dias.

Prepare a cobertura do sem-fim adicionando 1,2% de ágar nobre, dois x MEM completo e vermelho neutro ao tubo A a B e um terceiro tubo rotulado como vermelho neutro, coloque o tubo A em um banho-maria de 42 graus Celsius e os outros dois tubos em um banho-maria de 37 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, misture sete mililitros do tubo A, sete mililitros do tubo B e 0,5 mililitros de alíquota vermelha neutra, dois mililitros da mistura em cada poço de uma placa de seis poços e incube a placa durante a noite. Agora determine o número de unidades de plataforma por mililitro C 57 fibroblastos embrionários de camundongos de tipo selvagem codificam um gene de fosfatase alcalina embrionária secretada induzível por NF kappa B e IRF três ou sete.

Aqui, analisamos a atividade de infiltração induzida por respostas imunes inatas infectando células subcofluentes em placas de 12 poços com MP 12 recombinante codificando mutações NS ou controle MP 12 e incubamos por uma hora. Remova o inóculo, adicione um mililitro por poço de DMEM completo e cultive por 14 horas. Colha sobrenadantes de cultura para um ensaio de infiltração em cada poço de uma placa de 96 poços, adicione 200 microlitros de azul quântico e adicione 50 microlitros de cada selo de amostra e incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora.

Meça o diâmetro externo em 650 nanômetros usando um leitor de placas. O vírus da febre do Vale do Rift tem um genoma de RNA de sentido negativo tripartido denominado segmento SM e L em comparação com NSS da cepa MP 12. O quadro de leitura aberto do tipo C 13 é truncado em 69%Normalmente, o sistema genético reverso gera vírus MP 12 recombinantes viáveis com títulos superiores a um vezes 10 elevado a seis PFU por mililitro de vírus do tipo C 13.

A falta de funções de N forma grandes placas turídeas, enquanto a MP 12 formou placas transparentes de vários tamanhos em comparação com células infectadas simuladas em 14 horas. Pós-infecção. As células de metanfetamina do tipo selvagem C 57 infectadas com MP 12 não aumentam o nível de infiltração na cultura.

Sobrenadante, por outro lado, a infecção do tipo C 13 induz um nível aumentado de infiltração em 14 horas após a infecção, os northern blots usando uma sonda de RNA específica para o mRNA ISG 56 de camundongo confirmam a regulação positiva do mRNA ISG 56 na ausência de expressão de N'S. Seguir este procedimento como um método como imunização em camundongos e teste de neutralização do anticorpo pode interrogar questões como imunogenicidade do mutante NSS. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de febre do vale explorarem as funções gênicas não estruturais em células e animais infectados.

Não se esqueça de que trabalhar com vírus infecciosos pode ser extremamente perigoso, portanto, sempre tome precauções para evitar. Inale AOLs. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como recuperar e titular cepas MP 12 recombinantes e como rastrear mutantes NSS sem função de supressão de interferon alfa beta.