Name: Espectrometria de Massa MALDI imagem de neuropeptídeos na Doença de Parkinson (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 57 s
Description: Aprenda a usar espectrometria de massa MALDI imagem para mapear neuropeptídeos em cérebros de ratos com doença de Parkinson. Este método permite localizar alterações induzidas por tratamento com alta especificidade molecular.

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Agradecemos Hanna Warner para contribuir os dados para a Figura 3 e Jonas Prof Bergquist de valiosa contribuição. O sueco Research Council (Grant 522-2006-6416 (MA), 521-2007-5407 (MA); Fundação Wiberg Åke (MA, JH), A Academia Real Sueca de Ciências (MA, JH), eo Chemical sueco Society (JH) são agradecem pelo apoio financeiro.

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Existem várias vantagens do emprego de espectrometria de massa MALDI imagem no estudo de neuropeptídeos. Uma análise isenta de dados de MS pode revelar que os núcleos cérebro apenas específico, ou como nos resultados aqui apresentados, onde apenas a parte dorsolateral do estriado é associado com uma determinada condição fisiopatológica. Ao reter a informação espacial é então possível para redefinir regiões de interesse para executar a análise estatística com maior sensibilidade e menor variabilidade em comparação com a análise de secções de cérebro inteiro ou através de estudos de tradicionais peptidomics em extractos de péptidos. Além disso, é importante compreender MALDI IMS prontamente pode detectar anteriormente desconhecidos modificações pós-translacionais, mas análises estruturais devem seguir para determinar as posições de aminoácidos exactas que são modificados. Armadilhas comuns em visualizar os dados MALDI IMS incluem o mapeamento da intensidade do pico máximo de uma escala linear óptico de blACK (0%) para a cor (100%) para todos e cada secção da série experimental (Figura 3), em vez de mapear todas as secções de uma escala comum absoluto onde 100% é a intensidade do pico máximo de todas as secções (Figura 5) . O último método permite a comparação de dados de grupo e visualização das diferenças entre os grupos de tratamento. Um grande obstáculo na análise de MALDI IMS é a atribuição de peptídeos para picos de massa específicos. Em tecido-espectrometria de massa em tandem, às vezes é possível, mas muitas vezes torna-se bastante difícil 13,14. Nós descobrimos que uma abordagem mais tradicional, incluindo um fraccionamento preparativa em cromatografia de permuta catiónica forte, seguido por LC-MS/MS de fase reversa pode ser usado para neuropeptídeos com sucesso de sequência muitos péptidos e especialmente de opióides. Ainda não é incomum para obter boa qualidade espectros MS / MS que não encontrou nenhum entradas de banco de dados usando os motores de busca comuns, tais como mascote. Nestes casos, de novo seqüenciamento-mão é o onlopção y. A prova definitiva da identidade de pico pode ser obtido por MALDI IMS de secções de tecido a partir do rato knockout adequado, mas isto não é sempre disponível ou possível. Uma alternativa é a validar os resultados através de um método diametralmente diferente, por exemplo por imunotransferência Western ou imuno-histoquímica. Isto pode frequentemente incluir o aumento de anticorpos e uma quantidade significativa de trabalho validar os novos anticorpos. A estratégia geral apresentado neste protocolo é otimizado para grandes escalas de neuropeptídeos experimentos MALDI IMS, incluindo várias seções e das condições experimentais. O protocolo foi optimizado especialmente para peptídeos opióides e terá grande impacto em estudos futuros, como empregado em diversas áreas da investigação, incluindo a dor e mecanismos subjacentes a resposta endógena para drogas de vício.

1,1 coleta de amostras e preparação <ol><li> Isoflurano (Apoteksbolaget AB, Suécia) </li><li> Os instrumentos cirúrgicos, dois pares de tesouras, uma Rongeur, espátula </li><li> Finamente trituradas gelo seco </li><li> Folha de alumínio e sacos plásticos para o armazenamento </li><li> Criostato (Microm, Heidelberg, Alemanha) </li><li> Índio-estanho óxido (ITO)-revestidos lâminas MALDI (Bruker Daltonics, Alemanha) </li><li> médio da temperatura ideal de corte (PTU) (Sakura Finetek Europa, Países Baixos) </li><li> exsicador de vácuo </li></ol> 1,2 aplicação Matrix <ol><li> Acetonitrilo (ACN), metanol (MeOH), etanol (EtOH) de pró-análise grau (Merck, Alemanha). </li><li> Ácido trifluoroacético (TFA) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). </li><li> A água foi purificado com um sistema de purificação de água Milli-Q (Millipore, Bedford, MA). </li><li> CHIP-1000 (Shimadzu, Japão) ou Retrato 630 removedor (LabCyte, Sunnyvale, CA) </li></ol> 1,3 espectrometria de massa <ol><li> Ultraflex II (Bruker Daltonics) </li><li> O software FlexImaging (v 2,0, Bruker Daltonics) </li><li> Péptido ou proteína padrão de calibração (Bruker Daltonics) </li></ol> 1,4 processamento de dados <ol><li> Origem V.8.1 (OriginLab Corp, Norhampton, MA) </li><li> Matlab versão 7.9.0.529 (MathWorks, Natick, MA) </li><li> pBin ( <a href="http://www.vicc.org/biostatistics/software.php" target="_blank">http://www.vicc.org/biostatistics/software.php</a> ) </li></ol> 1,5 identificação Neuropeptídeo <ol><li> Sonicador ultra-som </li><li> 10 kDa de peso molecular de corte de filtro (Millipore, Bedford, MA) </li><li> SP Sephadex C 25 gel (Sigma, Alemanha) </li><li> Hypersil coluna (ThermoFisher) </li><li> Piridina, ácido fórmico (FA), acetonitrilo (ACN), metanol (MeOH), etanol (EtOH) de pró-análise grau (Merck, Alemanha). </li><li> Ácido trifluoroacético (TFA) Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA). </li><li> Agilent 1100 nanofluxo LC, microWPS, coluna C18 (0,075x150mm) </li><li> Agilent 1100 Micro-fractioncollector, placa-alvo Prespotted anchorchip (Bruker Daltonics) </li><li> BioTools software (v 3.1 SR2, Bruker Daltonics) </li><li> Bio software Works (v.3.3, Thermo Fisher; <a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank">www.thermoscientific.com</a> ) </li><li> Software Mascote (v 2.2, MatrixScience; <a href="http://www.matrixscience.com" target="_blank">www.matrixscience.com</a> ) </li><li> Swepep banco de dados ( <a href="http://www.swepep.org" target="_blank">www.swepep.org</a> ) </li></ol>

espectrometria de massa maldi imagem de neuropeptídeos na doença de parkinson

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI imagem espectrometria de massa (IMS) é uma abordagem poderosa que facilita a análise espacial das espécies moleculares em amostras de tecidos biológicos 2 (Fig.1). A 12 uM secção de tecido fino é coberto com uma matriz de MALDI, o que facilita a dessorção e ionização de peptídeos e proteínas intactas que podem ser detectadas com um analisador de massa, tipicamente usando um TOF MALDI / TOF espectrómetro de massa. Geralmente centenas de picos podem ser avaliados em uma única secção de tecido de cérebro de rato. Em contraste com as técnicas de imagem comumente utilizados, esta abordagem não requer conhecimento prévio das moléculas de interesse e permite a análise não supervisionada e abrangente de múltiplas espécies moleculares, mantendo a especificidade molecular elevado e sensibilidade 2. Aqui nós descrevemos um método MALDI IMS baseada na elucidação de perfis específicos de cada região de distribuição de neuropeptídeos no cérebro do rato da doença de um modelo animal de Parkinson (DP). PD é uma doença neurodegenerativa com uma prevalência de 1% para pessoas acima de 65 anos de idade 3,4. O tratamento mais comum sintomática baseia-se na reposição de dopamina uso de L-DOPA 5. No entanto, esta é acompanhada de efeitos colaterais graves, incluindo movimentos involuntários anormais, chamadas de L-DOPA induzida discinesias (LID) 1,3,6. Um dos mais proeminente mudança molecular em LID é uma regulação positiva do mRNA opióide precursor prodynorphin 7. Os peptídeos dinorfina modulam a neurotransmissão em áreas do cérebro que são essencialmente envolvidas no movimento de controle 7,8. No entanto, até à data os péptidos opióides exactas que se originam de processamento do precursor de neuropeptídeo não foram caracterizadas. Portanto, utilizamos MALDI IMS em um modelo animal da doença de Parkinson e experimental L-DOPA discinesia induzida. MALDI imagiologia espectrometria de massa mostrou ser particularmente vantajoso em relação à caracterização neuropeptídeoção, uma vez que as abordagens de anticorpos normalmente utilizados baseados alvo sequências peptídicas conhecidas e anteriormente observadas modificações pós-translacionais. Por outro lado MALDI IMS pode desvendar novos produtos de processamento de peptídeos e, assim, revelar novos mecanismos moleculares de modulação neuropeptídeo de transmissão neuronal. Embora a quantidade absoluta de neuropeptídeos não pode ser determinado por MALDI IMS, a abundância relativa dos iões de péptidos pode ser delineada a partir dos espectros de massa, dando cerca de alterar os níveis de conhecimentos na saúde e na doença. Nos exemplos aqui apresentados, as intensidades de pico de dinorfina B, alfa-neoendorphin e substância P foram encontrados para ser significativamente aumentada no dorsolateral, mas não o corpo estriado, dorsomedial de animais com disquinésia grave envolvendo tronco, facial e músculos orolingual (Fig. 5). Além disso, MALDI IMS revelou uma correlação entre a gravidade da discinesia e os níveis de des-tirosina alfa-neoendorphin, representando um mecanismo previamente desconhecido de inactivação funcionalvação de dinorfinas no estriado como a remoção de N-terminal da tirosina reduz a capacidade da dinorfina do receptor opióide ligação 9. Este é o primeiro estudo sobre a caracterização neuropeptídeo em LID utilizando MALDI IMS e os resultados destacam o potencial da técnica para aplicação em todos os campos da pesquisa biomédica.

Farmacoterapia de reposição de dopamina uso de L-DOPA é o tratamento mais comumente utilizado sintomático da doença de Parkinson, mas é acompanhado por efeitos secundários, incluindo movimentos involuntários anormais, discinesia denominado<sup&gt; 1</sup&gt;. Aqui, um protocolo para imagiologia espectrometria de massa MALDI é apresentado que detecta alterações nos níveis de cérebro de rato de neuropeptídeos relacionadas com discinesia.

Espectrometria de Massa MALDI imagem de neuropeptídeos na Doença de Parkinson

A espectrometria de massas por imagem (IMS) MALDI é uma abordagem poderosa que facilita a análise espacial de espécies moleculares em amostras de tecidos biológicos2 ...

O principal objetivo deste procedimento é elucidar a distribuição espacial de neuropeptídeos, especificamente peptídeos opióides, diretamente em cortes finos de cérebro utilizando espectrometria de massa por imagem com molde. Isso é realizado primeiramente coletando cortes teciduais de 12 micrômetros de cérebro de rato congelado rapidamente e, em seguida, montando-os sobre lâminas de vidro condutivas. O segundo passo consiste em aplicar a Matriz com molde em arranjos sobre os cortes utilizando uma impressora química jato de tinta, e então adquirir um espectro de massa de cada ponto da matriz.Em seguida, vários picos de peptídeos são visualizados para garantir o sucesso geral do experimento. Isso é seguido pela inspeção e processamento da exportação dos espectros de massa e pelo pós-processamento dos dados de peptídeos e avaliação estatística. O passo final é analisar e validar os dados de peptídeos obtidos por espectrometria de massas com imagem de mofo.No fim das contas, os resultados mostram diferenças significativas nos níveis relativos de peptídeos opioides em diferentes áreas do cérebro entre os diversos grupos tratados. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como abordagens baseadas em imunoensaio radioativo ou em géis SAO, é que a imagem múltipla permite a localização de alterações induzidas pelo tratamento, mantendo alta especificidade molecular. Isso, por sua vez, nos fornece a possibilidade de detectar, pela primeira vez, truncamentos não detectados anteriormente em modificações pós-traducionais.Indivíduos novos neste método terão dificuldades no início porque a técnica exige preparação profunda da amostra e processamento de dados. Aqui, o foco será na qualidade do tecido, da matriz, protocolo de aplicação, avaliação dos dados e nos experimentos subsequentes de validação. É essencial trabalhar rapidamente e com diligência durante a dissecação do tecido para evitar a degradação proteolítica.Após sacrificar o rato de acordo com os protocolos aprovados, remova imediatamente o cérebro, transfira-o para gelo seco em pó e deixe o cérebro congelar relativamente devagar; em seguida, armazene o cérebro no congelador a menos 80 graus Celsius. Os cérebros inteiros podem ser armazenados por vários anos antes do corte, sem perda na qualidade do sinal de espectrometria de massas. Quando estiver pronto para iniciar o procedimento, monte o cérebro no suporte utilizando meio de inclusão (Tissue-Tek), evitando a contaminação da região do cérebro que será cortada, pois o meio de inclusão interfere na ionização e dessorção de peptídeos.Corte o tecido congelado em um micrótomo criostato em fatias de 12 mícrons e monte as seções teciduais em lâminas condutivas de vidro MALDI. A coloração das seções teciduais pode ser realizada neste momento e a qualidade do tecido pode ser inspecionada. Esta figura mostra a coloração com violeta de genciana em tecido cerebral congelado rapidamente em nitrogênio líquido, o que causou rachaduras e rasgos no tecido.Este tecido não seria apropriado para espectrometria de massas por imagem de alta resolução, pois a matriz se espalhará e não cristalizará uniformemente. Seque as seções por 15 minutos sob vácuo e armazene as lâminas a menos 80 graus Celsius até uso posterior. As seções de tecido devem ser analisadas no menor tempo possível após o corte, mesmo quando armazenadas a menos 80 graus Celsius. Primeiro, descongele as seções em um dessecador por uma hora, depois lave as lâminas com as seções em etanol 70% à temperatura ambiente por 10 segundos, seguido de duas lavagens em etanol 95% à temperatura ambiente por 10 segundos cada. Após a lavagem, seque as lâminas em um dessecador por 10 minutos.Examine os cortes ao microscópio para garantir que os cortes de tecido sejam de boa qualidade, sem distorção tecidual, microfissuras ou rachaduras pequenas que possam comprometer a qualidade da EMS do molde. Em seguida, prepare uma solução matricial fresca contendo 50 miligramas por mililitro de DHB e 50% de metanol, 10% de acetato de amônio 150 milimolar e 0,3% de ácido trifluoroacético em água. Digitalize o porta-lâminas de vidro com o corte de tecido e alinhe o suporte aos respectivos pontos de referência utilizando a função de análise de imagem no software do chip.Em seguida, selecione os parâmetros apropriados de aplicação da matriz para a região cerebral e para os analitos-alvo. Depois, especifique a resolução espacial. Aplique agora a matriz utilizando o protocolo otimizado na impressora química Jett.Analise as seções finais com pontos de matriz e salve a imagem antes da requisição de múltiplos dados. Isso será usado posteriormente para cruzar os depósitos de matriz com as coordenadas do motor da plataforma maldi. Se não forem usadas imediatamente, as seções com pontos de matriz podem ser armazenadas em um dessecador sob vácuo até serem necessárias.Para a maioria dos experimentos, várias seções serão analisadas ao mesmo tempo, como visto aqui. Cada suporte de lâmina acomoda duas lâminas de vidro e, portanto, múltiplos conjuntos de duas devem ser analisados para todos os suportes. Os métodos e parâmetros de aquisição de TOF do molde devem ser os mesmos; no entanto, as calibrações de massa de peptídeos devem ser verificadas para cada lâmina.Em seguida, otimize os parâmetros de aquisição na amostra de tecido, incluindo o foco do laser e a intensidade do laser. Depois, insira o número de disparos necessários para obter um sinal de EM ideal sem elevar a linha de base, o que reduziria a resolução dos picos. Sature o detector ou ablate a matriz de depósitos de matriz vizinhos e selecione o movimento do laser.Estime o número máximo de disparos que podem ser realizados por ponto da matriz até que apenas ruído seja detectado aqui. São acumulados 600 disparos de cada depósito de matriz em etapas de 25 disparos, perfazendo um total de 24 etapas, utilizando um padrão aleatório de movimentos. Correlacione os varredores de todas as seções pontilhadas com as coordenadas do motor da plataforma MALDI utilizando o software flex imaging.Em seguida, utilizando um software de execução automática em lote, realize a aquisição de dados em modo de lote. Use ferramentas de visualização de dados, como o Flex Imaging, para inspecionar visualmente as imagens IMS de Maori e avaliar as distribuições de intensidade dos picos, determinando se essas distribuições estão relacionadas a características do tecido, à qualidade da deposição ou a efeitos de normalização. Este exemplo mostra a distribuição de 10 picos peptídicos diferentes em nove animais distintos.A corrente total de íons ou TIC, utilizada para normalização, é exibida em branco. A TIC é a soma de todos os valores de intensidade em um espectro de massas. O valor da TIC é muito baixo no animal três, e as imagens dos peptídeos mostram mais ruído do que informação específica.O cérebro do animal número seis exibe uma área na parte inferior da seção com valores muito altos de TIC. Isso se reflete em intensidades anormalmente elevadas nessa região das imagens de peptídeos, C e D. Esse é um efeito potencial de super-normalização que pode influenciar a análise de dados. Efeitos de super-normalização podem levar a resultados imprecisos se estiverem presentes especificamente em apenas um grupo de tratamento.Neste exemplo, a CIT é significativamente mais alta para o grupo C, o que pode afetar anormalmente as intensidades individuais dos picos. Por exemplo, a intensidade média do pico para citocromo C é maior para o grupo C do que para o grupo B nos dados brutos, mas após a normalização, a intensidade do pico agora é menor. Para o grupo C, isso pode levar a interpretações errôneas sérias dos resultados.É importante sempre calcular a média da CIT para cada grupo de tratamento antes de prosseguir com a validação extensiva dos dados. Em seguida, para definir a região de interesse, é fundamental considerar que o RNA mensageiro da pro dinorfina é traduzido no peptídeo pró-hormônio de 14 quilodaltons da pro dinorfina. Em neurônios estriados, a pro dinorfina é empacotada em vesículas que são transportadas pelos dendritos para atingir outros neurônios estriados, e pelos axônios até a substância negra, a vários milímetros do corpo celular.As vesículas contêm enzimas que processam ainda mais o propeptídeo em peptídeos di-norfina, como a alfa-neo-endorfina di-norfina A ou di-norfina B. Cada um pode ativar diferentes receptores opiáceos ao liberar a estrutura-alvo, a substância negra; as dinorfinas são posteriormente processadas e eliminadas por endopeptidases e exopeptidases. Alguns desses peptídeos só podem ser detectados por espectrometria de massas, pois os anticorpos existentes direcionam-se apenas à extremidade C-terminal dos peptídeos e não à extremidade N-terminal. A sequência Y-G-G-F-L, responsável pela ativação do receptor opioide, as células produtoras de di-norfina residem no núcleo AUM e projetam-se para a substância negra.Portanto, no experimento a seguir, tanto o AUM quanto a substância negra foram analisados por IMS com mapeamento espacial, obtendo-se espectros de cada região de interesse. O AUM estriatal dorsomedial e dorso lateral, bem como as regiões medial e lateral da substância negra, foram definidos no software de análise Flex e exportados para análise de dados. Para redução dos dados, realize a detecção de picos utilizando ferramentas de identificação de picos incluídas em diferentes softwares.Por exemplo, utilize a análise de picos no Origin ou MS Peaks no Matlab. Exporte a lista de picos de todos os espectros como um único arquivo de texto delimitado por tabulação, determine as bordas inicial e final dos picos. Usando um software como o P bin do freeway, calcule a área sob a curva entre as bordas dos picos e utilize esses valores para análise estatística. A reprodutibilidade por espectrometria de massas entre grupos de tratamento pode ser avaliada calculando-se a média do traçado de MS e o erro padrão para cada valor de massa.Neste exemplo, os espectros médios da substância negra controle intacta serão utilizados para avaliar a variabilidade ao longo da faixa de massa analisada. Uma boa reprodutibilidade pode ser observada, pois as intensidades dos picos são iguais em ambos os grupos controle e o desvio padrão é baixo. Isso garante uma análise estatística válida.Se os conjuntos de dados apresentarem um alto grau de variação, quase sempre é necessário repetir o experimento Maori IMS, reduzindo ao máximo as fontes experimentais de variação. Normalmente, processamos o maior número possível de seções e animais em uma única sessão, às vezes incluindo várias pessoas trabalhando em turnos. No entanto, em alguns casos, isso ainda não é suficiente e outras estratégias podem ser empregadas.Por exemplo, se alguns espectros consistirem em ruído, estes podem ser identificados traçando a distribuição de frequência da TIC, e um valor de limiar de corte pode ser usado para eliminar dados subótimos. Outra maneira de avaliar os dados é traçar todos os picos de dois animais dentro do mesmo grupo um contra o outro. Se as intensidades dos picos forem iguais em ambos os animais, o gráfico de intensidade exibe uma linha estreita e reta.Se um animal apresentar dados espectrais de baixa qualidade, o gráfico normalmente exibe desvios assimétricos em relação à linha reta, como visto à direita. Para a identificação da sequência de peptídeos, realize análise de peptídeos em extratos de tecido cerebral de rato utilizando cromatografia líquida multidimensional acoplada à espectrometria de massas de alta resolução. Resumidamente, neuropeptídeos são extraídos de seções cerebrais de rato e pré-fracionados por meio de cromatografia de troca catiônica forte.As diferentes frações são então separadas adicionalmente utilizando HPLC de fase reversa em fluxo nano. Em seguida, caracterize os neuropeptídeos por meio de espectrometria de massas em tandem com ionização por eletrosspray, usando um instrumento híbrido com armadilha de íons linear e ressonância de ciclotron com transformada de Fourier; finalmente, realize a identificação da sequência de peptídeos por correspondência com banco de dados. Existem anticorpos específicos disponíveis para alguns neuropeptídeos, e experimentos de imunohistoquímica podem validar tanto a identificação dos peptídeos quanto os resultados experimentais. A resolução é superior à da espectrometria de massas por imagem Maori, e informações adicionais podem ser obtidas.Neste exemplo, fibras nervosas imunorreativas à abelha Dior podem ser observadas no hipocampo, painel superior esquerdo, e na substância negra, painel inferior esquerdo, enquanto a imagem IMS Maori na parte inferior direita revela a localização ao nível de diferentes áreas cerebrais. A prova definitiva de que um pico de massa pode ser inequivocamente atribuído a um peptídeo específico é realizar IMS moldado em animais knockout para o peptídeo, no camundongo knockout para a pronina. Vários picos, indicados pelas setas, estão ausentes no knockout, mas não no controle do tipo selvagem.Animais Picos de peptídeos não relacionados, como a substância P e a P ink, não exibem diferença entre animais knockout e controles. As intensidades dos picos de dinorfina B e alfa-neoendorfina estão significativamente aumentadas na lesão por seis-hidroxi-dopamina. O estriado parkinsoniano de animais altamente disquinésicos apresenta aumento, conforme indicado pelas setas, em comparação com os grupos controle de lesão e de baixa disquinesia.A análise estatística também revelou um aumento significativo para uma massa peptídica correspondente à alfa-neo-endorfina truncada, na qual a tirosina terminal foi removida. De fato, a inspeção visual dos resultados de imagem mostra uma alta colocalização dos peptídeos parentais di-norfina mostrados em verde, e seus metabólitos relacionados de DES-tirosina mostrados em vermelho; o amarelo indica sobreposição regional no painel de sobreposição à direita. O grande potencial desta técnica é destacado pelos achados relativos ao processamento seletivo de peptídeos em diferentes estruturas cerebrais que não podem ser detectados com outros métodos.Aqui, metabólitos específicos da tirosina de DES mostrados em vermelho, co-localizados com o peptídeo progenitor mostrado em verde, foram observados apenas no estriado, mas não na substância negra de ratos discinéticos. Na análise da imagem da substância negra, revelou-se que o produto de degradação Lu e Kelin Arch mostrado em vermelho estava inversamente localizado em relação à Di-norfina B mostrada em verde, indicando que durante a discinesia, a Di-norfina B foi liberada localmente na substância negra lateral e, em seguida, metabolizada para Lu e Cuidadoso em um sistema AR Um. Um único experimento utilizando imagem por molde pode ser realizado em um ou dois dias para preparação da amostra e aquisição de dados.Isso é seguido então por mais um ou dois dias para avaliação dos dados. Dependendo do tamanho da amostra, os experimentos de validação exigiriam mais um ou dois dias de experimentos práticos no laboratório, se realizados corretamente. É importante ter um cuidado especial nos seguintes passos.A dissecação e congelamento dos tecidos devem ser realizados rapidamente para evitar a degradação da pep, e o protocolo de lavagem e aplicação da matriz deve ser otimizado para cada experimento. A avaliação dos dados e a análise estatística devem ser realizadas com cuidado para evitar falsos positivos devido a efeitos de super-normalização ou detecções inadequadas de picos.

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