Name: Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: Aprenda a medir a entrada de cálcio operada por reservas em células vivas usando indicadores fluorescentes. Este método permite estudar dinâmicas de cálcio em células cancerosas e fibras musculares esqueléticas com resolução temporal e espacial.

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Agradecemos ao Dr. Noé Weisleder para leitura e edição deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela Research Grants UMDNJ Fundação 62-09 de ZP, American Heart Association SDG2630086 a XZ, 0535555N a MB, e National Institutes of Health RC2AR058962-01 a MB.

<ol><li>Parekh, A. B., Putney, J. W. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Store-operated calcium channels.</a> Physiol. Rev. 85, 757-810 (2005).</li>
<li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+activation+of+store-operated+calcium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Retrograde activation of store-operated calcium channel.</a> Cell Calcium. 33, 375-384 (2003).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORAI1+and+STIM1+deficiency+in+human+and+mice%3A+roles+of+store-operated+Ca2%2B+entry+in+the+immune+system+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">ORAI1 and STIM1 deficiency in human and mice: roles of store-operated Ca2+ entry in the immune system and beyond.</a> Immunol. Rev. 231, 189-209 (2009).</li>
<li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+CRAC+channels%3A+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li>
<li>Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+store-operated+calcium+channel+in+muscle+cells+lacking+mg29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of store-operated calcium channel in muscle cells lacking mg29.</a> Nat. Cell Biol. 4, 379-383 (2002).</li>
<li>Shin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retrograde+signal+from+calsequestrin+for+the+regulation+of+store-operated+Ca2%2B+entry+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A retrograde signal from calsequestrin for the regulation of store-operated Ca2+ entry in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 278, 3286-3292 (2003).</li>
<li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctional+membrane+structure+and+store+operated+calcium+entry+in+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Junctional membrane structure and store operated calcium entry in muscle cells.</a> Front Biosci. 8, d242-d255 (2003).</li>
<li>Pan, Z., Damron, D., Nieminen, A. L., Bhat, M. B., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+intracellular+Ca2%2B+by+caffeine+and+ryanodine+induces+apoptosis+of+chinese+hamster+ovary+cells+transfected+with+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Depletion of intracellular Ca2+ by caffeine and ryanodine induces apoptosis of chinese hamster ovary cells transfected with ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 275, 19978-19984 (2000).</li>
<li>Hirata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+store-operated+Ca2%2B+entry+and+altered+Ca2%2B+release+from+sarcoplasmic+reticulum+through+silencing+of+junctophilin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Uncoupling store-operated Ca2+ entry and altered Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum through silencing of junctophilin genes.</a> Biophys. J. 90, 4418-4427 (2006).</li>
<li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol. Genomics. 23, 72-78 (2005).</li>
<li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azumolene+inhibits+a+component+of+store-operated+calcium+entry+coupled+to+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Azumolene inhibits a component of store-operated calcium entry coupled to the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 281, 33477-33486 (2006).</li>
<li>Launikonis, B. S., Barnes, M., Stephenson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+coupling+between+skeletal+muscle+store-operated+Ca2%2B+entry+and+the+inositol+trisphosphate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of the coupling between skeletal muscle store-operated Ca2+ entry and the inositol trisphosphate receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2941-2944 (2003).</li>
<li>Shuttleworth, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+relationships+between+Ca2%2B+store+mobilization+and+Ca2%2B+entry+in+an+exocrine+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Calcium%22%5BJournal%5D)">Temporal relationships between Ca2+ store mobilization and Ca2+ entry in an exocrine cell.</a> Cell. Calcium. 15, 457-466 (1994).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Embora os comprimentos de onda de excitação para Ca 2 +-binding e Ca 2 + livre Fura-2 são 340 nm e 380 nm, respectivamente, a gama dinâmica melhor proporção de Fura-2 para o Ca 2 + medição da concentração pode ocorrer em outros comprimentos de onda em particular um sistema de microscópio. Tais mudanças no comprimento de onda são geralmente devido a alterações no percurso óptico com a adição de vários componentes ópticos. Neste estudo, os comprimentos de onda de excitação para Fura-2 foram determinados como a 350 nm e 390 nm através da realização de análise espectral de Fura-2 fluorescência. A intracelular de Ca 2 + nível nos resultados do citosol a partir de uma balança de várias fontes, incluindo intracelular de Ca 2 + libertação, extracelular Ca 2 + entrada, bem como Ca 2 + mecanismo de exclusão na membrana ER e de plasma. Para isolar o unidireccional SOC mediada influxo de Ca 2 + intracelular de Ca 2 + libertação e Ca 2 + extrusion, o Mn 2 ensaio de têmpera + pode ser usado. Mn 2 + é conhecido por ser capaz de penetrar nas células por meio de SOCE mas é impermeável a extrusão superfície da membrana ou absorção ER por Ca 2 + bombas. Portanto, extinção de fluorescência representa uma medição de Mn unidireccional 2 + fluxo em células que estima o grau de activação de SOCE. Mn 2 + ensaio de têmpera é realizada no ponto isosbestic, no comprimento de onda, tais Fura-2 intensidade de fluorescência é independente de Ca 2 + concentração. O ponto de isosbestic para cada sistema deve ser determinada por varrimento do espectro. Alternativamente, Mn 2 têmpera + pode ser gravado por fluorescência corrigido em qualquer dois comprimentos de onda, de tal maneira que o valor final é independente da concentração de Ca 2 + 13. Para obter a informação espacial e temporal da atividade de SOCE nos músculos esqueléticos, que utilizou o método duplo-dye, que permite MeasureMe simultâneant de SOCE atividade e Ca 2 + SR conteúdo em pele de mamíferos adultos fibras musculares EDL. A correlação entre as mudanças na SR Ca 2 + atividade de conteúdo e SOCE podem ser plotados para indicar o limite de sensibilidade e de ativação SOCE ao esgotamento do Ca SR 2 + armazenamento. A solução TT-carregamento é otimizado para carregar adicionalmente túbulos T com Ca 2 + e para o condicionamento de túbulos T ea solução SR-carregamento foi projetado para promover a máxima SR Ca 2 + e de carga para carregar adicionalmente túbulos T com ~ 500 uM Ca 2 +. FCCP está incluído na solução de TT / SR-carregamento ea solução SR-empobrecimento de eliminar os efeitos da mitocôndria.

Tabela dos reagentes e equipamentos específicos: <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> 10-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Ham F-12 </td><td> Mediatech </td><td> 10-080-CV </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Prato fundo de vidro </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-14-C </td><td></td></tr><tr><td> Fura-2 PM </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F1221 </td><td> -20 ° C, a vedação estanque, protegido da luz, dissolvido em DMSO </td></tr><tr><td> Fluo-5N AM </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F14204 </td><td> -20 ° C, a vedação estanque, protegido de light </td></tr><tr><td> Rhod-5N </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> R14207 </td><td> -20 ° C, a vedação estanque, protegido da luz </td></tr><tr><td> Quartz Cuvette </td><td> Células Starna </td><td> 3-Q-10 </td><td></td></tr><tr><td> tapsigargina </td><td> Tocris </td><td> 1138 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Aminoethoxydiphenylborane (2-APB) </td><td> Tocris </td><td> 1224 </td><td></td></tr><tr><td> N-benzil-p-tolueno sulfonamida (BTS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 435600 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenase tipo I </td><td> Sigma </td><td> C0130 </td><td></td></tr></tbody></table> Equipamentos: <ol><li> Um espectrofluorímetro (Photon Technology International, NJ): xenon lâmpada de arco, controlada por computador de alta velocidade de acesso aleatório monocromador, célula-base de emissão monocromador, Nikon TE-200 fluorescência invertido Microscope, S Fluor objetivo óleo 40x/1.30, detectores PMT. </li><li> Laser Scanning microscópio confocal (BioRad Radiance2100): laser de argônio 453/477/488/514, laser HeNe 543nm, Nikon microscópio invertido TE2000, 60X objetivo (NA 1.4, óleo). </li><li> A estereomicroscópio com um poder de ampliação&gt; 100 (Zeiss Apo Stemi SV11). </li></ol>

fluorescência baseada em medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Loja operado Ca 2 + entrada (SOCE), anteriormente denominado capacitiva Ca 2 + entrada, é um mecanismo altamente regulado para influxo de Ca 2 + extracelular em células para repor empobrecido retículo endoplasmático (ER) ou retículo sarcoplasmático (SR) de Ca 2 + lojas 1,2. Uma vez que o Ca 2 + é um mensageiro ubíquo em segundo lugar, não é surpreendente verificar que SOCE desempenha papéis importantes numa variedade de processos celulares, incluindo transcrição proliferação, gene apoptose, e motilidade. Devido à sua ampla ocorrência em quase todos os tipos de células, incluindo células epiteliais e os músculos esqueléticos, esta via tem recebido grande interesse 3,4. No entanto, a heterogeneidade das características SOCE em diferentes tipos de células e da função fisiológica ainda não são claros 5-7. As propriedades funcionais do canal SOCE pode ser revelada por patch-clamp estudos, enquanto que uma grande corpo de conhecimento sobre thivia de s foi adquirida por fluorescência baseados intracelulares de Ca 2 + medições por causa de sua conveniência e viabilidade de high-throughput screening. O objetivo deste relatório é resumir alguns fluorescência baseados em métodos para medir a ativação de SOCE em monocamada de células, as células em suspensão e fibras musculares 5,8-10. Os mais comumente usados ​​os métodos de fluorescência é monitorar diretamente a dinâmica de Ca 2 + intracelular função da relação entre F e F 340nm 380nm (510 nm para a emissão de comprimento de onda) do Ca 2 + raciométrica indicador Fura-2. Para isolar a actividade de SOCE unidireccional a partir intracelular de Ca 2 + libertação e Ca 2 + extrusão, um Mn 2 ensaio de têmpera + é frequentemente utilizado. Mn 2 + é conhecido por ser capaz de penetrar nas células por meio de SOCE ao mesmo tempo que é impermeável à superfície da membrana processos de extrusão ou a absorção de ER por Ca 2 + bombas, devido à sua elevada afinidade with Fura-2. Como resultado, a supressão de Fura-2 fluorescência induzida pela entrada de Mn 2 + extracelular para dentro das células representa uma medição da actividade de SOCE 9. Medição raciométrica e os ensaios de Mn +2 têmpera pode ser realizada em um espectrofluorímetro cuvete baseada no modo de uma população de células ou em um sistema de microscópio-Based para visualizar células individuais. A vantagem de medições de célula única é que as células individuais submetidos a manipulações genéticas podem ser seleccionadas utilizando GFP ou repórteres RFP, permitindo que os estudos em células geneticamente modificadas ou mutantes. As características espaço-temporais de SOCE em estruturalmente especializado músculo esquelético pode ser conseguido nas fibras musculares pele por simultaneamente o controlo da fluorescência de duas baixa afinidade de Ca 2 + indicadores que permitam compartimentos específicos da fibra muscular, tais como Fluo-5N na SR e Rhod de 5N nos túbulos transversal 9,11,12.

A extensão da loja operado Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Entrada (SOCE) pode ser monitorizado utilizando fluorescente Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indicadores. Mn<sup&gt; 2 +</sup&gt; Extinção de tais indicadores SOCE ensaios em cultura de células e fibras musculares esqueléticas. Uma técnica que permita a resolução espacial e temporal da SOCE por imagem confocal de fibras musculares mecanicamente pelados também é descrito.

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

A entrada de Ca2+ operada por reservas (SOCE), anteriormente denominada entrada de Ca2+ capacitativa, é um mecanismo rigorosamente regulado para o influxo de Ca2+ extracelular para dentro das células para...

Este método experimental é utilizado para revelar as propriedades da entrada de cálcio regulada por reservatórios ou SOCE em células de câncer e músculo esquelético, utilizando métodos baseados em fluorescência. Isso é conseguido mediante a gravação da fluorescência do URA dois em células vivas, que é sensível à concentração intracelular de cálcio. Além disso, mede-se a taxa de extinção da fluorescência pela adição de manganês em comprimento de onda insensível à concentração de cálcio, o que reflete diretamente a ativação da SOCE para o estudo da SOCE.Em células musculares esqueléticas estruturalmente especializadas, os músculos são dissecados e descamados. As fibras musculares são preparadas. Em seguida, as fibras são tratadas com indicadores de cálcio de baixa afinidade e sua fluorescência interna é monitorada.Estes métodos demonstram que a entrada de cálcio mediada pelo esvaziamento de reservatórios (SOCE) existe tanto em células não excitáveis quanto em músculos esqueléticos, com ativação graduada e acoplamento estreito ao conteúdo das reservas intracelulares de cálcio. A principal vantagem dessa técnica baseada em fluoresceína em comparação com outros métodos, como eletrofisiologia e patch clamp, é sua facilidade de uso e aplicabilidade em estudos com populações celulares ou em triagens de alto rendimento. É importante utilizar o esterásio S adequado para o ambiente métrico ritual e o ensaio de mag coning.Portanto, a calibração de cada instrumento é crucial porque cada aparelho é diferente. A demonstração visual deste método é essencial, já que o processo mecânico de isolamento de fibras musculares individuais é difícil de aprender, pois exige treinamento prático especializado, compreensão aprofundada e aprendizado das técnicas de microdissecção, observação cuidadosa e muita paciência. Antes de iniciar, calibre a configuração do microscópio para a medição da fluorescência da URA dois. Embora os comprimentos de onda de excitação para a ligação de cálcio e para a URA dois sejam 340 e 380 nanômetros, a melhor faixa dinâmica de razão da URA dois para a medição de cálcio pode ocorrer em outros comprimentos de onda em um sistema microscópico específico.Essas alterações nos comprimentos de onda são devidas a mudanças no caminho óptico provocadas pelos diversos componentes ópticos adicionais. Da mesma forma, o ponto espástico ISO para cada sistema também varia. Portanto, é importante determinar esses comprimentos de onda por meio de varredura espectral.Alternativamente, a triagem Ming pode ser registrada por fluorescência em apenas dois comprimentos de onda de forma que o valor final seja independente da concentração de cálcio. Comece por transfectar culturas de células K Ys SE com plasmídeos que expressam RFP e que contêm, ou HRNA específico contra ou I um ou uma sequência scramble, por 48 horas. Cultive as células transfectadas em placas com fundo de vidro.Em seguida, remova o meio e lave as células com uma solução salina balanceada ou BSS. Após a lavagem, adicione um mililitro de BSS contendo dois micromolares de RA 2:00 AM e mantenha a placa a 37 graus Celsius por 40 minutos. Deixe as células à temperatura ambiente por 15 minutos para permitir que a forma intracelular de URA 2:00 AM se converta em URA dois.Em seguida, lave a placa duas vezes com BSS sob o microscópio. No modo de visualização, selecione as células que expressam RFP. Selecione o modo de razão de excitação com o comprimento de onda de emissão ajustado em 510 nanômetros e os comprimentos de onda de excitação em 350 e 390 nanômetros.A razão é exibida na terceira janela. Em seguida, registre. A fluorescência das células selecionadas nos comprimentos de onda predeterminados enquanto as células são perfundidas com quatro soluções diferentes.Da mesma forma, as células KYSE 150 são carregadas com ferra-2 e submetidas à gravação. No modo de razão de excitação, diferentemente do procedimento anterior, o ponto isobéstico de 360 nanômetros é escolhido como comprimento de onda de excitação. Em seguida, registram-se simultaneamente a fluorescência em 360 e 390 nanômetros enquanto as células são perfundidas com cinco soluções diferentes de BSS.Para este protocolo, células C2C12, uma linhagem celular miogênica de camundongo, devem ser cultivadas em placas com fundo de vidro até a confluência e, em seguida, diferenciadas em miotubos em meio de diferenciação contendo 2,5% de soro de cavalo. Carregue os miotubos C2C12 com uma concentração final de cinco micromolares de RA 2:00 AM em solução BSS e incube-os por 40 minutos. Em seguida, adicione uma concentração final de 20 micromolares de benzo p tolueno smida ou BTS para inibir as contrações musculares e os artefatos de movimento por elas causados.Incube as células por 15 minutos à temperatura ambiente e mantenha a solução BTS em todas as soluções. Em seguida, carregue quatro. Equilibre as soluções salinas no sistema de perfusão.Conforme descrito anteriormente. Durante cada perfusão, registre a fluorescência de células selecionadas em 360 e 390 nanômetros. Nesta série, o magnésio e a tapa-argenina são aplicados em conjunto para monitorar o quenching por íons de magnésio.Enquanto as reservas de cálcio do retículo endoplasmático estão se esgotando. Para dissecar o músculo extensor do digito longo ou músculo EDL, posicione a perna de um camundongo eutanasiado lateralmente e remova a pele da região do tornozelo até o joelho. Corte as camadas musculares superficiais do tecido para expor o EDL e seccione os tendões superior e inferior para liberar o músculo EDL intacto.É importante manter o comprimento dos tendões o mais longo possível. Agora, para evitar qualquer contração, transfira o EDL para uma solução T road contendo 0,1 milimolar de EGTA e sem cálcio sob um microscópio estereoscópico. Force a inserção dos tendões do joelho em duas metades e divida o músculo EDL em dois feixes.Repita o processo até obter oito feixes. Se tendões forem perdidos de algum feixe, descarte o feixe. Em seguida, segure ambos os tendões de uma tira de feixe de EDL e estique cuidadosamente a tira até que três ou quatro fibras musculares individuais permaneçam intactas, com tecido tendinoso em ambas as extremidades.Coloque uma gota de tampão Tyro sem cálcio em um recipiente de vidro com fundo de vidro. Coloque as tiras de EDL esticadas sobre o recipiente e remova rapidamente a maior quantidade possível de solução. Em seguida, prenda firmemente ambos os tendões usando fita adesiva impermeável.Lave a fibra primeiro com a solução livre de cálcio e, em seguida, duas vezes com uma solução de cálcio 2,5 milimolar. Se a fibra contrair excessivamente e forem observados danos, descarte a fibra, lave as fibras musculares saudáveis selecionadas três vezes com a solução de lavagem número um e, então, mergulhe-as na solução de permeabilização modificada semelhante ao meio intracelular por cinco minutos. Usando uma agulha de tungstênio presa a um suporte de alfinetes, permeabilize mecanicamente a fibra sob um microscópio estereoscópico; as fibras irão se resealar e aprisionar o corante conjugado com cálcio de cinco n na tubulação transversal.Obter fibras musculares isoladas saudáveis e intactas, ou pelo menos feixes desses tipos de fibras que ainda tenham algum tendão ligado a elas, é, na minha opinião, uma das etapas mais desafiadoras, seguida pela transferência sempre muito difícil dessas fibras para a câmara experimental final. Durante esse processo, as fibras podem contrair-se excessivamente ou até mesmo se romper. Portanto, se você tiver fibras saudáveis, o procedimento mecânico de esfoliação em si será muito mais fácil para carregar o SR. Incube as fibras e a solução esfoliante com 20 micromolar flow five N am.Após a incubação, realize lavagens extensivas com a solução de lavagem número dois e uma incubação adicional de 30 minutos para permitir a desesterificação completa do corante. As fibras podem então ser visualizadas utilizando um microscópio confocal com objetivo de 60 x em regiões de interesse. Registre simultaneamente a fluorescência de cada corante enquanto a fibra é perfundida com soluções de carregamento e esgotamento de SR.A atividade de SOCE em células KYS, SE uma 50 foi examinada utilizando a medição de cálcio intracelular. As células foram cotransfectadas com RFP e um RNA de interferência curto contra o gene OR I um, que codifica o canal A-S-O-C-E, em comparação com controles representados pelo traço preto. A supressão da expressão de I um resultou em diminuição da atividade de SOCE. A SOCE em células KYC um 50 também foi confirmada com o ensaio de extinção por manganês. Após a completa exaustão dos estoques de cálcio do retículo endoplasmático por TG, a perfusão de manganês resultou em uma diminuição significativa da fluorescência.A inclinação mais acentuada da perda do sinal URA indica uma SOCE mais ativa. Assim, a diminuição lenta da fluorescência em células tratadas com dois A PB indica que a atividade da SOCE foi bloqueada por este composto. As taxas de extinção por manganês foram determinadas a partir dos 10 segundos iniciais, em que a extinção ainda estava na faixa linear sem saturação; um ensaio semelhante de extinção por manganês foi realizado em células musculares cultivadas.Neste caso, o manganês foi aplicado juntamente com o TG. Enquanto o TG esvaziava os estoques de cálcio do retículo sarcoplasmático, a inclinação do quenching fluorescente mudou gradualmente até atingir sua taxa máxima. A curva sigmoide indicou a ativação graduada da SOCE nessas condições experimentais.Na imagem confocal, o aprisionamento de fibras desprotegidas com road five e die no compartimento TT mostrou o padrão característico de duplo pico dos mamíferos, conforme observado no canal vermelho. Após o carregamento do retículo sarcoplasmático (SR) com flow five NM, o padrão pontuado típico do SR tornou-se visível no canal verde após a perfusão da fibra desprotegida com a solução de carregamento TTSR; a intensidade de fluorescência de ambos, road five N e flow five n, aumentou após a perfusão com a solução de esgotamento do SR. Os níveis de fluorescência nos compartimentos do SR e do TT começaram a diminuir, o que indicou haver acoplamento entre o esgotamento das reservas de cálcio do SR e a ativação da SOCE, respectivamente.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão muito clara de como obter fibras musculares viáveis, saudáveis e intactas. Elas precisam ter quantidade suficiente de tendão em suas extremidades para permitir um processo de dissecção eficaz, o que, em última instância, permitirá ao pesquisador obter um preparado fisiologicamente relevante com uma vantagem incrível. Não se esqueça de que todos os corantes fluorescentes utilizados neste estudo são geralmente sensíveis à luz, e precauções, como o carregamento em placas escuras e as lavagens em câmara escura, devem ser sempre adotadas durante a realização deste procedimento.O domínio dessa técnica pode ser alcançado em algumas horas. O que sugerimos é que vários fibras intactas sejam obtidas inicialmente, o que permite uma porcentagem maior de sucesso nos passos mecânicos de dissecção fina, além de possibilitar o cultivo dessas fibras durante a noite após seu isolamento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de sinalização de cálcio explorarem o papel da entrada de cálcio regulada por reservatórios no crescimento e na morte de células cancerígenas.A função fisiológica e patológica no músculo.

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Biologia

Nós apresentamos um método para isolar rápido eventos (microssegundo) cálcio dos fluxos mais lento em células vivas usando laser microscopia confocal. O método mede as flutuações de intensidade de fluorescência de indicadores de cálcio através dos exames de gravação de linha de várias centenas de pixels em uma célula. Análise de histograma nos permite isolar as escalas de tempo de fluxos de cálcio diferentes.

Fluxos de medição de cálcio rápido no Cardiomyocytes

Fonte: Heredia, D. J., et. al. Imagem ex vivo da sinalização de cálcio específica da célula na sinapse tripartida do diafragma do camundongo. J. Vis. exp.}} (2018) Este vídeo demonstra imagens de fluorescência Caracterização da dinâmica do cálcio nas junções neuromusculares (NMJs) em um camundongo transgênico que expressa indicadores de cálcio geneticamente codificados. Um NJM é identificado por receptores de acetilcolina marcados com fluorescência no diafragma com o nervo frênico. Um divisor...

Imagem de fluorescência da dinâmica do cálcio nas junções neuromusculares no diafragma de um camundongo transgênico

Descrito aqui é um método para medir diretamente faíscas de cálcio, as unidades elementares de Ca 2 + liberação de retículo sarcoplasmático em fibras musculares esqueléticas intactas. Este método utiliza osmótica mediada por estresse disparo de Ca 2 + liberação do receptor rianodina nas fibras musculares isoladas. A dinâmica ea capacidade homeostática de Ca 2 + intracelular de sinalização pode ser empregada para avaliar a função do músculo na saúde e na doença.

Avaliação do cálcio Faíscas intactas fibras musculares esqueléticas

Atualmente, a maioria dos indicadores de cálcio disponíveis são usados para quantificar transientes citoplasmáticos de cálcio como medidas indiretas de cálcio liberado do retículo sarcoplasmático em células musculares lisas cultivadas. Este protocolo descreve o uso de um indicador específico baseado em FRET que permite a medição direta de sinais de cálcio dentro do lúmen do retículo sarcoplasmático.

Medição das flutuações cálcio dentro do Sarcoplasmic retículo de células musculares lisas cultivadas utilizando FRET baseado em imagem confocal

As mitocôndrias pode utilizar o potencial electroquímico através da membrana seu interior (Δ Ψm) para sequestrar cálcio (Ca2 +), o que lhes permite moldar citosólica de Ca 2+ de sinalização dentro da célula. Descreve-se um método para medir simultaneamente mitocôndrias Ca 2+ de fixação e ΔΨ m em células vivas utilizando corantes fluorescentes e microscopia confocal.

Medição simultânea de mitocondrial de cálcio e mitocondrial potencial de membrana em células vivas por Microscopia fluorescente

Aqui, descrevemos uma metodologia para obter uma população pura de mioblastos humanos a partir do tecido muscular adulto. Essas células são usadas para estudar a diferenciação do músculo esquelético in vitro e, em particular, para estudar proteínas envolvidas na sinalização de Ca 2+ .

Isolamento de mioblastos humanos, avaliação da diferenciação miogênica e medição de entrada de cálcio armazenada

Este método fornece uma maneira de acoplar optogenetics e de sensores genetically codificados do cálcio aos níveis citosónicos da imagem basal do cálcio e às mudanças em transientes evocados do cálcio nos músculos da parede do corpo do modelo C. elegansdo organismo.

In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

O presente artigo descreve a realização de uma abordagem de imagem intravital para observar a sinalização de cálcio induzida mecanicamente de osteócitos embutidos in vivo em tempo real em resposta à carga mecânica em nível de tecido do terceiro metatarso do camundongo.

Uma abordagem de imagem intravital fluorescente para estudar a dinâmica de sinalização de cálcio induzida por carga em osteócitos de camundongos

A fluorometria sítio-dirigida funcional é um método para estudar movimentos do domínio de proteínas em tempo real. A modificação desta técnica para sua aplicação em células nativas agora permite a detecção e rastreamento de movimentos de sensores de voltagem únicos a partir de canais de Ca2+ dependentes de voltagem em fibras musculares esqueléticas isoladas de murino.

Fluorometria Sítio-Dirigida Funcional em Células Nativas para Estudo da Excitabilidade do Músculo Esquelético

Este artigo apresenta um método para monitoramento quantitativo em tempo real das concentrações de íons cálcio (Ca2+) em células usando imagens de Ca2+ de célula única com o corante Fura-2/AM. Essa técnica permite o carregamento eficiente de corantes e o cálculo preciso dos níveis de Ca2+ por meio de taxas de intensidade de fluorescência, tornando-a uma abordagem simples e rápida para aplicações de pesquisa.

Imagem de cálcio de célula única para estudar a ativação de canais de íons de cálcio

Aprenda a medir a entrada de cálcio operada por reservas em células vivas usando indicadores fluorescentes. Este método permite estudar dinâmicas de cálcio em células cancerosas e fibras musculares esqueléticas com resolução temporal e espacial.

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética (Vídeo) | JoVE Journal

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

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