Propagação e detecção de um Clone Infecciosas Molecular da Maedi-visna vírus que expressa a proteína fluorescente verde

O objetivo geral deste procedimento é propagar e detectar um clone infeccioso de Mildy versus sem vírus que expressa a proteína verde fluorescente. Esta proteína verde fluorescente foi clonada no gene da capa do D utp Ace no genoma do vírus Myy Ner.

O clone infeccioso está contido em dois plasmídeos. Primeiro, os dois plasmídeos que carregam as sequências myy Ner são cortados com a enzima de restrição xpa um e ligados. Em seguida, células do plexo coroide de ovelha são transfectadas com o construto.

Por fim, as células infectadas pelo vírus myy vino são detectadas por microscopia fluorescente e citometria de fluxo. Olá, sou Stefano Neron do Instituto TER de Patologia Experimental da Universidade da Islândia. Hoje vamos mostrar um procedimento para propagar e detectar um clone molecular infeccioso do meu vírus vascular que expressa a proteína verde fluorescente.

O clone molecular está contido nos plasmídeos P oito XSP cinco EGFP e P seis sete ou de 12 quilobases e 4,5 quilobases, respectivamente. Corte quantidades equimolares dos dois plasmídeos, ou seja, 4,4 microgramas de P oito XSP cinco EGFP e 1,6 microgramas de P seis sete ou com XPA um e ligue antes da transfeção. Quando a ligação estiver concluída, incube a mistura de ligação a 65 graus Celsius por 15 minutos. Dois dias antes da transfeção, semeie 10 elevado a seis células SCP em um frasco de cultura de tecidos T 25 e cultive as células por dois dias em cinco mililitros de DMEM acrescido de 10% de soro de cordeiro e dois milimolares de glutamina, sem antibióticos, até uma confluência de monocamada de 90%.

Se as células não atingirem 90%CO após dois dias, deixe as células crescerem por mais um dia. O soro de cordeiro pode ser substituído pelo soro bovino fetal FBS. Usamos rotineiramente soro de cordeiro porque alguns sorotipos do MVV são inibidos pelo FBS.

No entanto, esta linhagem de MVV não é inibida pelo soro bovino fetal (FBS). Quando as células estiverem prontas para transfeção, troque o meio por DMEM contendo 1% de soro de bezerro ou FBS, sem antibióticos. Utilizamos Lipofectamine 2000 para a transfeção: dilua o DNA em 500 microlitros de meio opti MEM, dilua 20 microlitros de Lipofectamine 2000 em 500 microlitros de meio opti MEM e deixe em temperatura ambiente por cinco minutos.

Após a incubação de cinco minutos, combine o DNA diluído com o lipofectamina 2000 diluído em um volume total de 1000 microlitros. Misture suavemente e incube por 22 a 30 minutos. À temperatura ambiente, adicione a mistura de transfeção ao frasco T25 contendo as células SCP e o meio, misturando com movimentos suaves de balanço.

Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite. No dia seguinte, trocar o meio por DMEM com 1% de soro, dois milimolares de glutamina, 100 UI por mililitro de penicilina e 100 UI por mililitro de estreptomicina. Monitorar a produção de GFP e das células SCP por microscopia fluorescente invertida.

Espera-se baixa eficiência de transfeção com essas células primárias, geralmente entre cinco a 15%. Incubar adicionalmente a 37 graus Celsius, 5% dióxido de carbono por vários dias para permitir a disseminação do vírus no frasco. Geralmente leva de sete a 14 dias para infecção completa. Coletar o vírus por Ali, transferindo o sobrenadante para tubos menores.

Centrifugue em um microcentrífuga a 3000 ×g por cinco minutos para remover debris celulares. Transfira o sobrenadante contendo o vírus para novos tubos.

Armazene a menos 80 graus Celsius sementes com três vezes 10 à quarta células SCP em 100 microlitros de meio DMEM suplementado com 10% de soro, 2 milimolar de glutamina, 100 UI por mililitro de penicilina e 100 UI por mililitro de estreptomicina por poço.

Em uma placa de 96 poços, incubar a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. Se as células estiverem confluentes no dia seguinte, trocar o meio por DMEM com 1% de soro. Tendo 100 microlitros em cada poço, diluir o vírus da seguinte maneira.

Adicione 180 microlitros de DMEM com 1% de soro por poço a quatro vezes 10 poços em uma placa de 96 poços com fundo redondo ou fundo em V para diluição seriada decimal em quádruplo. Adicione 20 microlitros de vírus a cada um dos quatro poços na primeira coluna da placa. E, utilizando uma pipeta de quatro canais, pipete para cima e para baixo para garantir que as amostras sejam completamente misturadas.

Altere as ponteiras da pipeta e transfira 20 microlitros para os próximos quatro poços e assim por diante. Deixe os últimos poços sem vírus como controle negativo. Adicione 100 microlitros da diluição do vírus às células SEP e ao incubador com meio.

37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Observe por fluorescência GFP e efeitos citopáticos durante duas semanas. Os efeitos citopáticos consistem no arredondamento das células e na redução de sua transparência em comparação com células normais, com prolongamentos citoplasmáticos estendidos, culminando no aparecimento de células multinucleadas e morte celular.

Calcule a titulação do vírus utilizando o método de Reed-Muench para monitoramento rápido da replicação do vírus. Células infectadas podem ser examinadas por citometria de fluxo com tripsina. Olhos ao redor de 10 elevado a cinco células infectadas.

Lave uma vez com PBS e RESUSPENDA em 500 microlitros. PBS acrescente 500 microlitros de solução de paraformaldeído a 4%, obtendo uma concentração final de 2%, e incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Peline as células a 3000 ×g ou PMM durante cinco minutos.

Lave com PBS duas vezes por cinco minutos e analise em um analisador de triagem FACS. Conte 10.000 eventos. O clone molecular que expressa GFP do meu vírus apresentado aqui pode ser útil para analisar as interações vírus-hospedeiro e a patogenicidade do meu neurovírus, tanto in vivo quanto in vitro.

Embora não tenha sido demonstrado que meu neurovírus possa afetar células humanas, é importante observar todas as precauções de nível de biossegurança, tanto as células quanto o plasmídeo podem ser obtidos em nosso laboratório. Boa sorte com seus experimentos.