Cirurgia Nó murino superficial linfático

O objetivo geral deste procedimento é remover cirurgicamente os gânglios linfáticos de um camundongo anestesiado. Isso é feito localizando primeiro os gânglios linfáticos. Os gânglios linfáticos são colhidos e, em seguida, a incisão é fechada.

Finalmente, uma única suspensão celular pode ser obtida para análise experimental. Em última análise, populações de linfócitos viáveis podem ser avaliadas por citometria de fluxo. A demonstração visual dessa técnica é crítica, pois a localização e a remoção dos linfonodos precisam ser visualizadas para serem dominadas.

Depois de anestesiar o mouse, aplique pomada para os olhos, injete buprenorfina e confirme a sedação beliscando o dedo do pé, depois vire o mouse de lado. Primeiro, localize o linfonodo braquial e, em seguida, raspe a região a ser dissecada. Depois de escovar os pelos soltos, aplique um desinfetante na região e faça uma pequena incisão de cerca de cinco milímetros na parte de trás das quatro pernas.

Use dois pares de pinças para esticar a incisão até que o linfonodo braquial, que pode parecer acinzentado ou mais escuro do que a gordura circundante, possa ser visto. Em seguida, aperte a fáscia que cobre o linfonodo com um par de pinças. Coloque o segundo par de pinças o mais abaixo possível do linfonodo e puxe levemente a membrana sem quebrar o tecido circundante.

Em seguida, use o primeiro par de pinças para quebrar a fáscia e remover o linfonodo. Se o linfonodo foi colhido com sucesso, uma mancha de sangue aparecerá onde o linfonodo estava localizado anteriormente. Coloque o linfonodo excisado em uma solução isotônica se ele afundar, isso confirmará que o tecido colhido é um linfonodo e não gordura.

Em seguida, verifique se não há pelos na ferida e feche a incisão colando as duas partes internas da pele e grampeando-as com um a dois clipes, dependendo do tamanho da incisão. Agora localize um linfonodo inguinal e raspe a região a ser dissecada. Depois de escovar os pelos soltos, aplique um desinfetante na região e faça uma pequena incisão de cerca de cinco milímetros acima da pata traseira, perto do abdômen.

Depois de abrir a incisão com dois pares de pinças, conforme mostrado para o linfonodo braquial, identifique o linfonodo inguinal aninhado no tecido adiposo circundante. Em seguida, remova o linfonodo com os dois pares de pinças, conforme demonstrado. Novamente, confirme a colheita bem-sucedida do linfonodo observando a mancha de sangue que aparece onde o linfonodo estava localizado anteriormente e, em seguida, coloque o linfonodo inguinal em um recipiente separado de solução isotônica.

Depois que todos os gânglios linfáticos forem colhidos, coloque o camundongo em uma gaiola e adicione comida úmida para que o camundongo possa se alimentar facilmente. Após a cirurgia, cerca de seis a oito horas depois, verifique o mouse para garantir que ele não esteja sentindo dor. Observe cuidadosamente que a postura, a interação da marcha com o congênito e a aparência do pelo são semelhantes às de um camundongo normal e saudável.

Finalmente, dissocie o linfonodo pressionando-o contra lâminas foscas em uma placa de Petri e, em seguida, transfira-o para um tubo para obter uma suspensão de célula única. Depois de corar as células para os antígenos de superfície celular de interesse, analise as células por citometria de fluxo. Aqui, amostra para frente e para os lados, gráficos de dispersão são mostrados para linfonodos colhidos de animais anestesiados ou sacrificados.

Os perfis e porcentagens de células nas portas de linfócitos vivos dos dois gráficos de dispersão são os mesmos. Demonstrando que a cirurgia de linfonodos é uma técnica apropriada para colher células Uma vez dominada a cirurgia de linfonodos pode ser feita em cinco a 10 minutos por camundongo, se for realizada corretamente.