Name: Cirurgia Nó murino superficial linfático (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: Aprenda a técnica cirúrgica para remoção sequencial de linfonodos em camundongos anestesiados. Este método permite rastrear respostas imunes ao longo do tempo e obter suspensões celulares para análise por citometria de fluxo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos Sylvie Lesage e todos os membros do laboratório para a leitura crítica do protocolo. Este trabalho foi financiado por uma subvenção (MOP-77545) do Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Nathalie Labrecque é apoiado por uma bolsa de estudos FRSQ Sênior e Mélissa Mathieu recebeu um NSERC Alexander Graham Bell Canada Bolsa de Pós-Graduação.

1. Preparação antes da cirurgia Os ratos foram tratados de acordo com o Conselho Canadense sobre as orientações de cuidados com animais. <ol><li> Ratinhos anestesiar por injecção de cetamina / xilazina (150/300 mg / kg, ip) ou por inalação de isoflurano (2%, oxigénio 1L). Se estiver disponível, isoflurano deve ser utilizado, pois permite um melhor controlo da anestesia tempo e profundidade. Além disso, o oxigénio é administrado ao mesmo tempo que suporta as funções fisiológicas do animal. Além disso, isoflurano está directamente eliminado pelos pulmões e, assim, não necessita de metabolização hepática ou renal. </li><li> Injectar a buprenorfina (0,05 - 0,1 mg / kg, sc) ou outro analgésico. </li><li> Aplicar pomada para os olhos do mouse antes da cirurgia para evitar ressecamento do olho (se o isoflurano é usado). </li><li> Verifique se o mouse está dormindo por beliscar a sua pata e rolar sua cauda. Se o mouse não reagir, avançar com a cirurgia. </li></ol> 2. A Cirurgia <pclasse poss remover dos g linf superficiais por cirurgia: a inguinais eo braquial o isolamento de ln mais f em jovens ratos magros semanas desde presen tecido adiposo camundongos velhos podem interferir com ln. no entanto esta limita superada pr repetida. para conforto colhemos um m linfonodos tempo e quando realizamos curso experimentos lns cada segundo dia. al disso prevenir infec antibi ser dadas mouse mas n fazemos as feridas est cicatrizando bem. precisa estar ciente que dependendo do desenho experimental utiliza pode influenciar resultado observado exemplo se uma resposta bact medido note-se todos os instrumentos s esterilizados ap condi ass mantidas ao longo procedimentos.><ol><li> Coloque o mouse de lado. </li><li> Localize a região onde você vai realizar uma incisioN, dependendo do LN deseja colher. (Figura 1). </li><li> Aplicar clorexidina, ou outro desinfectante, a essa região. </li><li> Fazer uma pequena incisão, com uma tesoura afiada (cerca de 5 mm), quer na parte de trás da perna dianteira ou acima da pata posterior perto do abdómen (Figura 1). </li><li> Retire os pêlos soltos tenha sido cortada com a pinça. Se preferir, você pode raspar o mouse antes de fazer a incisão. No entanto, ela aumenta o procedimento e descobrimos que não é necessário uma vez que, como mostrado aqui, ela não melhorar a cicatrização ou diminuição da infecção, que são ambos muito raro. </li><li> Estique a incisão com pinça de 2 a fim de ver o LN. A incisão pode chegar a 10 mm. A LN aparece acinzentada ou escura do que a gordura ao redor. </li><li> Comprima a fáscia (a fina membrana que cobre a gordura e de tecido) em cima da LN com um fórceps e puxar levemente sem quebrar o tecido circundante. </li><li> Coloque a pinça segundo, tanto quanto possível underneath o LN. Com as pinças primeiro, quebrar a fáscia e remover o LN. Se você tiver êxito colheu o LN, uma mancha de sangue deve aparecer no local onde o LN foi previamente localizado. Note-se que os dissipadores de LN em solução isotónica. Este teste simples permite validar que você tenha extraído um LN e tecido não gordura. </li><li> Verificar que nenhum pêlos são na ferida. </li><li> Feche o incisão furando as 2 partes de pele em conjunto (o interior da pele) e por grampeamento-los com um clip. Utilizamos alguns Clipe Michel com a pinça aplicando. Instalar um ou dois clipes, dependendo do tamanho da incisão. Na maioria das vezes, os clipes de cair quando o tecido cicatriza. </li></ol> 3. Cuidados Pós-Operatórios <ol><li> Adicionar algum alimento molhado para o fundo da gaiola de modo que os ratinhos pode alimentar facilmente após a cirurgia. </li><li> Cerca de 6 a 8 horas após a cirurgia, os ratos verificar para garantir que eles não experimentam dor. Observar atentamente o seu comportamento (postura, marcha, eminteracção com congéneres ea aparência da pele). Se a aparência geral dos ratinhos é pobre, administrar uma segunda dose de buprenorfina. No dia seguinte, os ratos devem recuperar a sua comportamento normal de outro modo continuar a administração de buprenorfina. Os ratos nunca deve atingir os parâmetros previamente estabelecidos e aceites pelo seu Conselho Animal Care. Você pode querer procurar aconselhamento e ajuda de seu técnico de biotério de animais cuidados. </li></ol> 4. Manuseio de Linfonodo <ol><li> No laboratório, para obter uma suspensão de célula única, dissociar o LN como por sua procedimento habitual. Nós pressionamos LN contra lâminas foscas e rotineiramente obter 1-2 x 10 6 células por LN. Alternativamente, podemos preparar o LN para a extração de RNA. </li><li> Corar as células de acordo com o protocolo usual. Você deve obter esperados LN perfis de citometria de fluxo. </li></ol> 5. Os resultados representativos Um exemplo de p dispersão frontal e laterallote é mostrado para LNs colhidas a partir de um rato anestesiado por cirurgia ou a partir de um rato sacrificado (Figura 2). O perfil e as percentagens de células na porta vivo de linfócitos são os mesmos que demonstra que a cirurgia LN é uma técnica apropriada para as células de colheita. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3444/3444fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Inguinal e localização LN braquial no mouse. A. A LN inguinal está localizado logo acima da pata traseira, um pouco em direção à barriga. B. A LN braquial está localizado atrás da pata dianteira. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3444/3444fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Perfil de citometria de fluxo de linfócitos obtidos após a cirurgia LN. Perfis de dispersão frontal e lateral são mostrados para linfonodos colhidos a partir de um Anesthrato etized por cirurgia (A) ou de um rato sacrificados (B). LNs foram colhidas, dissociados e analisadas num citómetro de fluxo. As percentagens de células na porta vivo de linfócitos são mostrados. </pclasse>

<ol><li>Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+but+curtailed+T-cell+response+to+very+low-affinity+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen.</a> Nature. 458, 211-214 (2009).</li>
<li>Vezys, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+CD8+T-cell+compartment+grows+in+size+with+immunological+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience.</a> Nature. 457, 196-199 (2009).</li>
<li>Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+persistence+of+memory+CD8%28%2B%29+T+cells+depend+on+T+cell+factor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1.</a> Immunity. 33, 229-240 (2010).</li>
<li>Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+central+memory+CD8+T+cells+is+independent+of+CD62L-mediated+trafficking+to+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes.</a> J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).</li>
<li>Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+complementation+of+MHC+class+II+deficiency+by+intrathymic+delivery+of+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses.</a> Immunity. 7, 123-134 (1997).</li>
<li>Witherden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline-controllable+selection+of+CD4%28%2B%29+T+cells%3A+half-life+and+survival+signals+in+the+absence+of+major+histocompatibility+complex+class+II+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules.</a> J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).</li>
<li>Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+much+TCR+does+a+T+cell+need%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">How much TCR does a T cell need.</a> Immunity. 15, 71-82 (2001).</li>
<li>Leignadier, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+density+influences+CD8%2B+memory+T+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation.</a> PLoS One. 5, e13740(2010).</li>
<li>Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T-lymphocyte+survival+does+not+require+T-cell+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).</li>
<li>Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+persistence+is+required+throughout+the+expansion+phase+of+a+CD4%28%2B%29+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response.</a> J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).</li>
<li>Bassett, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-cell+expansion+and+maintenance+after+recombinant+adenovirus+immunization+rely+upon+cooperation+between+hematopoietic+and+nonhematopoietic+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells.</a> Blood. 117, 1146-1155 (2011).</li>
<li>Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+receptor+expression+levels+do+not+identify+CD8%2B+memory+T+lymphocyte+precursors+following+peptide+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization.</a> J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).</li>
<li>Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lowering+TCR+expression+on+naive+CD8%2B+T+cells+does+not+affect+memory+T-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation.</a> Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós descrevemos um protocolo de cirurgia LN que pode ser aplicado a muitos sistemas experimentais. Embora muito útil para acompanhar as respostas imunes ou homeostase de células imunes, esta técnica tem algumas limitações. Em primeiro lugar, apenas quatro LNS pode ser colhido. Em segundo lugar, a resposta imune deve ser estudada sistémica ou ocorrer nas inguinais superficiais ou braquial (pele de drenagem) LNS. Finalmente, o número de células colhidas é influenciada pela qualidade da remoção LN, uma limitação técnica, q...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Pinça Graefe premium Belas Padrão </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 52-2144 </td><td> Fortemente curvada, 10 cm (4 polegadas), 0,8 milímetros de ponta </td></tr><tr><td> Clipe Michel aplicação e remoção de Pinças </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 52-3779 </td><td> 12,5 cm (5 cm) </td></tr><tr><td> Michel clip 100 </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 52-3746 </td><td> 7,5-1,75 milímetros </td></tr><tr><td> Temgesic (cloridrato de buprenorfina) </td><td> Schering-Plough </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vetalar (cloridrato de ketamina) </td><td> Boniche animal Healthcare </td><td></td><td> DIN: 01989529 </td></tr><tr><td> Rompun (Xylazina) </td><td> Bayer </td> &lt;td&gt; </td><td> DIN: 02169592 </td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> ABBOTT </td><td></td><td> DIN: 02032384 </td></tr><tr><td> Hypotears pomada </td><td> Novartis Ophtalmics </td><td></td><td> DIN: 02133288 </td></tr><tr><td> Baxedin (clorexidina gluconato 2% em álcool isopropílico a 70%) </td><td> Ómega </td><td> L0000017 </td><td> DIN: 02251477 </td></tr></tbody></table>

cirurgia nó murino superficial linfático

Murine Superficial Lymph Node Surgery

No campo da imunologia, para compreender a progressão de uma resposta imunitária contra uma vacina, uma infecção ou um tumor, a resposta é muitas vezes seguida ao longo do tempo. Do mesmo modo, o estudo da homeostase de linfócitos, requer a realização do curso de tempo. Realização destes estudos, dentro do mesmo rato é ideal para reduzir a variabilidade experimental, bem como o número de ratinhos utilizados. Retirada de sangue permite realização de experimentos do curso de tempo, mas ele só dá informações sobre linfócitos circulantes e fornece um número limitado de células 1-4. Uma vez que os linfócitos circulam pelo corpo e que residem nos gânglios linfáticos têm propriedades diferentes, é importante examinar ambos os locais. A remoção sequencial de nódulos linfáticos por cirurgia proporciona uma oportunidade única para seguir uma resposta imune ou expansão de células imunes no mesmo rato ao longo do tempo. Além disso, esta técnica produz entre 1-2x10 células por 6 nó de linfa que é suficiente para perform caracterização fenotípica e / ou ensaios funcionais. Cirurgia nó de linfa ou seqüencial linfadenectomia foi usada com sucesso por nós e outros 5-11. Aqui, nós descrevemos como os nódulos linfáticos inguinais braquial e pode ser removido através de uma pequena incisão na pele de um rato anestesiado. Desde a cirurgia é superficial e feito rapidamente, o mouse se recupera muito rapidamente, é que cura bem e não sentir dor excessiva. Cada segundo dia, é possível colher um ou dois nódulos linfáticos, permitindo para experiências de curso de tempo. Esta técnica é portanto adequado para estudar as características de nódulo linfático que residem linfócitos ao longo do tempo. Este método é adequado para vários projetos experimentais e acreditamos que muitos laboratórios se beneficiariam de realização de cirurgias seqüenciais nó de linfa.

Para seguir a progressão de uma resposta imune ao longo do tempo dentro do mesmo rato, gânglios linfáticos pode ser sequencialmente removido por cirurgia. Aqui, nós descrevemos como esta técnica pode ser realizada.

Cirurgia Nó murino superficial linfático

No campo da imunologia, para compreender a progressão de uma resposta imune contra uma vacina, uma infeção ou um tumor, a resposta é frequentemente...

O objetivo geral deste procedimento é remover cirurgicamente os linfonodos de um camundongo anestesiado. Isso é realizado primeiramente localizando os linfonodos. Os linfonodos são coletados e, em seguida, a incisão é fechada.Finalmente, pode-se obter uma suspensão de células isoladas para análise experimental. Em última instância, as populações viáveis de linfócitos podem ser avaliadas por citometria de fluxo. A demonstração visual desta técnica é essencial, pois a localização e remoção dos linfonodos precisam ser observadas para que sejam dominadas.Após anestesiar o camundongo, aplique pomada nos olhos, injete buprenorfina e confirme a sedação por meio do aperto no dedo do pé, então posicione o camundongo de lado. Primeiro, localize o linfonodo braquial e, em seguida, retire os pelos da região a ser dissecada. Após remover os pelos soltos, aplique um desinfetante na região e, então, faça uma pequena incisão de cerca de cinco milímetros na parte traseira da pata traseira.Use dois pares de pin&ccedil;as para esticar a incis&atilde;o at&eacute; que o n&oacute; linf&aacute;tico braquial, que pode apresentar colora&ccedil;&atilde;o acinzentada ou mais escura que a gordura circundante, fique vis&iacute;vel. Em seguida, segure a f&aacute;scia que r

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Uma técnica para a realização de microscopia intravital do linfonodo inguinal (LN) é descrito. Tal técnica permite em tempo...

Microscopia intravital do linfonodo inguinal

Este vídeo demonstra o procedimento de isolamento cirúrgico do linfonodo de drenagem inguinal de um modelo de camundongo. A incisão da região abdominal fornece acesso ao linfonodo inguinal, que é colhido cirurgicamente. O linfonodo inguinal translúcido colhido pode ser usado para estudos imunológicos.

Colhendo um linfonodo de drenagem inguinal de um modelo murino

Aqui, descrevemos uma técnica laparoscópica minimamente invasiva para a amostragem de série do fígado e linfonodos mesentéricos (MLN) em macacos que permite o aumento da frequência de amostragem, e reduz o potencial de complicações cirúrgicas quando comparada a realização de uma laparotomia.

Técnica laparoscópica para a coleção de série do fígado e mesentérica linfonodos em macacos

Este protocolo descreve uma técnica para populações diferentes da pilha da imagem em drenar nós de linfa sem alterações na estrutura do órgão.

Visualizando estrutura de linfonodos e localização celular usando microscopia confocal ex-vivo

Este modelo animal permite que os investigadores induzam o linfedema secundário estatìstica significativo no retrospecto dos ratos, durando pelo menos 8 semanas. O modelo pode ser usado para estudar a fisiopatologia do linfedema e para investigar novas opções de tratamento.

Um método revisado para induzir o linfedema secundário no hindlimb dos ratos

Um protocolo para bloquear o fluxo linfático por sutura cirúrgica de vasos linfáticos diferentes é apresentado.

Bloqueando o fluxo linfático suturing afferent vasos linfáticos em camundongos

Linfedema é inchaço na extremidade causado por disfunção linfática. Descrevemos um modelo crônico de cauda murina de linfedema e o novo uso da tecnologia de nanotransfescção de tecido (TNT) para entrega genética de carga na cauda.

Um modelo de linfedema de cauda murina

O presente protocolo descreve um modelo murino de ablação de inervação adrenérgica através da identificação e ressecção do gânglio cervical superior.

Técnica cirúrgica para ganglionectomia cervical superior em modelo murino

Esse protocolo descreve um procedimento de sobrevivência para linfadenectomia renal bilateral murina segura e bem tolerada.

Linfodenectomia Renal Bilateral Murina

Este protocolo descreve um procedimento de sobrevivência para linfadenectomia mesentérica murina segura e bem tolerada em cada uma das quatro estações ao longo da cadeia do linfonodo mesentérico. Esse procedimento é adaptável para permitir a interrupção seletiva da comunicação linfática com o cólon distal, cólon proximal e/ou intestino delgado.

Linfodenectomia mesentérica murina para interrupção seletiva da comunicação linfática com intestino específico de região

Aprenda a técnica cirúrgica para remoção sequencial de linfonodos em camundongos anestesiados. Este método permite rastrear respostas imunes ao longo do tempo e obter suspensões celulares para análise por citometria de fluxo.

Cirurgia Nó murino superficial linfático

Explorar mais vídeos