Name: Medição do Ca citosólico 2 + Em Isolated linfáticos contráteis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprenda a medir o Ca²⁺ citosólico em vasos linfáticos isolados de rato usando imagem de cálcio ratiométrica com Fura-2 AM. Este método permite estudar a relação entre concentração de cálcio e contração fásica e tônica do músculo liso linfático sob pressão luminal controlada.

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<p class="jove_content"&gt; Este trabalho foi financiado pelo NIH e P20RR018766 conceder uma subvenção do ABMRF / Fundação para a Pesquisa do Álcool.</p

<ol><li>Chakraborty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+system%3A+a+vital+link+between+metabolic+syndrome+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1207, Suppl 1. 94-94 (2010).</li>
<li>Zawieja, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+biology+and+the+microcirculation%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Lymphatic biology and the microcirculation: past, present and future.</a> Microcirculation. 12, 141-141 (2005).</li>
<li>Benoit, J. N., Zawieja, D. C., Goodman, A. H., Granger, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+intact+mesenteric+lymphatic+pump+and+its+responsiveness+to+acute+edemagenic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of intact mesenteric lymphatic pump and its responsiveness to acute edemagenic stress.</a> Am. J. Physiol. 257, H2059-H2059 (1989).</li>
<li>Davis, M. J., Davis, A. M., Ku, C. W., Gashev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+constriction+and+dilation+of+isolated+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Myogenic constriction and dilation of isolated lymphatic vessels.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 296, H293-H293 (2009).</li>
<li>Dougherty, P. J., Davis, M. J., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sensitivity+and+cooperativity+of+permeabilized+rat+mesenteric+lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium sensitivity and cooperativity of permeabilized rat mesenteric lymphatics.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 294, R1524-R1524 (2008).</li>
<li>Fay, F. S., Shlevin, H. H., Granger, W. C., Taylor, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin+luminescence+during+activation+of+single+isolated+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aequorin luminescence during activation of single isolated smooth muscle cells.</a> Nature. 280, 506-506 (1979).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+myosin+light+chain+phosphorylation+decreases+rat+mesenteric+lymphatic+contractile+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of myosin light chain phosphorylation decreases rat mesenteric lymphatic contractile activity.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, 726-726 (2009).</li>
<li>Karaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+movements%2C+distribution%2C+and+functions+in+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle.</a> Pharmacol. Rev. 49, 157-157 (1997).</li>
<li>Ratz, P. H., Berg, K. M., Urban, N. H., Miner, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+smooth+muscle+calcium+sensitivity%3A+KCl+as+a+calcium-sensitizing+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of smooth muscle calcium sensitivity: KCl as a calcium-sensitizing stimulus.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 288, C769-C769 (2005).</li>
<li>Somlyo, A. P., Somlyo, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+sensitivity+of+smooth+muscle+and+nonmuscle+myosin+II%3A+modulated+by+G+proteins%2C+kinases%2C+and+myosin+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Ca2+ sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin II: modulated by G proteins, kinases, and myosin phosphatase.</a> Physiol. Rev. 83, 1325-1325 (2003).</li>
<li>Souza-Smith, F. M., Kurtz, K. M., Molina, P. E., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+mesenteric+collecting+lymphatic+pump+function+following+acute+alcohol+intoxication%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Adaptation of mesenteric collecting lymphatic pump function following acute alcohol intoxication.</a> Microcirculation. 17, 514-514 (2010).</li>
<li>Breslin, J. W., Yuan, S. Y., Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-C+alters+barrier+function+of+cultured+lymphatic+endothelial+cells+through+a+VEGFR-3-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphat.+Res.+Biol%22%5BJournal%5D)">VEGF-C alters barrier function of cultured lymphatic endothelial cells through a VEGFR-3-dependent mechanism.</a> Lymphat. Res. Biol. 5, 105-105 (2007).</li>
<li>Shirasawa, Y., Benoit, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-induced+calcium+sensitization+of+rat+lymphatic+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stretch-induced calcium sensitization of rat lymphatic smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 285, H2573-H2573 (2003).</li>
<li>Imtiaz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaking+through+Ca2%2B+stores+interacting+as+coupled+oscillators+via+membrane+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Pacemaking through Ca2+ stores interacting as coupled oscillators via membrane depolarization.</a> Biophys. J. 92, 3843-3843 (2007).</li>
<li>Muller, J. M., Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+coronary+endothelial+cell+Ca2%2B+concentration+during+shear+stress-+and+agonist-induced+vasodilation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Changes in coronary endothelial cell Ca2+ concentration during shear stress- and agonist-induced vasodilation.</a> Am. J. Physiol. 276, 1706-1706 (1999).</li>
<li>Ferrusi, I., Zhao, J., van Helden, D., von der Weid, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclopiazonic+acid+decreases+spontaneous+transient+depolarizations+in+guinea+pig+mesenteric+lymphatic+vessels+in+endothelium-dependent+and+-independent%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cyclopiazonic acid decreases spontaneous transient depolarizations in guinea pig mesenteric lymphatic vessels in endothelium-dependent and -independent.</a> 286, H2287-H2287 (2004).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A nova combinação de métodos foi empregado para estudar intrínseca de bombeamento dos vasos linfáticos. A capacidade de medir simultaneamente mudanças na [Ca 2 +] i e diâmetro no sistema linfático de bombeamento permitirá estudos sobre as contribuições relativas de Ca 2 +-dependente e Ca 2 +-sensibilizantes vias de sinalização em todo o mecanismo que rege o ciclo linfática contrátil. O ciclo contrátil linfática consiste em contrações fásicas sobrep...

<table border="1"><tbody><tr><td> 1. Ringer stock 5x </td></tr><tr><td Químico </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Cloreto de Potássio </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1,75 g </td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1,47 g </td></tr><tr><td> Sulfato de magnésio </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> Água filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Trazer para 1 L </td></tr><tr><td> Filtro estéril em frascos autoclavados e lojas a 4 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2. Tampão MOPS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Químico </td><td> Companhia </td&gt; <td> Número de catálogo </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125,6 g </td></tr><tr><td> Água filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Trazer para 1 L </td></tr><tr><td> Filtro estéril em frascos autoclavados e lojas a 4 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3. Solução Sal albumina Physiological (APSS) </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> Ringer estoque (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td> Tampão Mops </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 mL </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0,168 g </td></tr><tr><td> Piruvato de sódio </td><td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> EDTA de sódio salt </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 g </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> Albumina Bovina </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> Água filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Trazer para 1 L </td></tr><tr><td> Ajustar o pH para 7,4 a 37 ° C, seguida de filtração estéril em frascos autoclavados e armazenar a 4 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Reagentes específicos utilizados. Armazenar todos a 4 ° C.

medição do ca citosólico 2 + em isolated linfáticos contráteis

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Vasos linfáticos formam um sistema de transporte multifuncional que mantém a homeostase dos fluidos, oferece lípidos para a circulação central, e atua como um sistema de vigilância para os antígenos potencialmente prejudiciais, otimizando a imunidade da mucosa e respostas imunes adaptativas 1. A linfa é formado a partir de líquido intersticial que entra cego-ended linfáticos iniciais, e depois é transportado contra um gradiente de pressão na maior sistema linfático coleta. Cada linfáticos é composta de uma série de segmentos chamados lymphangions, separados por válvulas bicúspide, que impedem o refluxo. Cada lymphangion possui um ciclo de contração que impulsiona linfáticos contra um gradiente de pressão para a circulação central 2. Este padrão contrátil fásica é análogo ao do ciclo cardíaco, com fases sistólica e diastólica, e com menor freqüência 4 contração. Além disso, o músculo liso linfático gera tom e exibe miogênica constrição e dilatação in resposta a aumentos e diminuições na pressão luminal, respectivamente 5. Um híbrido de mecanismos moleculares que suportam tanto a contratilidade fásicas e tônicas dos vasos linfáticos são assim propostas. Contração do músculo liso é geralmente regulado pelo Ca 2 + citosólico concentração ([Ca 2 +] i) a sensibilidade de mais para Ca 2 +, dos elementos contrátil em resposta a mudanças no ambiente ao redor da célula 6. [Ca 2 +] i é determinado pela combinação do movimento do Ca 2 + através da membrana plasmática ligante ou tensão gated Ca 2 + e canais a liberação e absorção de Ca 2 + das lojas internas. Citosólica de Ca 2 + se liga a calmodulina e ativa enzimas como a cadeia leve de miosina (MLC) quinase (MLCK), que por sua vez fosforila MLC levando a actina-miosina-contração mediada 8. No entanto, a sensibilidade desta via de Ca <sup&gt; 2 + pode ser regulada pela fosfatase MLC (MLCP) 9. MLCP atividade é regulada por Rho quinase (Rock) e da proteína miosina inibidor da fosfatase CPI-17. Aqui, apresentamos um método para avaliar as alterações na [Ca 2 +] i ao longo do tempo isolado, vasos linfáticos perfundidos para estudar Ca 2 +-dependente e Ca 2 +-sensibilizar os mecanismos de contração do músculo liso linfático. Usando linfáticos mesentéricos isolados de ratos coletando estudamos estiramento induzido por mudanças na [Ca 2 +] i e atividade contrátil. O modelo linfático isolado oferece a vantagem de pressão, fluxo e da composição química da solução de banho podem ser bem controladas. [Ca 2 +] i foi determinado pela carga linfáticos com o raciométrica, Ca 2 +-binding corante Fura-2. Estes estudos fornecem uma nova abordagem ao problema mais amplo de estudar os diferentes mecanismos moleculares que regulam fásicacontrações contra constrição tônica no músculo liso linfático.

Nós introduzimos uma abordagem para avaliar o Ca citosólico<sup&gt; 2 +</sup&gt; Concentração no sistema linfático isolado para estudar Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Dependente e Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sensibilizante mecanismos de contração do músculo liso linfático.

Medição do Ca citosólico 2 + Em Isolated linfáticos contráteis

Os vasos linfáticos compreendem um sistema de transporte multifuncional que mantém a homeostase fluídica, entrega lipídios à circulação central e atua como um...

Este sistema experimental determina se alterações no cálcio intracelular estão relacionadas a mudanças no padrão contrátil linfático provocadas pelo aumento da pressão luminar. Primeiro, ressecar um vaso linfático contrátil do mesentério de rato e canulá-lo em ambas as extremidades para controlar rigorosamente a pressão luminar. Em seguida, carregar o vaso com o corante sensor de cálcio ratiométrico fura 2:00 AM, o que permite a medição de alterações no cálcio citosólico por meio de microscopia de fluorescência com excitação alternada em três comprimentos de onda de 40 e três de 80 nanômetros.Registre as alterações no diâmetro dos vasos linfáticos e nos níveis de cálcio citosólico enquanto o vaso é submetido à pressão luminar. O protocolo por etapas também determina o diâmetro linfático a partir das imagens de lapso de tempo obtidas. Os resultados indicam uma relação temporal entre aumentos transitórios no cálcio citosólico e contrações fásicas dos vasos linfáticos, bem como uma correlação entre os níveis de cálcio e a constrição miogênica.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a microscopia intravital, é que todas as influências extrínsecas sobre

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui, descrevem o isolamento de cardiomyoctyes ratinho adulto usando um sistema de perfusão de Langendorff. As células resultantes são Ca2 +-tolerantes, electricamente quiescente e podem ser cultivadas e transfectadas com lentivírus para manipular a expressão de genes ou vírus adeno-. A sua funcionalidade, também pode ser analisada utilizando o sistema de MMSYS e técnicas de fixação de membranas.

Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

Músculo papilar do ventrículo esquerdo de murino pode ser usado para investigar in vitro a contractilidade cardíaca. Este artigo descreve em detalhes o isolamento e protocolos experimentais para estudar características contráteis cardíacas.

Medidas de contratilidade no isolado músculos papilares de Investigação de Cardiac inotropia em Ratos

Este artigo descreve o protocolo detalhado e equipamentos necessários para o mapeamento de óptica dupla de transmembrana potencial (V m) e livre intra-retículo sarcoplasmático (RS) Ca2 + no coração de coelho Langendorff-perfundidos. Este método permite a observação direta e quantificação de V m e SR Ca2 + dinâmica no coração intacto.

Mapeamento óptica de Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E Potencial Transmembrane no Coração Langendorff-perfundidos

Atualmente, a maioria dos indicadores de cálcio disponíveis são usados para quantificar transientes citoplasmáticos de cálcio como medidas indiretas de cálcio liberado do retículo sarcoplasmático em células musculares lisas cultivadas. Este protocolo descreve o uso de um indicador específico baseado em FRET que permite a medição direta de sinais de cálcio dentro do lúmen do retículo sarcoplasmático.

Medição das flutuações cálcio dentro do Sarcoplasmic retículo de células musculares lisas cultivadas utilizando FRET baseado em imagem confocal

Este trabalho descreve um protocolo que avalia as alterações da sensibilidade do miofilamento Ca2+ durante a contração em miócitos cardíacos isolados do coração de ratos. Juntamente com a eletrofisiologia cardíaca, os níveis sistólicos/diastólicos de citosol Ca2+ e a contração/relaxamento, essa medição é imperativa para sustentar os mecanismos que medeiam o acoplamento excitação-contração cardíaca em corações saudáveis e doentes.

Avaliação de miofilamentos Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilidade Subjacente Cardiac excitação-contração acoplamento

Reciclagem de cálcio intracelular desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar sarcoplasmático Ca2 + reserva e função de remoção de cálcio diastólica em cardiomyocytes por um sistema de imagem de cálcio.

Avaliação da remoção de reserva e intracelular do cálcio diastólica cálcio sarcoplasmático em Cardiomyocytes Ventricular isolado

Apresentado aqui é um protocolo para avaliar as propriedades contratuais de myofibrils musculares estriados com resolução nano-Newton. O protocolo emprega uma configuração com uma sonda de força óptica baseada em interferometria. Esta configuração gera dados com uma alta relação sinal-ruído e permite a avaliação da cinética contracttil dos myofibrils.

Isolando Myofibrils de Biópsias musculares esqueléticas e determinando função contractile com um transdutor de força de resolução nano-Newton

Modelos murinos permitem estudar os principais mecanismos da arritmogênese. Para isso, cardiomiócitos de alta qualidade são necessários para a realização de medidas de patch-clamp. Aqui, é descrito um método para isolar miócitos murinos atriais e ventriculares via perfusão retrógrada de Langendorff baseada em enzimas, que permite medidas simultâneas de transientes de cálcio e corrente de cálcio tipo L.

Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca2+ transitórios e corrente de cálcio tipo L

O presente protocolo descreve a preparação e utilização de fatias pulmonares cortadas com precisão do rato para avaliar as vias aéreas e a contratilidade muscular liso arterial intrapulmonar em um ambiente quase in vivo .

Utilizando a fatia pulmonar cortada com precisão para estudar a regulação contratil das vias aéreas e do músculo liso arterial intrapulmonar

Aqui, um método estabelecido é descrito para realizar medidas de contratilidade e cálcio em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos usando uma plataforma óptica. Esta plataforma permite aos investigadores estudar o efeito das mutações e a resposta a vários estímulos de forma rápida e reprodutível.

Medidas em Tempo Real de Parâmetros de Cálcio e Contratilidade em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos Humanos

Este protocolo descreve um método para medir simultaneamente o diâmetro citosólico, de cálcio livre [Ca2+]i e do vaso em vasos linfáticos em contração em tempo real e, em seguida, calcular as concentrações absolutas de Ca2+ , bem como os parâmetros de contratilidade/ritmidade. Este protocolo pode ser usado para estudar Ca2+ e dinâmica contrátil em uma variedade de condições experimentais.

Avaliação em tempo real de Ca2+ absoluto, citosólico, livre e contratilidade correspondente em vasos linfáticos isolados e pressurizados

Aprenda a medir o Ca²⁺ citosólico em vasos linfáticos isolados de rato usando imagem de cálcio ratiométrica com Fura-2 AM. Este método permite estudar a relação entre concentração de cálcio e contração fásica e tônica do músculo liso linfático sob pressão luminal controlada.

Medição do Ca citosólico^{2 +} Em Isolated linfáticos contráteis

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