Name: Scale Up de Cultura de células de mamíferos utilizando um Flask New Multicamadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprenda a escalar cultura de células de mamíferos usando frascos multicamadas BD Falcon. Este método aumenta o rendimento celular três a cinco vezes em comparação com frascos T175, garantindo crescimento homogêneo em todas as camadas.

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1. Protocolo a ser usado Multi-Frascos para cultura de células <ol><li> Preparação dos vasos e adição de suspensão de células <ol><li> Prepare meio de crescimento celular, conforme necessário. </li><li> Line up multi-Flask verticalmente em seu lado com a tampa virada para cima na superfície de trabalho (capela de fluxo laminar estéril). <ol><li> Estes estão disponíveis em frascos de 3 e 5 camadas formatos e usar um padrão de fluxo de trabalho semelhante a um balão de T-175. </li></ol></li><li> Solte e remova as tampas. Adicionar a quantidade necessária de pré-aquecido médio em frasco utilizando uma pipeta de 50 ou 100 mL ou por vazamento. <ol><li> Pipetas que são ≤ 10 ml pode chegar ao fundo do vaso quando Multi-Frascos são colocados verticalmente, com tampa virada para cima. Pipetas ≥ 10ml possa chegar até o navio imediatamente após o logotipo no Flask Multi-, proporcionando assim um portal conveniente para adicionar maiores volumes de mídia para navio. </li></ol></li><li> Para evitar bolhas de meio, permitir fluxo de líquido para flow ao longo da parede interna da tampa multi-Flask (logo-side). </li><li> Adicionar suspensão celular a partir de um estoque de células concentrados em meio de crescimento através da camada superior usando uma pipeta de 10 mL e frascos cap. Dicas: - Transporte Multi-Frascos em um carrinho para o site incubadora e executar as etapas restantes. - A densidade de semeadura de células irá variar dependendo do tipo de célula, médio e precisam duração cultura. Comece com a densidade de semeadura e volume de mídia ao usado no padrão T-175 frascos e multiplicar por 3 ou 5, dependendo do Flask Multi-formato utilizado. </li></ol></li><li> Mistura de células <ol><li> Mix posição: Segure o Flask Multi-ereto com o logotipo voltado para você e vire anti-horário para um ângulo de 45 ° com a porta mix voltado para você. </li><li> Exploração no mesmo ângulo, incline ligeiramente Multi-Flask da frente para trás (pescoço longe de você) até que o líquido na camada superior drena totalmente downwards através da porta mix. Pivot no mix porta lateral. </li><li> Da mesma forma, agite levemente Flask Multi-de trás para frente (pescoço para você) até meio ralos plenamente da camada inferior para a parte superior através da porta mix. Repita os passos 1.2.2 e 1.2.3 mais uma vez para assegurar a mistura adequada. </li><li> Traga Multi-Flask de volta à posição mix (Passo 1.2.1) e prossiga para a Etapa 1,3 </li><li> Alternativamente, suspensão de células podem ser preparados externamente a partir do Flask Multi-e suspensão de células pode ser adicionado ao recipiente utilizando uma pipeta ou por gentil vazamento. <ol><li> Porta permite misturar em recipiente de mistura de células com a mídia e elimina a necessidade de grandes volumes de células em suspensão externamente. </li><li> Ele também permite equalização de mídia em todas as camadas da Flask Multi- </li></ol></li></ol></li><li> Equilíbrio de fluidos <ol><li> Depois de misturar / adição de suspensão de células, coloque Flask Multi-verticalmente sobre uma superfície de trabalho plana para equalizar o volume de líquido equally em todas as camadas. </li></ol></li><li> Líquido partição em cada camada <ol><li> Segure o frasco Multi-com o logotipo voltado para você e gire no sentido horário para um ângulo de 45 ° para particionar o líquido para cada uma das camadas. Dica: - Para melhores resultados, é importante o uso de uma superfície de trabalho apartamento em Passos 1,3-1,4 </li></ol></li><li> Transporte <ol><li> Uma vez que a mídia contendo suspensão de células é particionado, transporte Flask Multi-na mesma 45 ° de ângulo (sentido horário) como no Passo 1.4.1 com a mídia longe do porto mix em incubadora. Esta posição também é adequado ao remover frascos de incubadora para a visualização de um microscópio. </li></ol></li><li> Colocando Multi-Flask em incubadora prateleira <ol><li> Segurando Multi-Flask no ângulo de 45 ° (sentido horário, longe da porta-mix), gentilmente gire-o para baixo horizontalmente na superfície incubadora (usando o canto longe do porto como um mixpivot). Lay Multi-Frasco com logotipo voltado para cima. <ol><li> Falcon design Multi-Flask permite que navios a serem empilhados e os mantém no lugar por uma costela resistente empilhamento. </li></ol></li></ol></li><li> Distribuição das células e reagentes <ol><li> Depois de colocar Multi-Flask sobre uma superfície plana de trabalho, gentilmente rock e para trás e para os lados para distribuir uniformemente as células em superfícies de cultura de tomar cuidado para não derramar líquido de cada camada. Pilha de frascos. <ol><li> Este balão é feito de material translúcido e células sobre a última camada pode ser facilmente visualizado em um microscópio. </li></ol></li></ol></li><li> Media Exchange <ol><li> Aspirar enquanto inclinando Flask Multi-o para a esquerda (mistura de porta-side) com o logotipo voltado para você. </li><li> Em seguida, incline o frasco Multi-à direita, continuando a aspirar todos os meios de comunicação residual. </li><li> Adicionar a quantidade apropriada de mídia e siga as etapas 1,3-1,7 </li></ol></li></ol> 2.Colheita de células multi-Frascos <ol><li> Dissociar células, line up Multi-Frascos verticalmente e levar cada um a posição Mix (Passo 1.2.1). Inverta suavemente frascos com pescoço de frente para você, de modo a permitir que a media de drenagem para a camada superior da Multi-Flask. </li><li> Inserir um 5 ou 10 mL ponta de aspiração através do pescoço até chegar a nível de líquido perto do porto mix. Aspirar meio esgotado. </li><li> Adicionar dissociação tampão reagente / lavar e trazer para Mix posição como no Passo 1.2.1, então prossiga e siga os passos de 1,3-1,7. Neutralize com meio de crescimento / agente neutralizante e despeje suspensão de células em um tubo de receber ou inverter frasco de modo que as células de drenagem para a camada superior do navio e recolher as células usando uma pipeta de 10 mL. Dica: Para aumentar a recuperação de células ou reagentes, trazer Multi-Flask para misturar posição (Passo 1.2.1), inverta com o pescoço para operador para permitir a drenagem completa de mídia da Al l camadas para a camada superior. Então, Flask Multi-inclinação no sentido horário para ângulo de 45 ° (longe da porta mix) enquanto o Flask Multi-permanece invertida. Use uma pipeta (10-10 mL) para coletar os reagentes restantes. </li></ol> 3. Recomenda volume de trabalho na Falcon Multi-Frascos Meio de crescimento 3-Layer: 75-150 mL por Multi-Flask 5-Layer: 125-250 mL por Multi-Flask Dissociação agente Layer-3: ≥ 15 mL por Multi-Flask 5-Layer: ≥ 25 mL por Multi-Flask Dica: Comece com um volume de meio utilizado no padrão T-175 frascos e multiplicar por 3 ou 5 vezes, dependendo do Flask multi-formato avaliados para que mL por unidade de superfície continua a mesma. 4. Resultados representativos: 1. Projeto de Falcon Flask Multi- files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg "/&gt; . Figura 1: Flask Multi-Cultura de Células embarcações estão disponíveis em uma 3 - e 5-camada formato empilhável para scale-up de células fornecendo 525 e 875 cm 2 de superfície de crescimento, respectivamente. Pipeta de acesso facilita a adição e remoção de células e reagentes em e fora do navio. Presença de port-mix permite rápida em recipiente de mistura e equalização de media em todas as camadas da Multi-Flask. 2. Rendimento das células usando multi-Flask: Estas embarcações estão disponíveis em 3 camadas e 5 camadas formatos que correspondem a 3 e 5 vezes a área da superfície da T-175 frascos. Assim, ≥ 3 e 5 vezes (130 ± 6,8 x 10 6 e 218 ± 23,6 x 10 6 células, respectivamente) o número de BHK-21 (baby hamster kidney), as células foram cultivadas e se recuperou de Multi-Flask comparado a T-175 frascos (43,2 ± 3,5 x 10 6 células; Fig.2A). Rendimento celular por unit área de superfície era equivalente em 3 - e 5-Multi-camada de frascos e T-175 frascos para BHK-21, LNCaP (humanas da próstata linhagem celular de adenocarcinoma), Hep-G2 (linha celular humana hepatocarcinoma), Ecopack 2-293 (humanos linhagem de células renais) cultivadas por um período de 48-96h (Fig.2B) em meio de crescimento (35 ml por camada), como recomendado pelo fornecedor de células (ATCC, Sigma e / ou Clontech). As células foram enumeradas em um contador de Vi-CELL automatizado (1). <img alt="Figura 2A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2A.jpg"> Figura 2A: três e cinco vezes o número de células BHK-21 foram cultivadas e se recuperou de 3 - e 5-layer Multi-Frascos em relação ao T-175 frascos. Rendimento esperado foi determinado utilizando rendimento celular média do controle T-175 frascos multiplicado por três e cinco vezes para a 3 - e 5-layer Multi-Frascos, respectivamente (n = 4 frascos / formato). <img alt="Figura 2B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2B.jpg"> Figura 2B: rendimento das células por cm 2 foi equivalente em 3 - e 5-Multi-camada de frascos e T-175 frascos para BHK-21, LNCaP, HepG2 e EcoPack2-293 células. Cada barra representa média de 4-6 frascos. Células BHK-21 (11.000 cells/cm2) foram cultivadas por 72 horas, as células LNCaP (20.000 cells/cm2) e EcoPack2-293 células (~ 35.000 cells/cm2) foram cultivadas por 96 horas e HepG2 células (25.000 células / cm 2 ) foram cultivadas por 48 horas antes da colheita. 3. Distribuição de mídia entre camadas de Multi-Flask Meio de cultura de células (DMEM; Invitrogen) foi adicionado em 5 camadas Multi-Frascos (250 mL/5-layer navio) e dividida em camadas de acordo com protocolo descrito acima. Distribuição de mídia foi medido por furos em cada camada e mídia bombeado para fora de camadas individuais. Peso de líquido recuperado de cada camada foi encontrado para ser relativamente uniforme de camada a camada, como mostrado na Figura 3. Eles são os seguintes: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (gm). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig3.jpg"> Figura 3. Uniform distribuição de mídia em cada uma das cinco camadas de uma camada de 5-Multi-Flask. Meio de cultura celular foi adicionado em Multi-Frascos (250 navio ml/5-layer), equilibrada e dividida em camadas individuais. A mídia foi bombeado para fora através de buracos perfurados em camadas individuais e peso líquido foi gravado a partir de cada camada (n = 6 frascos). 4. Distribuição celular entre as camadas de Multi-Flask As células podem ser adicionados e misturados dentro da Multi-Flask. Nós distribuição simulada de células entre as camadas de Multi-Flask usando pérolas (10μm; PolySciences Inc.), semelhante em tamanho às células. Suspensão de esferas foi adicionado em Multi-Flask navio utilizando uma pipeta de 10 mL através da camada superior e misturado com a mídia no vaso como described no protocolo acima. Distribuição de talão foi medido por furos em cada camada e fluido contendo suspensão de esferas foi bombeado para fora de camadas individuais. Concentração talão recuperado de cada camada foi lido em um contador Coulter e registrados. Mostrado a seguir são equivalentes inter-layer distribuições talão em 3 camadas Multi-Frascos (Fig.4A). A mistura de porta-permite a distribuição homogênea de células e reagentes entre Flask Multi-camadas. <img alt="Figura 4A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4A.jpg"> Figura 4A: distribuição do grânulo em cada uma das três camadas de uma camada de 3-Multi-Flask. Uma suspensão de grânulos (3,6 x10 6 / ml) foi adicionado ao meio dispensada em Multi-Frascos (suspensão de esferas: volume de mídia é 1:10, vol: vol) e mistos, seguido pelo equilíbrio e as etapas de partição utilizando o protocolo descrito. Concentração talão recuperado de cada camada (meio bombeado através de furos em cada camada) foi lido em uma contagem Coulterer e registrados. Mostrado a seguir são equivalentes inter-layer distribuições talão em 3 - Multi-layer Frascos (n = 5 frascos) Mostrados abaixo são imagens representativas de Ecopack 2-293 padrões de coloração de células cultivadas em&gt; confluência de 80% em 3 camadas de Multi-Frascos em meios de crescimento suplementado. Monocamadas de células foram fixadas e coradas com cristal violeta e Multi-camadas Flask foram então cortadas e imagens digitalizadas (2). Nota padronização celular, foi homogênea em todas as camadas da Flask-Multi (Fig.4B). Resultados semelhantes foram obtidos com vários tipos de células avaliados (dados não mostrados). <img alt="Figura 4B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4B.jpg"> Figura 4B: Esta figura ilustra o crescimento de células homogêneas entre as camadas de Multi-Frascos. Ecopack-2-293 células cultivadas a&gt; confluência de 80% em 3-Multi-camada de frascos e T-175 foram fixados e corados com violeta de cristal. Multi-Flask vasos foram cortados e cada camada manchada foi digitalizada. 5 Air oferta em Flask-Multi.: Análise de media gasto com BioProfile FLEX analisador (3,4) (Nova Biomedical) de EcoPack2-293 células cultivadas por 96 horas não revelou nenhuma diferença na saturação do ar de células cultivadas em 5 camadas Multi-Frascos vs T-175 frascos (81,03 ± 1,9 vs 83,4 ± 5,8% ambiente O 2). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig5.jpg"> Figura 5: Air saturação (% ambiente O 2) dos meios de comunicação passaram foram semelhantes em pré-mixed media de 5 camadas Multi-Frascos vs T-175 frascos. EcoPack2-293 células foram semeadas a uma densidade de 35.000 células / cm 2 e cultivadas por 96 horas antes da análise de media (n = 3 frascos).

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</ol>

Todos os autores são funcionários da Becton Dickinson, Segmento de Biociências, Discovery Unidade Labware.

O presente estudo demonstra o aumento da produtividade que a concepção Flask Multi-oferece aos pesquisadores. Embora seja importante seguir as etapas descritas anteriormente para desempenho otimizado ao usar Multi-Frascos, há poucos passos críticos neste protocolo que são considerados mais essenciais. Estes incluem: (i) mistura de células e reagentes usando a porta mix dentro do vaso (ii) o transporte de Multi-Flask em um ângulo de 45 ° no sentido horário após particionamento líquido para cada uma das camadas (iii) que Flask-Multi pós plano de particionamento para o incubadora. Uso adequado de Multi-Flask leva à produção de uma população de células homogêneas dentro de cada navio que é cultivada em um ambiente que é congruente a T-175 frascos (5). Estas embarcações fornecer células 3 e 5 vezes mais em um espaço semelhante ao do frasco T-175. O navio 3 e 5 camadas fornece 525 e 875 centímetros 2 de área de crescimento, respectivamente, e oferecem espaço e trabalho savings para os usuários. Tratamento de superfície de tecido Cultura é comparável ao padrão frascos permitindo scale-up, sem a necessidade de re-otimização das condições de cultura existente ou comprometer a homogeneidade, qualidade ou desempenho de células (6, 7). Isto também prevê a comparabilidade com os dados coletados anteriormente. Esses vasos podem ser também revestido com reagentes tais como colágeno, fibronectina, poli-D-lisina para fornecer um substrato para o crescimento especializados apego e diferenciação de certos tipos de células, tais como hepatócitos 8, 9 kertainocytes, células-tronco cultivadas em soro de mídia livre formulações. Soluções de revestimento pode ser removido com a retenção de líquido residual mínima, de modo a reduzir o desperdício de reagentes valiosos, bem como a remoção eficaz de solução de revestimento antes de a cultura de células. O recomendado volume de mídia ideal para células de cultura em frascos multi-faixa ,142-0,287 ml / cm 2, que se traduzem em 25-50 ml por camada. Ao contrário de um outro frasco de múltiplas camadas, tseu produto oferece uma combinação porta-in que permite que a embarcação rápida no vaso de mistura, bem como distribuição uniforme de células e reagentes dentro e entre as camadas de cada navio. Linhagens de células diversas, culturas primárias e células-tronco foram ampliados de forma eficiente usando Multi-Frascos. Estes navios são particularmente vantajoso em aplicações que exigem um grande número de células, como no alto throughput screening, a produção de vacinas, transfections vetor viral e terapia celular. Economia de tempo, espaço, trabalho e geração de resíduos são reduzidos ganhos chave do Flask multi-versus culturas convencionais em vasos de camada única. Podemos cultura cerca de três vezes o número de células colhidas de 5, T-175 frascos no mesmo espaço, com 3, 5 camadas Multi-Frascos. Esta vantagem na economia de espaço não se limita apenas a T-175, mas também pode ser estendido para outros navios: um aparelho de garrafa padrão rolo que se encaixa em incubadoras de casas comuns de laboratório rol ~ 4garrafas de Ler (2200 ml) cada um dos quais fornece 850 centímetros 2 de superfície. Na mesma área, ~ 20, 5 camadas Multi-Frascos podem ser alojados proporcionando assim cinco vezes a superfície de crescimento para células de cultura. Além disso, com um aumento do &quot;Go-Green&quot; consciência, opções para reduzir a geração de resíduos é altamente desejável. A esse respeito, há um 38% (5, T-175 frascos pesam ~ 640g enquanto que uma, Flask Multi-5 camadas pesa ~ 400g) diminuição da geração de resíduos utilizando Multi-Frascos em relação ao T-175 frascos e levar essas vantagens a diminuir em armazenamento dos resíduos e custos de eliminação e resultar em economia de custos para o usuário.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 3 camadas de cultura de tecidos tratados com 525 centímetros 2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353143 </td><td rowspan="21"> <a href="http://www.bdbiosciences.com/cellculture/multiflasks/index.jsp">BD Biosciences Cultura de Células - BD Falcon Multi-Frascos</a> </td></tr><tr><td> 5 camadas da cultura de tecidos tratados 875 centímetros 2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353144 </td></tr><tr><td> 100ml pipeta </td><td> BD Biosciences </td><td> 357600 </td></tr><tr><td> 10 ml de pipeta </td><td> BD Biosciences </td><td> 357551 </td></tr><tr><td> 5 ml de aspiração pipeta </td><td> BD Biosciences </td><td&gt; 357501 </td></tr><tr><td> 50 tubo de polipropileno ml cônico </td><td> BD Biosciences </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> T-175 Tecido frasco Cultura tratados com </td><td> BD Biosciences </td><td> 353028 </td></tr><tr><td> Gram Cristal Violeta </td><td> BD </td><td> 212525 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> GMEM </td><td> Sigma </td><td> G5154 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> ATCC </td><td> 30-2001 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> ATCC </td><td> 30-2003 </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td></tr><tr><td> Triptose fosfato Caldo </td><td> Sigma </td><td> T8159 </td&gt; </tr><tr><td> Células BHK-21 </td><td> Sigma </td><td> 85011433 </td></tr><tr><td> Hep-G2, LNCaP </td><td> ATCC </td><td></td></tr><tr><td> Ecopack 2-293 </td><td> Clontech </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> Bead poliestireno </td><td> PolySciences Inc. </td><td> 24628-20 </td></tr><tr><td> Bio-Flex Profile Analyzer </td><td> Nova BioMedical </td><td></td></tr></tbody></table>

scale up de cultura de células de mamíferos utilizando um flask new multicamadas

Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

Um número crescente de aplicações baseadas em células requerem um grande número de células. Utilização de camada única T-frascos, que são adequados durante a pequena escala de expansão, pode tornar-se complicado, trabalhoso e demorado quando um grande número de células são obrigatórios. Para atender a essa necessidade, o desempenho de um novo navio cultura multi-camadas de células para facilitar escala fácil de células da camada única T-frascos serão discutidos. Os frascos testados estão disponíveis em 3 - e 5-camada formato e permitir que a cultura ea recuperação completa de três e cinco vezes o número de células, respectivamente, em comparação com T-175 frascos. Uma característica chave do BD Flask Multi-é uma porta de mix / equilíbrio que permite rápida em recipiente de mistura, bem como distribuição uniforme de células e reagentes dentro e entre as camadas de cada navio e consistentemente produzem células que podem ser cultivadas em um ambiente que é congruente a T-175 frascos. O projeto destes frascos Multi-também permite cacesso pipeta onvenient para adicionar reagentes e células diretamente no frasco, bem como a recuperação eficiente de células valiosas e reagentes e reduz o risco de contaminação devido a vazamento. Para aplicações onde o vazamento é preferível a pipetagem, o projeto permite a retenção de líquido residual mínima, de modo a reduzir o desperdício de valiosas células e reagentes.

Células desempenham um papel fundamental e crescente na pesquisa e na descoberta e desenvolvimento de novas terapêuticas. Com esta crescente necessidade de maior número de células que precisam de maneiras mais eficientes e eficazes para o cultivo e colheita de células apego dependente. Um frasco de múltiplas camadas com as características certas pode servir a esse propósito.

Scale Up de Cultura de células de mamíferos utilizando um Flask New Multicamadas

Um número crescente de aplicações baseadas em células requer grandes quantidades de células. O uso de frascos T de camada única, que são adequados durante a escala reduzida...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como cultivar células homogêneas com produtividade aumentada utilizando os frascos múltiplos BD Falcon de três ou cinco camadas. Isso é realizado primeiramente adicionando meio ao frasco e inoculando-o com uma suspensão celular. O segundo passo é misturar e equilibrar o conteúdo para distribuí-lo uniformemente.O terceiro passo é posicionar o transporte e colocar o frasco na posição horizontal dentro da estufa. O passo final é colher as células cultivadas no frasco multilâmina. Em última análise, pode-se obter um rendimento celular três a cinco vezes maior em comparação com frascos T175, com crescimento celular homogêneo em todas as camadas do frasco multilâmina, pois utiliza um novo dispositivo de cultura celular.Recomenda-se fortemente a demonstração visual deste método, pois os passos de manipulação são difíceis de conceituar. Os frascos de cultura celular multicanais estão disponíveis em formatos empilháveis com três ou cinco camadas para ampliação da cultura celular, fornecendo áreas de superfície de crescimento de 525 e 875 centímetros quadrados, respectivamente, com acesso por pipeta, o que facilita a adição e remoção de células e reagentes do frasco. A presença da porta mista permite a mistura rápida dentro do frasco e a equalização do meio em todas as camadas do frasco multicanal.Para utilizar um frasco múltiplo para cultivo celular, comece colocando o recipiente verticalmente de lado em uma cabine de fluxo laminar estéril. Com a extremidade da tampa voltada para cima, rotule o frasco múltiplo nesta posição antes de adicionar qualquer conteúdo, afrouxe e remova a tampa. Insira uma pipeta de 50 a 100 mililitros.Passe imediatamente pelo logotipo para adicionar 35 mililitros de meio de crescimento celular pré-aquecido por camada diretamente ao frasco múltiplo. Para evitar a formação de bolhas no meio, permita que o fluxo de líquido entre ao longo da parede interna do lado do logotipo do frasco múltiplo. Por fim, utilizando uma pipeta de volume menor ou igual a 10 mililitros.Adicione a suspensão celular experimental a partir de um estoque concentrado de células ao meio de crescimento através da camada superior e tampe o frasco para facilitar a mistura invertida das células com o meio e eliminar a necessidade de preparar grandes volumes de suspensões celulares externamente. Levante e mantenha o frasco múltiplo na posição vertical com o logotipo voltado para você e gire o recipiente no sentido anti-horário até um ângulo de 45 graus. Em seguida, mantenha o recipiente nesse mesmo ângulo.Incline suavemente o frasco múltiplo de frente para trás com o pescoço voltado para longe até que o líquido na camada superior escorra completamente para baixo através do orifício de mistura. Gire o recipiente sobre o orifício de mistura e repita esta ação para permitir a mistura adequada das células com o meio. Em seguida, retorne o frasco múltiplo à posição misturada.Após misturar a suspensão celular, posicione o frasco múltiplo verticalmente sobre uma superfície plana de trabalho para equalizar uniformemente o volume do líquido em todas as camadas. Por fim, para distribuir o líquido em cada camada, segure o frasco múltiplo com o logotipo voltado para você, como antes, e gire o recipiente no sentido horário até um ângulo de 45 graus.Tendo o cuidado de manter o fluido longe do orifício de mistura. Após a suspensão celular ter sido particionada, transporte o frasco múltiplo mantendo o mesmo ângulo de 45 graus no sentido horário, com o meio afastado do orifício de mistura, até o incubador, segurando o recipiente nessa posição. Em seguida, gire suavemente o frasco múltiplo horizontalmente para baixo sobre a superfície do incubador, com o logotipo voltado para cima, usando o canto oposto ao orifício de mistura como ponto de pivô. Em seguida, balance suavemente o recipiente para frente e para trás e de um lado para o outro, para distribuir as células uniformemente sobre as superfícies de cultura.Tendo cuidado para não derramar líquido de cada camada ao empilhar os frascos um sobre o outro. Depois de colocá-los no incubador, certifique-se de que o meio permaneça separado e longe da porta de mistura ao colocá-lo na posição horizontal sobre o outro frasco. Primeiro, segure o frasco múltiplo na posição vertical com o logotipo voltado para dentro.Em seguida, insira uma ponteira de aspiração de cinco mililitros e esvazie o meio exaurido para concluir a aspiração. Segure o frasco múltiplo na direção de 45 graus no sentido anti-horário enquanto inverte o vaso para dentro e continue a aspiração para recuperação máxima. Enquanto o vaso estiver invertido para dentro, incline-o no sentido horário e aspire o volume residual no canto oposto à porta de mistura antes da dissociação.Se necessário, as monocamadas celulares podem ser lavadas com PBS e aspiradas para um recipiente de resíduos. Agora, adicione o reagente dissociante tripsina-EDTA e retorne o recipiente à posição mista. Em seguida, após a equalização da repartição e distribuição do reagente por todas as camadas conforme demonstrado anteriormente, incube o frasco a 37 graus Celsius pelo tempo desejado.Após neutralizar a solução dentro do reagente de inativação e repetir as etapas de mistura, equilíbrio e particionamento, despeje a suspensão celular em um tubo receptor. Por fim, incline o frasco múltiplo no sentido horário até um ângulo de 45 graus, afastando-se do orifício de mistura. Mantendo o recipiente invertido.Use uma pipeta para coletar os reagentes remanescentes. Retire uma alíquota de células para contagem, a fim de determinar a concentração celular. Ao utilizar meio de crescimento em um frasco multilâmina de três camadas, recomenda-se um volume de meio de cultura celular entre 75 e 150 mililitros.Ao utilizar um multi-frasco de cinco camadas, é possível incubiar de 125 a 250 mililitros por vaso. Para agentes de dissociação, podem ser adicionados 15 mililitros ou mais por multi-frasco de três camadas, e 25 mililitros ou mais para vasos de cinco camadas, utilizando multi-frascos de três e cinco camadas. Três a cinco vezes o número de células renais de hamster bebê foram cultivadas e recuperadas dos multi-frascos em comparação com frascos T 1 75, conforme representado neste gráfico de barras.Nesta figura, pode-se observar que o rendimento celular por unidade de área superficial é equivalente em frascos multilaminares de três e cinco camadas e em frascos T175 para células renais de hamster bebê. Uma linhagem celular de adenocarcinoma de próstata humano, uma linhagem celular de carcinoma hepático humano e uma linhagem celular de rim humano Eco Pack 293, todas cultivadas nos meios de crescimento apropriados para esses dados. Cultura celular.Adicionou-se meio a frascos multicamada com cinco camadas e o meio foi particionado em camadas. De acordo com o protocolo recém-demonstrado, fizeram-se orifícios nas camadas individuais e o meio de cada uma foi aspirado e medido. O peso do fluido recuperado de cada camada foi relativamente uniforme de camada para camada, confirmando a distribuição igualitária do meio por todo o vaso.Após a partição nesta figura, foi realizada uma distribuição simulada de células entre camadas de um frasco múltiplo utilizando esferas com tamanho semelhante ao das células, conforme evidenciado pelos dados aqui representados, que mostram o número de esferas enumeradas por camada. A porta mista permitiu uma distribuição homogênea das esferas e reagentes entre as camadas do frasco múltiplo. Abaixo, imagens representativas dos padrões de coloração de células cultivadas até mais de 80% de confluência em frascos múltiplos de três camadas.Em meios de crescimento suplementados, as monocamadas celulares foram fixadas e coradas com violeta cristal. As camadas múltiplas do frasco foram cortadas e as imagens foram digitalizadas. Observe o padrão homogêneo de células em todas as camadas do frasco múltiplo.Esta figura final mostra dados de uma análise de meio usado isolado de culturas de células renais embrionárias humanas após 96 horas, utilizando um analisador bio profile flex. Nenhuma diferença na saturação de ar no meio isolado das camadas individuais de frascos multicanadas de cinco camadas em comparação com frascos T 1 75 foi detectada. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar o multi flash para aumentar a produtividade.

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Biologia

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