Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura

O objetivo geral do experimento a seguir é medir quantitativamente a organização subnuclear em células de levedura e como ela é afetada por alterações nas condições de crescimento ou por mutações. Isso é alcançado cultivando-se células de levedura até a fase logarítmica em condições que minimizem a autofluorescência. Em seguida, as células são colocadas em uma câmara de crescimento para visualização ao microscópio.

Em seguida, são obtidas imagens para medir a distância entre diferentes estruturas marcadas com fluorescência na célula. São obtidos resultados que mostram diferenças na organização não nuclear, dependentes da alteração das condições nutricionais durante o crescimento do cultivo de levedura. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de epigenética sobre a interação entre a organização subnuclear ou a cromatina e a regulação gênica.

Peixe e levedura iniciam preparando o meio mínimo de Edimburgo ou EMM e EMM com cloreto de amônio para reduzir a autofluorescência em vez de autoclavar. Use um filtro de 0,2 mícron para esterilizar a solução de glicose e adicione-a ao meio autoclavado. Inocule três mililitros de EMM em tubos de 30 mililitros com células de peixe e levedura.

Cultivadas recentemente em placa de ágar em meio rico, YEA tampe levemente os tubos e incube as células em agitador a 225 RPM e 30 graus Celsius. Mantenha as células em fase logarítmica por dois dias, contando-as com câmara de birka todas as manhãs e tardes e diluindo-as até a densidade apropriada. No dia do experimento.

As células devem estar em fase logarítmica inicial em relação à disponibilidade de nitrogênio. As células devem seguir o procedimento descrito no protocolo escrito para coletar as células em um único pellet no fundo de um tubo de centrífuga, utilizando 1,5 mililitro de células em um tubo eppendorf, com uma força centrífuga máxima de 1,5 RCF, girando primeiro o tubo por dois minutos e, em seguida, girando-o 180 graus para uma centrifugação adicional de dois minutos. Remova todo o sobrenadante, exceto 10 a 15 microlitros, e ressuspenda as células no meio remanescente, com uma alíquota de lectina filtrada e esterilizada na concentração de um miligrama por mililitro.

Adicione cinco microlitros de solução de lectina ao canto do lamínula e acrescente cinco microlitros de cultura à gota de lectina. Para criar uma câmara de crescimento de células S pom base, pipete cinco microlitros de EMM em uma lâmina limpa e inverta o lamínula com a cultura em um ângulo de 70 graus sobre o meio, deixando-o cair com a face superior voltada para baixo sobre o EMM para selar as bordas com graxa de silicone. Corte a extremidade larga de uma ponteira de 200 microlitros e conecte a extremidade estreita a uma seringa de dois mililitros.

Encha a seringa com aproximadamente um mililitro de graxa de silicone. Aplique uma fina linha de silicone nas bordas do cubre-objeto pressionando suavemente o êmbolo da seringa para montar a câmara de crescimento. Comece utilizando a imagem em campo claro para localizar as células e cavar.

Obtenha uma imagem nítida para microscopia confocal. Utilizamos um microscópio de varredura a laser Zeiss LSM 700 com uma objetiva de imersão em óleo plan apochromat 63 vezes e configuração de média de 16 linhas por varredura. Ajuste as unidades de área de um para 1,1 para obter uma fatia óptica de 0,8 mícrons.

Analise as células com lasers que detectam Alexa 488 e mCherry ou GFP. Registre imagens suficientes para realizar medições em 60 células para cada condição. Mude para uma nova câmara de crescimento com células frescas.

Após 60 minutos de aquisição de imagens, abra uma imagem no programa Zeen Light Edition para medir a distância entre os sinais de diferentes fluoróforos no mesmo plano focal. Abra a ferramenta de medição e ajuste a intensidade da luz e o contraste para identificar o centro de cada sinal fluorescente, por exemplo, o corpo do polo do fuso e a membrana nuclear, e meça a distância entre eles. Transfira os dados para uma planilha.

Compare as distâncias subcelulares médias ou medianas entre diferentes cepas e tratamentos utilizando software ou testes estatísticos, como o teste T ou o teste de soma de postos de Mann-Whitney. Neste exemplo, a cepa PJ 1 18 5 foi cultivada em EMM e uma amostra foi colocada em uma câmara de crescimento para imageamento. Em seguida, uma alíquota de PJ 1 18 5.

O cultivo foi transferido para EMMN e incubado por 15 minutos antes de uma amostra ser colocada em uma câmara de crescimento para imageamento. A ferramenta de medição foi usada para medir a distância entre o lócus e o corpo do polo mitótico, bem como entre o lócus e a membrana nuclear. Como mostrado aqui, houve uma diferença estatisticamente significativa na distância do agrupamento gênico ao se deslocar da membrana nuclear em direção ao corpo do polo mitótico nas células privadas de nitrogênio em comparação com as células cultivadas em nitrogênio.

Os dados que medem a distância entre a GFP e a SBP apresentaram distribuição normal, e, portanto, as distâncias médias puderam ser comparadas utilizando um teste T. Houve uma diferença significativa entre os dois valores médios. Os dados que medem a distância entre a GFP e o NM não apresentaram distribuição normal, e, portanto, as distâncias medianas foram comparadas utilizando um teste de soma de postos de Mann-Whitney.

Houve uma diferença significativa entre os dois valores medianos após a realização deste procedimento. Outros métodos, como a PCR em tempo real, podem ser realizados para responder a questões adicionais sobre como o nível de expressão gênica se correlaciona com as alterações na organização subnuclear.