Name: Rotulagem células-tronco com Ferumoxytol, uma FDA-Approved nanopartículas de óxido de ferro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Aprenda a rotular células-tronco mesenquimais humanas com ferumoxytol, nanopartículas de óxido de ferro aprovadas pela FDA, para rastreamento por ressonância magnética. Este método permite monitoramento não invasivo de enxertos celulares in vivo.

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Este trabalho foi financiado por uma doação do Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculosqueléticas e da Pele: 3R01AR054458-02S2.

1. 1 dia 1) Placa de células <ol><li> HMSC placa em um frasco T75 em uma confluência de 80%, no mínimo, 18-24 horas antes da rotulagem. Consulte a Tabela 1 para a instrução para os navios alternativo. </li></ol> 2. Dia 2 2) Prepare solução de rotulagem. Esta preparação vai rotular um (1) T75 frasco a 80% confluência com uma concentração de 400 mcg Fe / ml. Consulte a Tabela 1 para a instrução para os navios alternativo. <ol><li> Criar uma solução (solução 1) através da mistura de 1 ml de soro livre de media e 93,1 mL de ferumoxytol (stock: 30 mg / ml) em um tubo de 15 ml. </li><li> Criar uma segunda solução (solução 2) através da mistura de 1 ml de soro livre de media e 7 mL de sulfato de protamina (stock: 10 mg / ml) em um tubo de 15 ml segundo cônico. </li><li> Permitir que cada solução em repouso por 5 minutos. </li><li> Adicionar soluções 1 e 2 juntos. Misture suavemente a solução de etiquetagem. Permitir que a solução descansar por 5 minutos para permitir USPIO pro-complexos sulfato de histamina a se formar. </li><li> Adicionar 5 ml de soro livre de mídia para o 2 ml misto de SPIO / solução de sulfato de protamina para um volume final de 7 ml. </li></ol> 3) Prepare células de rotulagem <ol><li> Aspirar a mídia a partir de células. </li><li> Lavar cuidadosamente as células uma vez com 2-3 ml de pré-aquecido Mg / Ca-livre D-PBS ou soro livre de mídia para enxaguar residual proteínas séricas e ou outros componentes de mídia que possam prejudicar a captação de contraste e eficiência rotulagem. Aspirar o líquido de lavagem. </li></ol> 4) células Etiqueta <ol><li> Adicione a 7 ml solução completa de rotulagem para as células. </li><li> Células lugar em uma incubadora (37 ° C / 5% CO 2) e permitir que as células para incubar na solução de rotulagem para 4 horas. </li><li> Adicionar 700 mL da FCS para a solução rotulagem das células para alcançar uma concentração final de soro de 10%. O soro é adicionado ao re-estabelecer o ambiente enriquecido do qual as células estão acostumados, e para ajudar na minimizing morte celular que poderia resultar de uma mudança abrupta para 24 horas de exposição a um ambiente sem soro. </li><li> Permitir que as células para incubar com a solução de etiquetagem por mais 20 horas. </li></ol> 3. Dia 3 5) Prepare células marcadas <ol><li> Aspirar a solução de rotulagem a partir de células. </li><li> Lave as células com 2-3 ml de pré-aquecido Mg / Ca-livre D-PBS. Aspirar o PBS. É importante o uso de Mg / Ca-free PBS como o Mg e Ca irá prejudicar a eficiência de Tripsina na próxima etapa. </li><li> Adicionar 2 ml de pré-aquecido tripsina 0,05% para as células e incline o frasco para trás e para garantir toda a superfície do recipiente é coberta com uma fina camada de Tripsina. Coloque as células em uma incubadora (37 ° C / 5% CO 2) e permitir que as células em repouso por 5-7 minutos ou até que as células começam a se destacar do prato. Pode ser necessário para confirmar o desapego sob um microscópio. Bata suavemente nas laterais do balão se necessário, para facilitar superfície celular desapego. </li><li> Adicionar 4 ml de pré-aquecido mídia completa para o frasco para neutralizar a tripsina. Gentilmente lavar o balão por pipetagem do Tripsina / media / solução célula para cima e para baixo várias vezes. Recolher toda a solução em um tubo de 15 ml. Centrifugar a solução de célula a 400 RCF por 5 minutos. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Ressuspender as células em 5 ml de mídia (soro contendo ou soro-free). Centrifugar a solução de célula a 400 RCF por 5 minutos. </li><li> Repita a lavagem das células descrito no passo 5.5. No total, as células serão lavadas três vezes para remover residual, agente de contraste livre na mídia e na superfície de células. </li><li> Contagem de células neste momento para atingir a contagem de células mais precisos, como as células serão perdidos durante a lavagem anterior. Realizar um teste de viabilidade das células. Células estão agora prontos para posterior análise e ou aplicação experimental. RM pode ser realizada com T1-w e T2-w parâmetros, porque embora ferumoxytol é um agente de contraste T2-w, ferumoxytol também apresenta efeitos T1. Parâmetros representativos T2-w ressonância magnética que pode ser usado para a imagem ferumoxytol células marcadas incluem: FSE ou SE_Multislice seqüências com TR de 2000-2500 ms e um TE de 60-80 ms. Para adquirir uma imagem de T1-w, diminuir o valor do TE em uma seqüência FSE ou SE_Multislice ou usar uma seqüência GRE com uma TR de alta e baixa TE. A Figura 4 demonstra um potencial de aplicação vivo para imagens rotuladas com células-tronco. </li></ol> 4. Resultados representativos: Células marcadas demonstrar um efeito de contraste significativo escurecimento ou negativos em imagens T2-weighted MR e um efeito de contraste brilho ou positivo em imagens T1-weighted MR (Figura 2). Longitudinal ressonância magnética e testes de viabilidade realizados cinco dias de pós rotulagem demonstrou nenhum sinal de MR significativo e nenhum impacto significativo sobre a viabilidade em comparação com controles não identificados (dados não mostrados). jove_content "&gt; células-tronco identificadas posteriormente pode ser diferenciada em vários tipos celulares ou por via intravenosa injetada na investigação vivo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3482/3482fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Linha do tempo Esquema de rotulagem células-tronco com nanopartículas de óxido de ferro, ferumoxytol. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3482/3482fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. As imagens de RM de secções sagitais thrrough eppendorf tubos com células em um pellet celular. A) Unlabeled controles. B) As células identificadas demonstrando uma significativa T2 ou efeito negativo agente de contraste em T2 FSE ou SE_Multislice de imagem e um efeito positivo ou T1 agente de contraste na seqüência GRE ponderada em T1. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3482/3482fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Sagital seções de tubos de eppendorf com as células de pel celularpermite. Tão pouco quanto 10.000 ferumoxytol células marcadas podem ser detectadas através de ressonância magnética T2-w. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3482/3482fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. MR visualização de ferumoxytol marcado com células-tronco injetadas em camundongos ventrículos cerebrais. A) axial, imagem de MR barin murino sem injeção de USPIO marcado com células-tronco. B) axial, C) coronal, e D) imagens sagitais MR retratando o T2, efeito de contraste negativo de USPIO marcado com células-tronco (setas brancas) injetado em um cérebro de camundongos. <img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/3482/3482table1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tabela 1"> Adaptações tabela 1. Quantidade de rotulagem células nos vasos alternativo.

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<li>Golovko, D. M., T, H. enning, Bauer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+stem+cell+labeling+with+ferucarbotran+and+protamine%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Accelerated stem cell labeling with ferucarbotran and protamine.</a> Eur. Radiol. 20, 640-648 (2010).</li>
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</ol>

Todos os colaboradores deste estudo não oferecem divulgações.

Melhorar a eficácia da engraftments células-tronco é fundamental para o avanço da medicina regenerativa. A técnica de visualização não invasiva de células-tronco in vivo aumenta significativamente nossa capacidade de compreender os mecanismos que levam a resultados enxerto bem-sucedido. Rotulagem magnética para MR de visualização, como o procedimento que temos demonstrado, permite que no acompanhamento in vivo de células-tronco com ressonância magnética. Células-tronco magneticamente rotulada ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comments (opcional) </td></tr><tr><td> D-MEM glicose alta </td><td> Sigma </td><td> D5648 </td><td> Ou médio outra base para a linha desejada com células-tronco a ser utilizada </td></tr><tr><td> D-PBS (Ca + +, Mg + + livre) </td><td> GIBCO </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA 0,05% </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-120 </td><td></td></tr><tr><td> De soro fetal bovino (FBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Ferumoxytol (Feraheme) </td><td> AMAG </td><td> 59338-0775-01 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfato de protamina </td><td> APP Pharm. </td><td> 22930 </td><td></td></tr>
</tbody>
</table>

rotulagem células-tronco com ferumoxytol, uma fda-approved nanopartículas de óxido de ferro

Labeling Stem Cells with Ferumoxytol, an FDA-Approved Iron Oxide Nanoparticle

Terapias com células-tronco com base oferecem um potencial significativo para o campo da medicina regenerativa. No entanto, ainda há muito a ser entendido em relação ao vivo na cinética das células transplantadas. Um método não-invasivo para monitorar repetidamente células-tronco transplantadas in vivo permitiria que investigadores monitorar diretamente os transplantes de células-tronco e identificar resultados pega bem ou mal sucedidas. Uma ampla gama de células-tronco continua a ser investigada para inúmeras aplicações. Este protocolo centra-se em três populações de células-tronco diferentes: rim embrionário humano 293 (HEK293) células, as células-tronco mesenquimais (hMSC) e tronco pluripotentes induzidas (iPS) células. HEK 293 células são derivadas de células embrionárias do rim cresceram em cultura com sheared DNA do adenovírus 5. Estas células são amplamente utilizados nas pesquisas, pois são facilmente cultivadas, crescem rapidamente e são facilmente transfectadas. hMSCs são encontradas na medula adulta. Estas células can ser replicado como células indiferenciadas, mantendo multipotency ou o potencial de se diferenciar em um número limitado de destinos celular. hMSCs pode diferenciar a linhagens de tecidos mesenquimais, incluindo osteoblastos, adipócitos, condrócitos, tendão, músculo e estroma da medula. As células iPS são células adultas reprogramadas geneticamente que foram modificados para expressar genes e fatores semelhantes às propriedades definidoras das células-tronco embrionárias. Estas células são pluripotentes significado que eles têm a capacidade de se diferenciar em todas as linhagens de células 1. Ambos hMSCs e células iPS têm demonstrado capacidade regenerativa dos tecidos in vivo. A ressonância magnética (RM), juntamente com o uso de óxido de ferro superparamagnético (SPIO) rótulos de células de nanopartículas têm se mostrado eficazes no controle in vivo de células-tronco devido à resolução anatômica perto microscópica, um sangue mais meia-vida, que permite imagens longitudinal e sensitivit altay para a detecção de células fornecido por ressonância magnética de nanopartículas SPIO 2-4. Além disso, a RM com o uso de SPIOs é clinicamente traduzíveis. SPIOs são compostos de um núcleo de óxido de ferro com um revestimento superficial dextran, carboxydextran ou amido que serve para conter o núcleo de ferro a partir de componentes bioreactive plasma. Estes agentes locais criar inomogeneidades do campo magnético que levam a uma diminuição do sinal em imagens de T2-weighted MR 5. Infelizmente, SPIOs não são mais fabricados. De segunda geração, ultrasmall SPIOs (USPIO), no entanto, oferecer uma alternativa viável. Ferumoxytol (FerahemeTM) é uma USPIO composto por um núcleo de magnetita não estequiométrica rodeado por uma camada carboxymethylether polyglucose sorbitol. O tamanho coloidal de partículas de 17-30 nm ferumoxytol é determinado por espalhamento de luz. O peso molecular é 750 kDa, ea relaxação constante em 2T campo MRI é 58,609 mM-1 sec-1 de força 4. Ferumoxytol foi recentemente aprovado pelo FDA ums um suplemento de ferro para o tratamento da deficiência de ferro em pacientes com insuficiência renal 6. Nosso grupo tem aplicado este agente em um &quot;off label&quot; uso para aplicações de etiquetagem celular. Nossa técnica demonstra rotulagem eficiente de células-tronco com ferumoxytol que leva a um impacto significativo no sinal MR de células marcadas em imagens de RM. Esta técnica pode ser aplicada para não-invasivos de monitoramento de terapias com células-tronco em ambientes pré-clínicos e clínicos.

Nós descrevemos uma técnica para rotulagem e rastreamento de células-tronco com FDA-approved, óxido de ferro superparamagnético (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Esta técnica de imagem celular que utiliza a ressonância magnética (RM) para visualização, é facilmente acessível a longo prazo de monitoramento e diagnóstico de engraftments tronco bem ou mal sucedidas de células em pacientes.

Rotulagem células-tronco com Ferumoxytol, uma FDA-Approved nanopartículas de óxido de ferro

As terapias baseadas em células-tronco oferecem um potencial significativo para o campo da medicina regenerativa. No entanto, muito ainda precisa ser compreendido a respeito do in vivo ...

Nesta técnica, em ciência translacional, as células são marcadas utilizando um óxido de ferro superparamagnético ultrafino aprovado pela FDA chamado far amatol. Inicie com células-tronco mesenquimais humanas cultivadas com 80% de confluência, em seguida, transfecte o agente de contraste far amatol em meio livre de soro para marcar as células. Prossiga com a coleta e contagem das CTHMs marcadas para uso experimental.Por fim, os resultados de imagens por ressonância magnética podem mostrar um contraste negativo significativo ou efeito T dois em células marcadas com U-S-P-I-O. Bem-vindo ao laboratório DDR link do Programa de Imagem Molecular da Stanford. As implicações desta técnica estendem-se ao rastreamento in vivo de implantes de células-tronco por meio de visualização direta por imagens de ressonância magnética não invasivas.A principal vantagem desta técnica em relação às técnicas existentes, como a marcação com SPIOs, é que o USPIO é a única nanopartícula de óxido de ferro aprovada pela FD que pode ser utilizada para marcação celular por uso off-label. Em um tubo cônico de 15 mililitros, dilua o agente de contraste em um mililitro de meio livre de soro; em um segundo tubo, dilu

labeling-stem-cells-with-ferumoxytol-an-fda-approved-iron-oxide

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Para a avaliação de terapias com células-tronco é importante não invasiva track as células injetadas in vivo. Este vídeo irá mostrar-lhe como rotular as células-tronco mesenquimais e embrionárias com óxido de ferro agentes de contraste com base in vivo para posterior ressonância magnética in vivo.

Rotulagem e hESCs hMSCs com óxido de ferro nanopartículas para Não-invasiva em Rastreamento vivo com ressonância magnética

Este vídeo mostra as técnicas para a rotulagem de células-tronco embrionárias e células-tronco mesenquimais com corantes fluorescentes. Esta técnica pode ser usada para um monitoramento in vivo de células-tronco transplantadas com imagens ópticas e para as correlações histopatológico com microscopia de fluorescência.

Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

Neste vídeo, estamos mostrando como rotular células estaminais embrionárias humanas (CTEh) com cloreto de manganês...

Na rotulagem in vitro de células estaminais embrionárias humanas para Ressonância Magnética

Objetivo da apresentação é mostrar um método altamente reprodutível para gerar matriz associada implantes de células-tronco em defeitos da cartilagem, que pode ser visualizado com ressonância magnética. As células estaminais são rotulados com FDA-approved Ferumoxides, misturado com agarose, implantado em defeitos da cartilagem e fotografada com um scanner MR 7T.

Implantação de Ferumoxides identificadas células-tronco mesenquimais em defeitos da cartilagem

Este artigo descreve uma sequência otimizada de eventos para imagiologia multimodal de enxertos celulares no cérebro de roedores por meio de: (i) na bioluminescência vivo e ressonância magnética, e (ii) a análise post mortem histológica. A combinação destas modalidades de imagem em um único animal permite uma avaliação do enxerto celular com alta resolução, sensibilidade e especificidade.

Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

A entrega celular direcionada é útil em uma variedade de aplicações biomédicas.  O objetivo deste protocolo é usar nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro (SPION) para rotular células e, assim, permitir abordagens de direcionamento de células magnéticas para um alto grau de controle sobre a entrega e localização celular.

Rotulagem celular e Segmentação com nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas

Um protocolo para a síntese e catiação de magnetoferritina dopada com cobalto é apresentado, bem como um método para magnetizar rapidamente células-tronco com magnetoferritina catiônica.

Síntese de cationizada Magnetoferritin para a magnetização ultra-rápida de Células

Este manuscrito descreve a entrega eficiente, não-viral de miR a células endoteliais por um vector de PEI / MNP e a sua magnetização. Assim, em adição à modificação genética, esta abordagem permite a orientação celular magnética e ressonância magnética detectabilidade. A técnica pode ser usada para melhorar as características de produtos de células terapêuticas.

preparação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterização de magnetizado miR-modificado Células Endoteliais

Apresentado aqui é um protocolo para a entrega e o seguimento não invasores da pilha de haste do mesenchymal (MSC) em um modelo do rato de ferimento de cérebro traumático. As nanopartículas superparamagnéticas do óxido de ferro são empregadas como uma ponta de prova da imagem latente da ressonância magnética (MRI) para a rotulagem de MSC e o seguimento in vivo não invasor após a entrega intranasal usando mri em tempo real.

Rastreamento de células-tronco mesenchymal rotuladas por óxido de ferro superparamagnético usando ressonância magnética após parto intranasal em um modelo de urina de urina de lesão cerebral traumática

As nanopartículas de óxido de ferro são sintetizadas através de um procedimento de gel sol não diatéico e revestidas com moléculas curtas aniônicas ou polímeros. O uso de magnetometria para monitorar a incorporação e biotransformações de nanopartículas magnéticas dentro de células-tronco humanas é demonstrado usando um magnetômetro de amostra vibração (VSM).

Usando magnetometria para monitorar a incorporação celular e a biodegradação subsequente de nanopartículas de óxido de ferro quimicamente sintetizadas

O teor de hidroperóxido lipídico representa o indicador mais comumente usado de morte celular ferroptótica. Este artigo demonstra a análise passo a passo da citometria de fluxo do conteúdo de hidroperóxido lipídico nas células após a indução da ferroptose.

Revelando o fenótipo ferropótico do meduloblastoma

Aprenda a rotular células-tronco mesenquimais humanas com ferumoxytol, nanopartículas de óxido de ferro aprovadas pela FDA, para rastreamento por ressonância magnética. Este método permite monitoramento não invasivo de enxertos celulares in vivo.

Rotulagem células-tronco com Ferumoxytol, uma FDA-Approved nanopartículas de óxido de ferro

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