Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura
January 23rd, 2012
A levedura de fissão, Pombe Schizosaccharomyces, É um sistema bom modelo para estudar os processos celulares básicos. Aqui nós descrevemos um método para realizar a análise quantitativa de células vivas de levedura. Neste experimento em particular nos concentramos na organização do genoma dentro do núcleo da célula, mas o método também pode ser usado para estudar os fatores citosólicos.
O objetivo geral do experimento a seguir é medir quantitativamente a organização subnuclear em células de levedura e como ela é afetada por mudanças nas condições de crescimento ou mutações. Isso é conseguido através do cultivo de células de levedura para registrar a fase em condições que minimizarão a autofluorescência. Em seguida, as células são colocadas em uma câmara de crescimento para visualização ao microscópio.
Em seguida, as imagens são tiradas para medir a distância entre diferentes estruturas marcadas com fluorescência na célula. São obtidos resultados que mostram diferenças na organização não nuclear, que é dependente da alteração das condições nutricionais durante o crescimento da cultura da levedura. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo epie sobre a interação entre a organização subar ou a cromatina e a regulação gênica.
Toul peixe e levedura começam preparando o meio mínimo de Edimburgo ou EMM e EMM com também cloreto de amônio para reduzir a autofluorescência em vez da autoclave. Use um filtro de 0.2 mícron para esterilizar a solução de glicose e adicione-a ao meio da autoclave. Inocular três mililitros de EMM em tubos de 30 mililitros com células de peixe e levedura.
Recém-cultivado em uma placa de ágar no meio rico, o YEA tampe levemente os tubos e incube as células em um agitador a 225 RPM e 30 graus Celsius. Mantenha as células em fase logarítmica por dois dias, contando-as com uma câmara birka todas as manhãs e noites e diluindo-as até a densidade apropriada. No dia do experimento.
As células devem estar em uma fase logarítmica inicial para a equipe de nitrogênio. As células referem-se ao procedimento descrito no protocolo escrito para coletar as células em um pellet no fundo de uma centrífuga de tubo, 1,5 mililitros de células em um tubo de eend orph a um máximo de 1,5 RCF, primeiro girando o tubo por dois minutos e, em seguida, girando-o 180 graus para uma rotação adicional de dois minutos. Remova tudo, exceto 10 a 15 microlitros do sobrenadante e ressuspenda as células no meio restante, com uma alíquota de um miligrama por mililitro de lectina esterilizada por filtro.
Adicione cinco microlitros de solução de lectina no canto da lamínula e adicione cinco microlitros de cultura à gota de lectina. Para criar uma câmara de crescimento de células de base S pom, pipete cinco microlitros de EMM em uma lâmina limpa e inverta a lamínula com a cultura em um ângulo de 70 graus sobre o meio e solte-a de cima para baixo no EMM para selar as bordas com graxa de silicone. Corte a extremidade larga de uma ponta de 200 microlitros e prenda a extremidade estreita a uma seringa de dois mililitros.
Encha a seringa com aproximadamente um mililitro de graxa de silicone. Aplique uma linha fina de silício nas bordas da lamínula empurrando suavemente o pistão da seringa para obter a imagem da câmara de crescimento. Comece usando o Brightfield Imaging para localizar as células e cavar.
Obtenha uma imagem nítida para microscopia confocal. Usamos um microscópio de varredura a laser Zeiss LSM 700 com uma lente objetiva de óleo de cromato apoch plano 63 vezes e uma configuração de varredura de plano médio de 16 linhas. Defina as unidades de área para um a 1,1 para obter uma fatia óptica de 0,8 mícrons.
Escaneie as células com lasers que detectam Alexa 4 88 e mCherry ou GFP. Registre imagens suficientes para fazer medições em 60 células para cada dreno. Mude para uma nova câmara de crescimento com células frescas.
Após 60 minutos de imagem, abra uma imagem no programa Zeen Light Edition para medir a distância entre os sinais de diferentes fluoróforos no mesmo plano focal. Abra a ferramenta de medições e ajuste a intensidade e o contraste da luz para identificar o centro de cada sinal fluorescente, por exemplo, o corpo do pólo do fuso e a membrana nuclear, e meça a distância entre eles. Transfira os dados para uma folha de bloco de notas.
Compare as distâncias subcelulares médias ou medianas entre diferentes cepas e tratamentos usando software estatístico ou testes como o teste T ou o teste de soma de Man Whitney Rank. Neste exemplo de cepa, PJ 1 18 5 foi cultivado em EMM e uma amostra foi colocada em uma câmara de crescimento para imagem. Em seguida, uma alíquota de PJ 1 18 5.
A cultura foi transferida para EMMN e incubada por 15 minutos antes de uma amostra ser colocada em uma câmara de crescimento para imagem. A ferramenta de medição foi usada para medir a distância entre o locus e o corpo do pólo do fuso, bem como entre o locus e a membrana nuclear. Como mostrado aqui, houve uma diferença estatisticamente significativa na distância do cluster de genes que se afasta da membrana nuclear em direção ao corpo do pólo do fuso nas células carentes de nitrogênio em comparação com as células cultivadas em nitrogênio.
Os dados que medem a distância entre a GFP e a PAS tiveram uma distribuição normal e, portanto, as distâncias médias puderam ser comparadas usando um teste T. Houve diferença significativa entre os dois valores médios. Os dados que medem a distância entre a GFP e a NM não tiveram uma distribuição normal e, portanto, as distâncias medianas foram comparadas usando um teste de soma de classificação de man Whitney.
Houve diferença significativa entre os dois valores medianos após esse procedimento. Outros métodos, como PCR em tempo real, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre como o nível de expressão gênica se correlaciona com as mudanças na organização subnuclear.
Visão Geral
Este estudo apresenta um método para análise quantitativa de células vivas da levedura de fissão, Schizosaccharomyces pombe, focando na organização do genoma dentro do núcleo celular. O método permite aos pesquisadores investigar como a organização subnuclear é influenciada pelas condições de crescimento e mutações.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Genética
- Microbiologia
Fundamento
- Schizosaccharomyces pombe serve como um organismo modelo para o estudo de processos celulares.
- Compreender a organização do genoma é crucial para insights sobre a regulação gênica.
- Técnicas de imagem de células vivas podem revelar estruturas celulares dinâmicas.
- Mudanças nas condições de crescimento podem afetar a organização celular.
Objetivo do Estudo
- Medir quantitativamente a organização subnuclear em células de levedura.
- Avaliar o impacto das condições nutricionais e mutações na organização do genoma.
- Fornecer um método para estudar a dinâmica da cromatina e a regulação gênica.
Métodos Utilizados
- Células de levedura são cultivadas em meio mínimo até a fase logarítmica.
- As células são preparadas para imagem usando uma câmara de crescimento e microscopia confocal.
- Estruturas marcadas fluorescentemente são fotografadas para medir distâncias entre elas.
- Análise estatística é realizada para comparar distâncias em diferentes condições.
Principais Resultados
- Diferenças significativas na organização subnuclear foram observadas sob várias condições de crescimento.
- Medições de distância entre sinais fluorescentes indicaram mudanças no posicionamento da cromatina.
- Testes estatísticos confirmaram a significância das diferenças observadas.
- O método fornece insights sobre a relação entre organização subnuclear e expressão gênica.
Conclusões
- O método desenvolvido é eficaz para estudar a organização do genoma na levedura de fissão.
- Os resultados destacam a influência de fatores ambientais na dinâmica da cromatina.
- Esta abordagem pode ser aplicada para investigar mais profundamente os mecanismos de regulação gênica.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Quantitative live cell fluorescence microscopy in fission yeast enables precise measurement of subnuclear organization and its dynamic response to environmental changes. This capability is critical for de-risking early discovery hypotheses about chromatin architecture and gene regulation. The method supports predictive confidence in target validation and informs portfolio decisions at the intersection of cell biology and functional genomics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of chromatin organization and its impact on gene regulation under defined conditions.
- Supports functional target validation by quantifying spatial genome dynamics in response to perturbations.
- Provides mechanistic de-risking for hypotheses linking nuclear architecture to gene expression changes.
Screening & Assay Development
- Establishes validated live cell imaging systems for reproducible measurement of subcellular distances.
- Facilitates assay standardization through quantitative, statistically analyzable outputs.
- Enables screening of genetic or environmental modifiers affecting nuclear organization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns subnuclear localization changes with gene induction events relevant to disease models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by linking chromatin dynamics to functional readouts.
- Provides predictive de-risking for translational biomarker development when chromatin positioning is implicated.
Pipeline & Workflow Integration
This quantitative imaging method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to preclinical model validation, supporting both mechanistic studies and translational research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on chromatin organization and gene regulation relationships.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for comparing genetic or environmental conditions.
- Analytics: Delivers statistically robust measurements (mean, median distances) for cross-condition analysis.
- Translational Research: Connects nuclear architecture changes to gene induction relevant for disease modeling.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for live cell imaging and quantitative analysis across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies.
- Operational Value: Standardizes live cell imaging workflows and ensures reproducibility of quantitative outputs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing robust data on chromatin dynamics and gene expression relationships.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and pathways based on quantitative nuclear organization data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live cell imaging, fluorescence microscopy, and quantitative image analysis.
- Demands access to confocal microscopy and compatible analytical software for distance measurements.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and statistical analysis methods.
- Adaptation may be needed for different yeast strains or model systems with varying genetic backgrounds.
- Practical limitations include autofluorescence management and ensuring sufficient sample size for statistical power.
