Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Este método experimental é utilizado para revelar as propriedades da entrada de cálcio regulada por reservatórios ou SOCE em células de câncer e músculo esquelético, utilizando métodos baseados em fluorescência. Isso é conseguido mediante a gravação da fluorescência do URA dois em células vivas, que é sensível à concentração intracelular de cálcio. Além disso, mede-se a taxa de extinção da fluorescência pela adição de manganês em comprimento de onda insensível à concentração de cálcio, o que reflete diretamente a ativação da SOCE para o estudo da SOCE.

Em células musculares esqueléticas estruturalmente especializadas, os músculos são dissecados e descamados. As fibras musculares são preparadas. Em seguida, as fibras são tratadas com indicadores de cálcio de baixa afinidade e sua fluorescência interna é monitorada.

Estes métodos demonstram que a entrada de cálcio mediada pelo esvaziamento de reservatórios (SOCE) existe tanto em células não excitáveis quanto em músculos esqueléticos, com ativação graduada e acoplamento estreito ao conteúdo das reservas intracelulares de cálcio. A principal vantagem dessa técnica baseada em fluoresceína em comparação com outros métodos, como eletrofisiologia e patch clamp, é sua facilidade de uso e aplicabilidade em estudos com populações celulares ou em triagens de alto rendimento. É importante utilizar o esterásio S adequado para o ambiente métrico ritual e o ensaio de mag coning.

Portanto, a calibração de cada instrumento é crucial porque cada aparelho é diferente. A demonstração visual deste método é essencial, já que o processo mecânico de isolamento de fibras musculares individuais é difícil de aprender, pois exige treinamento prático especializado, compreensão aprofundada e aprendizado das técnicas de microdissecção, observação cuidadosa e muita paciência. Antes de iniciar, calibre a configuração do microscópio para a medição da fluorescência da URA dois. Embora os comprimentos de onda de excitação para a ligação de cálcio e para a URA dois sejam 340 e 380 nanômetros, a melhor faixa dinâmica de razão da URA dois para a medição de cálcio pode ocorrer em outros comprimentos de onda em um sistema microscópico específico.

Essas alterações nos comprimentos de onda são devidas a mudanças no caminho óptico provocadas pelos diversos componentes ópticos adicionais. Da mesma forma, o ponto espástico ISO para cada sistema também varia. Portanto, é importante determinar esses comprimentos de onda por meio de varredura espectral.

Alternativamente, a triagem Ming pode ser registrada por fluorescência em apenas dois comprimentos de onda de forma que o valor final seja independente da concentração de cálcio. Comece por transfectar culturas de células K Ys SE com plasmídeos que expressam RFP e que contêm, ou HRNA específico contra ou I um ou uma sequência scramble, por 48 horas. Cultive as células transfectadas em placas com fundo de vidro.

Em seguida, remova o meio e lave as células com uma solução salina balanceada ou BSS. Após a lavagem, adicione um mililitro de BSS contendo dois micromolares de RA 2:00 AM e mantenha a placa a 37 graus Celsius por 40 minutos. Deixe as células à temperatura ambiente por 15 minutos para permitir que a forma intracelular de URA 2:00 AM se converta em URA dois.

Em seguida, lave a placa duas vezes com BSS sob o microscópio. No modo de visualização, selecione as células que expressam RFP. Selecione o modo de razão de excitação com o comprimento de onda de emissão ajustado em 510 nanômetros e os comprimentos de onda de excitação em 350 e 390 nanômetros.

A razão é exibida na terceira janela. Em seguida, registre. A fluorescência das células selecionadas nos comprimentos de onda predeterminados enquanto as células são perfundidas com quatro soluções diferentes.

Da mesma forma, as células KYSE 150 são carregadas com ferra-2 e submetidas à gravação. No modo de razão de excitação, diferentemente do procedimento anterior, o ponto isobéstico de 360 nanômetros é escolhido como comprimento de onda de excitação. Em seguida, registram-se simultaneamente a fluorescência em 360 e 390 nanômetros enquanto as células são perfundidas com cinco soluções diferentes de BSS.

Para este protocolo, células C2C12, uma linhagem celular miogênica de camundongo, devem ser cultivadas em placas com fundo de vidro até a confluência e, em seguida, diferenciadas em miotubos em meio de diferenciação contendo 2,5% de soro de cavalo. Carregue os miotubos C2C12 com uma concentração final de cinco micromolares de RA 2:00 AM em solução BSS e incube-os por 40 minutos. Em seguida, adicione uma concentração final de 20 micromolares de benzo p tolueno smida ou BTS para inibir as contrações musculares e os artefatos de movimento por elas causados.

Incube as células por 15 minutos à temperatura ambiente e mantenha a solução BTS em todas as soluções. Em seguida, carregue quatro. Equilibre as soluções salinas no sistema de perfusão.

Conforme descrito anteriormente. Durante cada perfusão, registre a fluorescência de células selecionadas em 360 e 390 nanômetros. Nesta série, o magnésio e a tapa-argenina são aplicados em conjunto para monitorar o quenching por íons de magnésio.

Enquanto as reservas de cálcio do retículo endoplasmático estão se esgotando. Para dissecar o músculo extensor do digito longo ou músculo EDL, posicione a perna de um camundongo eutanasiado lateralmente e remova a pele da região do tornozelo até o joelho. Corte as camadas musculares superficiais do tecido para expor o EDL e seccione os tendões superior e inferior para liberar o músculo EDL intacto.

É importante manter o comprimento dos tendões o mais longo possível. Agora, para evitar qualquer contração, transfira o EDL para uma solução T road contendo 0,1 milimolar de EGTA e sem cálcio sob um microscópio estereoscópico. Force a inserção dos tendões do joelho em duas metades e divida o músculo EDL em dois feixes.

Repita o processo até obter oito feixes. Se tendões forem perdidos de algum feixe, descarte o feixe. Em seguida, segure ambos os tendões de uma tira de feixe de EDL e estique cuidadosamente a tira até que três ou quatro fibras musculares individuais permaneçam intactas, com tecido tendinoso em ambas as extremidades.

Coloque uma gota de tampão Tyro sem cálcio em um recipiente de vidro com fundo de vidro. Coloque as tiras de EDL esticadas sobre o recipiente e remova rapidamente a maior quantidade possível de solução. Em seguida, prenda firmemente ambos os tendões usando fita adesiva impermeável.

Lave a fibra primeiro com a solução livre de cálcio e, em seguida, duas vezes com uma solução de cálcio 2,5 milimolar. Se a fibra contrair excessivamente e forem observados danos, descarte a fibra, lave as fibras musculares saudáveis selecionadas três vezes com a solução de lavagem número um e, então, mergulhe-as na solução de permeabilização modificada semelhante ao meio intracelular por cinco minutos. Usando uma agulha de tungstênio presa a um suporte de alfinetes, permeabilize mecanicamente a fibra sob um microscópio estereoscópico; as fibras irão se resealar e aprisionar o corante conjugado com cálcio de cinco n na tubulação transversal.

Obter fibras musculares isoladas saudáveis e intactas, ou pelo menos feixes desses tipos de fibras que ainda tenham algum tendão ligado a elas, é, na minha opinião, uma das etapas mais desafiadoras, seguida pela transferência sempre muito difícil dessas fibras para a câmara experimental final. Durante esse processo, as fibras podem contrair-se excessivamente ou até mesmo se romper. Portanto, se você tiver fibras saudáveis, o procedimento mecânico de esfoliação em si será muito mais fácil para carregar o SR. Incube as fibras e a solução esfoliante com 20 micromolar flow five N am.

Após a incubação, realize lavagens extensivas com a solução de lavagem número dois e uma incubação adicional de 30 minutos para permitir a desesterificação completa do corante. As fibras podem então ser visualizadas utilizando um microscópio confocal com objetivo de 60 x em regiões de interesse. Registre simultaneamente a fluorescência de cada corante enquanto a fibra é perfundida com soluções de carregamento e esgotamento de SR.

A atividade de SOCE em células KYS, SE uma 50 foi examinada utilizando a medição de cálcio intracelular. As células foram cotransfectadas com RFP e um RNA de interferência curto contra o gene OR I um, que codifica o canal A-S-O-C-E, em comparação com controles representados pelo traço preto. A supressão da expressão de I um resultou em diminuição da atividade de SOCE. A SOCE em células KYC um 50 também foi confirmada com o ensaio de extinção por manganês. Após a completa exaustão dos estoques de cálcio do retículo endoplasmático por TG, a perfusão de manganês resultou em uma diminuição significativa da fluorescência.

A inclinação mais acentuada da perda do sinal URA indica uma SOCE mais ativa. Assim, a diminuição lenta da fluorescência em células tratadas com dois A PB indica que a atividade da SOCE foi bloqueada por este composto. As taxas de extinção por manganês foram determinadas a partir dos 10 segundos iniciais, em que a extinção ainda estava na faixa linear sem saturação; um ensaio semelhante de extinção por manganês foi realizado em células musculares cultivadas.

Neste caso, o manganês foi aplicado juntamente com o TG. Enquanto o TG esvaziava os estoques de cálcio do retículo sarcoplasmático, a inclinação do quenching fluorescente mudou gradualmente até atingir sua taxa máxima. A curva sigmoide indicou a ativação graduada da SOCE nessas condições experimentais.

Na imagem confocal, o aprisionamento de fibras desprotegidas com road five e die no compartimento TT mostrou o padrão característico de duplo pico dos mamíferos, conforme observado no canal vermelho. Após o carregamento do retículo sarcoplasmático (SR) com flow five NM, o padrão pontuado típico do SR tornou-se visível no canal verde após a perfusão da fibra desprotegida com a solução de carregamento TTSR; a intensidade de fluorescência de ambos, road five N e flow five n, aumentou após a perfusão com a solução de esgotamento do SR. Os níveis de fluorescência nos compartimentos do SR e do TT começaram a diminuir, o que indicou haver acoplamento entre o esgotamento das reservas de cálcio do SR e a ativação da SOCE, respectivamente.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão muito clara de como obter fibras musculares viáveis, saudáveis e intactas. Elas precisam ter quantidade suficiente de tendão em suas extremidades para permitir um processo de dissecção eficaz, o que, em última instância, permitirá ao pesquisador obter um preparado fisiologicamente relevante com uma vantagem incrível. Não se esqueça de que todos os corantes fluorescentes utilizados neste estudo são geralmente sensíveis à luz, e precauções, como o carregamento em placas escuras e as lavagens em câmara escura, devem ser sempre adotadas durante a realização deste procedimento.

O domínio dessa técnica pode ser alcançado em algumas horas. O que sugerimos é que vários fibras intactas sejam obtidas inicialmente, o que permite uma porcentagem maior de sucesso nos passos mecânicos de dissecção fina, além de possibilitar o cultivo dessas fibras durante a noite após seu isolamento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de sinalização de cálcio explorarem o papel da entrada de cálcio regulada por reservatórios no crescimento e na morte de células cancerígenas.

A função fisiológica e patológica no músculo.