Name: Preparação do tecido e imunocoloração de Fibras nervosas sensoriais que inervam rato da Pele e Ossos Limb (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprenda a preparar tecidos e realizar imunocoloração de fibras nervosas sensoriais em pele e ossos de ratos. Este método permite visualizar a expressão proteica e os padrões de inervação periférica.

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Agradecemos ao Dr. Yuriy M. Usachev por sua ajuda na padronização inicial de microscopia confocal / imagem de imunocoloração do mouse plantar biópsia com punch, e Dr. Donna L. Hammond por sua ajuda contínua e críticas construtivas a este trabalho. Este trabalho foi financiado por concessões do NINDS / NIH (NS069898), e um Idea Award Grant Desenvolvimento do Departamento de Defesa Programa de Pesquisa em Câncer de Próstata (DoD-PCRP-101096) ao DPM

1. Perfusão animais Todos os procedimentos com animais realizados neste estudo são aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use da Universidade de Iowa, e seguir as orientações do NIH para o uso de animais em pesquisa. <ol><li> No dia antes da perfusão, preparar 1 L de tampão fosfato (0,2 M PB em dobro destilada H 2 O, pH 7,4), e armazenar a 4 ° C. Isso será usado para os processos de perfusão e pós-fixação. </li><li> No dia da perfusão, preparar 500 ml de paraformaldeído 4,0% em 0,1 M PB (PFA, pH 7,4) solução fixadora, um volume suficiente para a perfusão de 2 ratos: microondas de 200 ml de DDH 2 O em um copo de vidro por 30 segundos ou até que se aproxima de ebulição. Adicionar 20 g de paraformaldeído granular (PFA) para o copo com agitação constante sob uma coifa. Adicionar 5 ml de 5 N NaOH gota a gota, e mexa até que a solução limpa. Quando a PFA é completamente dissolvido, esfriar a solução à temperatura ambiente (RT). Slowly adicionar 250 ml de 0,2 M PB agitando continuamente. Usando soluções progressivamente mais fraco HCl (6 a 1 N N para 0,1 N), ajustar o pH para 7,4. Ajustar o volume final de 500 ml e chill no gelo. Também preparar 400 ml de 0,1 M PB de 0,2 M de ações, diluindo 1:1 em DDH 2 O e frio no gelo. </li><li> Anestesiar o rato por injeção intraperitonial de uma overdose de anestésico (pentobarbital sódico, 80 mg / kg, administrado com uma agulha de 27G). </li><li> Durante a perfusão, 50 ml de 0,1 M PB (diluir 0,2 M PB estoque 1:1 com DDH 2 O) e 150 ml de PFA serão passados ​​seqüencialmente para a circulação mouse. Configurar a bomba peristáltica preenchendo o tubo com PB e fixação de um 23 1 / 2 agulha borboleta G em uma extremidade. Mergulhe a outra extremidade do tubo no copo contendo 0,1 M PB. Definir a velocidade da bomba peristáltica a 10 ml / min, e uma bomba através de uma quantidade suficiente de solução para garantir que não há bolhas de ar na tubulação. </li><li> Aguarde até que a umanesthetized do mouse já não mostra qualquer atividade reflexa, como tep / tail pinch e reflexo de pestanejo. Coloque o animal em uma bandeja de dissecação lado ventral para cima dentro de um extractor de fumo e segura as patas com fita adesiva. Pulverizar a pele com álcool 70%. Faça uma incisão através da pele ao longo da linha média para expor a caixa torácica e do bairro mais alto da parede abdominal. Em seguida, corte através da parede abdominal na base da caixa torácica. Depois de fazer essa incisão, o diafragma e extremidade inferior do esterno deve ser visível. Cuidadosamente cortada da esquerda para a direita através da margem do diafragma, e ao longo do comprimento total do esterno, tendo cuidado para não danificar os pulmões. Alguns pequenos sangramentos do esterno nesta fase é normal e não vai comprometer a perfusão. Uma vez que a incisão ao longo do esterno tem sido feito eo corte do diafragma, que deve ser possível para levantar cada metade da caixa torácica para cima e para fora, de modo que o coração está exposto. Afastar os pulmões, se necessário. Ambas as metades da caixa torácica podeser mantido nessa posição com o uso de grampos hemostáticos. Inserir a agulha borboleta (23 1 / 2 G) anexado ao milímetro bomba peristáltica 3-4 para o ventrículo esquerdo, paralela ao longo eixo do animal. Este posicionamento minimiza o risco de a agulha ficar deslocada. Faça uma pequena incisão no átrio direito para permitir a circulação de retorno a fluir para fora do coração. </li><li> Começar a perfusão com 0,1 M PB, 10 ml / min para min 4-5. Se ainda há uma quantidade significativa de sangue que emana do átrio direito, neste ponto, continue até que o fluxo é clara. </li><li> Interromper o fluxo de PB e mudar a entrada na bomba peristáltica para a solução PFA 4%. Reduzir a taxa de fluxo de 5 ml / min e retomar a PFA bombeamento solução por 20-25 min. Como o PFA entra na circulação, os músculos entram em espasmo e, após alguns minutos, o animal deve ser literalmente "fixo" na posição. Esta rigidez pode ser testado por gentilmente empurrando contra a patas traseiras, tomando cuidado para não mover o animal umand desalojar a cânula. Boa perfusão impedirá o membro de flexão em resposta. Uma vez que a perfusão com PFA está completa, a cânula e grampos hemostáticos pode ser desconectado e o cadáver preparado para dissecção do tecido. A abordagem dissecção usado depende do tecido específico. </li><li> Prepare 4% PFA / 5% (v / v) de ácido pícrico (PA; para a cobrança e pós-fixação de socos plantar somente) pela adição de solução saturada de ácido pícrico a PFA 4%. Inclusão de PA melhora significativamente a detecção de antígeno em tecidos periféricos neuronal 1 </li><li> Prepare osso / cartilagem solução tecido descalcificação / crioprotetor - EDTA 10% em 0,1 M PB com glicerol 0,07% e sacarose 15%. EDTA soluções baseadas descalcificar tecido preservando epítopos 2. </li><li> Prepare a solução crioprotetor - 30% de sacarose em 0,1 M PB. </li></ol> 2. Dissecção do tecido / Remoção, Pós-fixação e secção <ol><li> Soco Plantar Coloque a perfusãolado sed animais ventral para baixo sobre um tapete de corte ou superfície resistente outros. Segurando a plantar pé de superfície-up, pressione firmemente com a biópsia com punch ferramenta (3 mm de diâmetro; Harris micro-punch, Ted Pella, Inc.) para o meio do pé. Desativar a ferramenta biópsia frente e para trás através de 180 graus para confirmar a ferramenta biópsia cortou a totalidade da pata posterior. Remover suavemente a ferramenta de biópsia de pé e retirar o tecido em tubo estéril 2 ml com tampa, contendo 1 ml de 4% PFA / 5% de solução PA. </li><li> Ossos do membro (ex. fêmur) Faça uma incisão lateral ao longo do dorso do animal ao nível da pelve, continuando para baixo ao longo dos dois membros posteriores. Corte na pelve e músculo ao redor para separar o fêmur da pélvis, deixando a cabeça do fêmur proximal intacta. Corte em tíbia / fíbula para deixar a cabeça intacta distal, a remoção do músculo ao redor / periósteo do eixo ósseo. Coloque o fêmur em um tubo de 2 ml contendo 1 ml de 4% PFA /5% solução PA. </li><li> Pós-fix as amostras de tecido em 4% PFA / 5% da solução de PA, com a mistura suave de um roqueiro para 16-18 h, a 4 ° C </li><li> Descalcificar o tecido da seguinte forma: Para plantar soco lugar (a descalcificação dos ossos pequenos do pé) o soco em um tubo de tecido ml estéril com tampa 2, contendo 1,5 ml da solução de EDTA 10% em 0,1 M PB com glicerol 0,07% e 15 % de sacarose. Colocar o tubo em um roqueiro com mistura leve de 16-18 horas a 4 ° C. Para ossos dos membros coloque o tecido em um tubo estéril 2 ml com tampa, contendo 1,5 ml da solução de EDTA 10% em 0,1 M PB com glicerol 0,07% e 15% de sacarose. Colocar o tubo em um roqueiro com mistura leve de 6-7 dias a 4 ° C. A solução descalcificação deve ser trocado a cada 24 horas eo tecido monitorado para a perda de rigidez com um par de fórceps. </li><li> Transferir o tecido em um tubo estéril 2 ml com tampa com 1,5 ml de solução de crioprotetor (30% de sacarose em 0,1 M PB), e colocar o tubo em um w rockerom mistura leve de 16-18 horas a 4 ° C. </li><li> Prepare tecido para corte: volume lugar uma cama de temperatura de corte ideal (OCT) composto (Sakura Finetek EUA Inc.) em um bloco de tecido criostato de montagem e permitir a congelar na câmara de criostato (tipicamente mantida a -20 ° C). Um aerossol criogênico (Cyto-freeze, Control Co. EUA) também pode ser pulverizado sobre o OCT para acelerar o processo de congelamento. Amostra de tecido lugar nesta cama de outubro e cubra com uma camada adicional fina de outubro Suavemente com spray de outubro deste aerosol criogênicos até que tenha endurecido e os tecidos dentro congelou. Espécime lugar para a cabeça de corte na câmara de criostato e permitir que o bloco de amostra de tecido para equilibrar a temperatura de corte - pelo menos 1 hora. Tentando seção quando o composto é a incorporação de resultados ainda muito frio em seções frágil e dano tecidual. </li><li> Uma vez que o tecido tenha alcançado a temperatura de corte ideal, começar a cortar a amostra e gerar 40 seções mM. </li><li>Para soco plantar recolher o criosecções em 12-lamelas de cultura de tecidos contendo 0,1 M PB com 10 mM de azida de sódio. Certifique-se que as seções permanecem submersos nessa solução a 4 ° C. Seções podem ser armazenados desta forma por até 4-6 meses para fins de imunocoloração. Alternativamente, de livre flutuação seções podem ser armazenados indefinidamente em solução crioprotetora a -20 ° C (500 ml 0,1 M PBS, pH 7,2, 30 g de sacarose, 10 g PVP40, 300 ml de etilenoglicol). Ajustar o volume final de 1L com água destilada) 3. Para recolher os ossos dos membros criosecções diretamente sobre a gelatina pré-revestidas slides (ou Superfrost Slides Plus, Fisher Scientific) e deixar secar durante 1 h, antes de armazenar a -20 ° C. Seções osso em slides armazenados dessa forma podem ser utilizados para fins imunocoloração dentro de 2-3 meses. </li></ol> 3. Imunocoloração das secções de tecido de fibras nervosas sensoriais 3.1. Plantar socoseções - coloração seção flutuante <ol><li> Usando uma lâmina de barbear, cortar 6-7 mm a partir do final de uma micropipeta uma dica ml. Pré-condição dentro da ponta de aspiração de 1% de soro fetal bovino (FBS) em 0,1 vezes M várias PB (isto inibe a degola das seções de tecido para as paredes da ponta). Transferência de seções soco plantar a ser manchado para uma placa de cultura de 24 poços de tecido. Normalmente 80-10 seções devem ser coradas por poço para garantir várias seções de alta qualidade são gerados por imunocoloração. </li><li> Lavar seções soco plantar com 500 mL de 0,1 M por poço PB por 5 min com vigorosa mistura em um balancim no RT. Repita mais 2 vezes. </li><li> Descartar a solução de lavagem e incubar as seções soco plantar em solução de bloqueio, consistindo de soro de cabra 10% e 0,3% Triton X-100 em 0,1 M PB (500 mL de solução de bloqueio por poço), com a mistura suave de um roqueiro por 1 h a 4 ° C. </li><li> Descartar a solução de bloqueio e incubar os cortes de tecidos em Antibo principaldy / anticorpos diluídos em 250 mL de solução de bloqueio para 18-24 h, com a mistura suave de um roqueiro, a 4 ° C. Com base nos requisitos experimental investigador, imunomarcação única (com um anticorpo primário contra uma proteína específica ou marcador de fibras nervosas), ou imunomarcação duplo (com dois anticorpos primários contra duas proteínas ou marcadores de fibras nervosas) pode ser realizada na mesma seção. Durante a realização imunomarcação dupla é importante para verificar que os dois anticorpos primários utilizados são criados em diferentes espécies hospedeiras (por exemplo, um mouse e cresceu em uma levantada no coelho) ou, alternativamente, purificada de anticorpos monoclonais diferentes imunoglobulina G (IgG) isotipos (por exemplo, uma IgG1 e IgG2a um) pode ser usado. É aconselhável selar a placa com Parafilm para incubações durante a noite para evitar a evaporação excessiva. , A fim de manchar o periférico as fibras nervosas sensoriais, vários anticorpos específicos podem ser usados. Anticorpos contra a proteína neurofilamento 200 (NF200, Sigma) label large diâmetro de fibras, enquanto que a calcitonina peptídeo relacionado ao gene (CGRP; Sigma) e receptor transiente peptidérgicas potencial vanilloid 1 (TRPV1, Neuromics) rótulo, de pequeno diâmetro fibras sensoriais periféricas. Todas as fibras do nervo periférico também podem ser marcadas com anticorpos contra β3-tubulina. Na pele, o colágeno IV (Abcam) é usado para delinear a membrana basal que separa a epiderme da derme. Como regra geral, os anticorpos precisam ser 5-10 vezes mais concentrado do que para a cultura de células baseado em imunofluorescência, normalmente a uma concentração de trabalho de 50-10 mcg / ml. </li><li> Lavar as secções de tecido com 500 ml de solução de bloqueio (com Triton X-100) por poço por 5 min com mistura vigorosa em um balancim no RT. Repita 3 vezes mais. </li><li> Descartar a solução de lavagem e cortes de tecidos em incubar apropriado fluoróforo conjugado com anticorpos secundários (normalmente diluído 1:1000 em solução de bloqueio, a 500 mL) com a mistura suave de um roqueiro, a 4 ° C. A placa de must ser embrulhados em papel alumínio para evitar a fotodegradação dos fluoróforos. </li><li> Lavar as secções de tecido com 500 ml de solução de bloqueio por poço por 10 min com mistura vigorosa em um balancim no RT. Em seguida, lave com 500 mL de 0,1 M PB com vigorosa mistura por 10 minutos em temperatura ambiente. Finalmente, lave com 500 mL de 0,05 M PB com vigorosa mistura por 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Usando uma micropipeta de 1 ml com uma ponta FBS-tratados (corte 6-7 mm a partir do final), aspirar as seções da placa de cultura de tecidos e transferência para SuperFrost Além de lâminas de microscópio. Organizar as seções e absorver tampão de lavagem em excesso com um pincel fino. Evite a exposição prolongada à luz. Incubar as lâminas em temperatura ambiente, de modo a permitir seções para secar seções em slide (50-30 min). </li><li> Aplique várias gotas de meio de montagem (ProLongGold, Vectashield ou similar), lentamente lugar uma lamela de vidro sobre seções. Permitir que os slides para sentar-se na escuridão por 5 min, e depois selar as bordas da lamínula com unhas transparentepolonês. Permitir que o ar de secagem para 15-20 minutos. Os slides podem ser visualizados ou armazenados a -20 ° C durante vários anos sem qualquer perda significativa de fluorescência. </li></ol> 3.2. Seções do osso do membro - Coloração em slide- <ol><li> Permitir que os slides para retornar à RT de armazenamento de -20 ° C. Usando uma caneta barreira hidrofóbica (Pen Líquido Super Pap bloqueio, Ted Pella Inc.) circunscrever a região no slide contendo as seções do osso de ser marcadas com uma generosa camada de solução. Deixar secar ao ar por 10-15 min. </li><li> Lavar as seções do osso com 250 mL de 0,1 M PB por slide por 5 min e repita para mais 2 vezes. </li><li> Descartar a solução de lavagem e incubar as seções ósseas em solução de bloqueio, consistindo de soro de cabra 10% e 0,3% Triton X-100 em 0,1 M PB (250 mL de solução de bloqueio por lâmina) por 1 hora a 4 ° C. </li><li> Descartar a solução de bloqueio e incubar as seções óssea em anticorpo primário (ou combinação de anticorpos primários, no caso dede dupla imunomarcação mencionadas no 3.1.4) diluída em 250 mL de solução de bloqueio para 18-24 h, a 4 ° C. É muito importante notar que os slides devem ser colocados em câmara úmida com uma tampa selada, para evitar a secagem da solução de anticorpo primário. , A fim de manchar o periférico as fibras nervosas sensoriais, os supramencionados conjunto de anticorpos (ver secção 3.1.4) pode ser usado com as mesmas concentrações de trabalho. </li><li> Lavar as secções de tecido com 250 ml de solução de bloqueio (com Triton X-100) por lâmina por 15 min à temperatura ambiente e repetir 3 vezes mais. </li><li> Descartar a solução de lavagem e incubar óssea em seções apropriadas fluoróforo conjugado com anticorpos secundários (normalmente diluído 1:1000 em solução de bloqueio, 250 mL) a 4 ° C. A câmara de coloração devem ser embrulhados em papel alumínio para evitar a fotodegradação dos fluoróforos. Por conveniência, é aconselhável a utilização de câmaras de cor escura coloração (por exemplo, caixa de incubação Deslize bandeja /, Corp RPI). </li><li> Wash as seções do osso com 250 mL de solução de bloqueio por slide durante 15 min à temperatura ambiente. Em seguida, lave com 500 mL de 0,1 M PB por 15 min a RT. Finalmente, lave com 500 mL de 0,05 M PB por 15 minutos em temperatura ambiente. Dip brevemente em DDH 2 O para enxaguar slides e, em seguida incubar a RT, a fim de permitir que as seções do osso para o ar (50-30 min) seca. Evite a exposição prolongada à luz. </li><li> Aplique várias gotas de meio de montagem (ProLongGold ou similar) e lentamente lugar uma lamela de vidro em seções. Deixe os slides estão em trevas por 5 min, e depois selar as bordas da lamínula com unhas polonês transparente. Permitir a secagem por 15-20 min. Slides podem ser armazenadas a -20 ° C durante vários anos sem perda de fluorescência. </li></ol> 4. Resultados representante 4.1. Plantar seções soco Secções de tecido plantar soco podem ser visualizados em microscópio de epifluorescência, ou sob um microscópio confocal com um objetivo, 10X 40X 63X ou. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3485/3485fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Mostram AD coloração com Colágeno IV anticorpos (verde) na membrana basal, na junção dermo-epidérmica e na cartilagem e músculo. Numerosas fibras CGRP (AB, vermelho) e NF200-positivos (CD, vermelho) são distribuídos por toda a pele do rato na região plantar (setas). β3-tubulina é um marcador pan-neuronal (E, vermelha), ao passo que a coloração TRPV1 (F; vermelho) limita-se principalmente ao pequeno diâmetro das fibras que também são CGRP-positivo (verde, pontas de seta). A e C são imagens de epifluorescência, tirada com uma objetiva de 10X (barra de escala -500 mm); B, D, E e F são compostos de imagem confocal gerados a partir de uma imagem 11-z-stack tomadas em incrementos de 2 mM sob um objetivo 60X (escala bar - 50 mm). 4.2. Osso seções membro Seções membro tecido ósseo também pode ser visualizado sob microscópio de epifluorescência, ou sob uma Microscop confocale com um objetivo, 10X 40X 63X ou. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3485/3485fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> . A Figura 2 mostra imunocoloração com anti-CGRP (AB, vermelho; setas), anti-NF200 (CD, vermelho, setas), anti-β3-tubulina (E; vermelho) e anti-TRPV1 (F; vermelho) co-manchadas com anticorpos anti-CGRP (verde, setas). Estas imagens mostram subtipos de fibras nervosas sensoriais distribuídos por toda a matriz óssea na região da cabeça do fêmur esponjoso mouse. A e C são imagens de epifluorescência, tirada com uma objetiva de 10X (barra de escala -500 mm); B, D, E e F são compostos de imagem confocal gerados a partir de uma imagem 11-z-stack tomadas em incrementos de 2 mM sob um objetivo 60X (escala bar - 50 mm).

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</ol>

Não há conflitos de interesses declarados.

Aqui temos detalhados os métodos para a preparação da pele do rato e seções de tecido ósseo para a imunocoloração e detecção de periféricos fibras nervosas sensoriais. As seções produzido a partir de biópsias plantar soco conter a pele glabra e cabeludo, o que significa que o protocolo pode ser usado em qualquer tipo de pele. Essas técnicas também podem ser empregadas para corar outros tipos de células nesses tecidos (por exemplo leucócitos, endotélio vascular, músculo liso entre outros). Esses métodos fornecem um excel...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do material </td><td> Tipo </td><td> Companhia </td><td> No. de catálogo </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> Harris 3 milímetros Micro-Punch </td><td> Material </td><td> Ted Pella </td><td> 15094 </td><td></td></tr><tr><td> Bomba de perfusão </td><td> Material </td><td> VWR International </td><td> 23609-170 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Reagente </td><td> Fisher Scientific </td><td> T353 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido pícrico </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 239801 </td><td></td></tr><tr><td> Outubro composto Embedding </td><td> Reagente </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cito-Freeze criogênicos aerossol </td><td>Material </td><td> Empresa de controle </td><td> 3118 </td><td></td></tr><tr><td> O soro de cabra </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9023 </td><td></td></tr><tr><td> Bandeja de incubação e tampa para imunocoloração (Large) </td><td> Material </td><td> RPI Corp </td><td> 248270 (bandeja) 248270-A (tampa) </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge caneta barreira hidrofóbica </td><td> Material </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Camelo escovas de cabelo (# espessura 1) </td><td> Material </td><td> Ted Pella </td><td> 11859 </td><td></td></tr><tr><td> Pro-Long Ouro de montagem médio </td><td> Reagente </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparação do tecido e imunocoloração de fibras nervosas sensoriais que inervam rato da pele e ossos limb

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detecção e processamento primário de física, química e térmica por estímulos sensoriais periféricos fibras nervosas sensoriais é fundamental para a percepção sensorial em animais e humanos. Essas fibras nervosas sensoriais periféricas expressam um grande número de receptores e proteínas de canais iônicos que detectam e iniciar específicos estímulos sensoriais. Métodos estão disponíveis para caracterizar as propriedades elétricas do periférico as fibras nervosas sensoriais que inervam a pele, que também pode ser utilizado para identificar a expressão funcional de proteínas canal específico de íons nessas fibras. No entanto, similar métodos eletrofisiológicos não estão disponíveis (e também são difíceis de desenvolver) para a detecção da expressão funcional de receptores e proteínas de canais iônicos na periferia fibras nervosas sensoriais que inervam outros órgãos viscerais, incluindo os tecidos mais difíceis como o osso. Além disso, tais métodos eletrofisiológicos não pode ser utilizado para determinar a expressão de proteínas não-excitáveiss em fibras nervosas sensoriais periféricas. Portanto, imunocoloração de amostras de tecido periférico / visceral para Fivers nervosas sensoriais fornece a melhor maneira possível para determinar a expressão de proteínas específicas de interesse nestas fibras nervosas. Até agora, a maioria dos estudos de proteínas expressão em neurônios sensoriais têm utilizado imunocoloração procedimentos em gânglios sensoriais, onde a informação é limitada à expressão de proteínas específicas no corpo da célula de tipos específicos ou subconjuntos de neurônios sensoriais. Aqui relatamos métodos detalhados / protocolos para a preparação de amostras de tecido periférico / visceral para a imunocoloração de fibras nervosas sensoriais periféricas. Nós métodos especificamente detalhe para a preparação da pele ou biópsia plantar e osso (fêmur) seções de camundongos para a imunocoloração de fibras nervosas sensoriais periféricas. Estes métodos não são apenas a chave para a determinação qualitativa de expressão de proteínas em neurônios sensoriais periféricos, mas também fornecem um método quantitativo para ensaiodeterminar alterações nos níveis de proteína expressão em tipos específicos ou subconjuntos de fibras sensoriais, bem como para determinar as mudanças morfológicas e / ou anatômica no número e densidade de fibras sensoriais durante vários estados patológicos. Além disso, estes métodos não estão confinados à coloração de apenas fibras nervosas sensoriais, mas também pode ser usado para a coloração de todos os tipos de fibras nervosas na pele, ossos e tecido visceral outros.

Identificação imunocitoquímica de periféricos subtipos de fibras nervosas sensoriais (e detecção da expressão da proteína nele) são fundamentais para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes a sensação periférica. Aqui descrevemos métodos para a preparação de amostras de tecido periférico / visceral, tais como ossos, pele e nos membros, para a imunocoloração específico de fibras nervosas sensoriais periféricas.

Preparação do tecido e imunocoloração de Fibras nervosas sensoriais que inervam rato da Pele e Ossos Limb

A detecção e o processamento primário de estímulos sensoriais físicos, químicos e térmicos por fibras nervosas sensoriais periféricas são fundamentais para a percepção sensorial em ...

O objetivo geral deste procedimento é obter informações sobre a organização anatômica, bem como os perfis de expressão e localização de proteínas específicas em fibras nervosas periféricas que inervam tecidos como pele e osso. Isso é realizado primeiramente mediante perfusão total do animal com fixador, seguida pela dissecação ou remoção do tecido de interesse. Em seguida, os tecidos isolados são pós-fixados e os ossos são descalcificados; utilizando um criostato, são geradas secções finas de tecido da pele e do osso, as quais são montadas em lâminas.O passo final do procedimento é realizar a imunomarcação simples ou múltipla dessas seções de tecido com anticorpos contra proteínas que são expressas e localizadas especificamente em fibras nervosas periféricas. Em última análise, podem-se obter resultados que mostram o padrão de distribuição de tipos específicos de fibras nervosas periféricas, bem como o padrão de expressão e/ou localização de proteínas específicas nas fibras nervosas periféricas por meio de microscopia de imunofluorescência, utilizando um microscópio de fluorescência epiluminiscente ou confocal. Essa abordagem pode ser usada para responder perguntas fundamentais sobre o sistema nervoso periférico, como quais são os padrões de inervação em tecidos como pele e osso?E essa abordagem pode ser estendida a órgãos viscerais e outros tecidos. Ela também pode nos informar sobre alterações na expressão de proteínas dentro desses subconjuntos de fibras nervosas sensitivas e as mudanças que podem ocorrer na expressão dessas proteínas durante processos patológicos ou desenvolvimentais. Coloque um animal que foi perfundido com PFA 4% sobre uma superfície de corte ou outra base resistente para coletar amostras de tecido da pata traseira.Segure o pé com a superfície plantar voltada para cima e pressione firmemente com uma ferramenta de biópsia de punção de três milímetros posicionada no centro do pé. Gire a ferramenta de biópsia para frente e para trás em 180 graus para garantir que ela tenha cortado completamente toda a espessura do pé. Remova suavemente a ferramenta de biópsia do pé e ejetar o tecido em um tubo estéril de dois mililitros contendo um mililitro de solução de PFA 4% ou de solução de PA 5%, para coletar, neste caso, amostras de ossos dos membros a partir do fêmur.Realize uma incisão lateral ao longo das costas do animal ao nível da pelve, que continue descendo ao longo dos dois membros posteriores. Corte a pelve e os músculos circundantes para separar o fêmur da pelve, mantendo intacta a cabeça proximal do fêmur. Em seguida, corte a tíbia ou a fíbula para manter a cabeça distal intacta e remova os músculos circundantes e o periósteo do corpo do osso.Coloque o fêmur em um tubo de dois mililitros contendo um mililitro de solução de PFA 4% ou PA 5%, e então deixe ambas as amostras passarem por pós-fixação com mistura suave em agitador durante 16 a 18 horas a quatro graus Celsius. Após a pós-fixação, descalcifique ambas as amostras transferindo-as para tubos estéreis de dois mililitros contendo 1,5 mililitros de solução descalcificante. Deixe a biópsia plantar agitar suavemente a quatro graus Celsius durante 16 a 18 horas e o fêmur por seis a sete dias.Altere a solução a cada 24 horas e monitore o tecido ósseo quanto à perda de rigidez com um par de pinças após a descalcificação. Transfira as amostras de tecido para um tubo estéril de dois mililitros com 1,5 mililitro de solução crioprotetora e coloque o tubo novamente sobre o agitador para 16 a 18 horas de mistura suave a quatro graus Celsius. Para preparar o tecido para o corte, coloque um volume de composto de temperatura de corte ideal sobre um bloco de montagem de tecido para criostato e deixe congelar na câmara do criostato a menos 20 graus Celsius.Pulverize o OCT com um aerossol criogênico para acelerar o processo de congelamento, se desejado. Posicione a amostra de tecido sobre a base de OCT para o tecido da punção plantar. Posicione as amostras de modo que se possam obter seções transversais uniformes para o tecido ósseo.Posicione o espécime para obter cortes longitudinais ao comprimento do osso. Cubra ambos os espécimes com uma camada adicional fina de OCT. Em seguida, pulverize suavemente com aerossol criogênico até que o tecido congele.Coloque o espécime sobre a cabeça de corte na câmara do criostato e deixe o bloco do espécime tecidual equilibrar-se à temperatura de corte por pelo menos uma hora para evitar cortes frágeis. Uma vez que o tecido atinja a temperatura ideal, inicie o corte do espécime para gerar seções de 40 mícrons para o tecido da biópsia plantar. Colete as seções criostáticas em placas de cultura tecidual de 12 poços contendo PB 0,1 molar com azida de sódio 10 milimolar.Certifique-se de que os cortes permaneçam submersos e armazene-os a quatro graus Celsius até o momento de realizar a imunomarcação para tecido ósseo. Colete os cortes criostáticos diretamente sobre lâminas pré-codificadas com gelatina e, em seguida, deixe secar ao ar por uma hora antes de armazenar a menos 20 graus Celsius. Cortes ósseos em lâminas armazenados dessa forma podem ser utilizados para imunomarcação dentro de dois a três meses.Usando uma lâmina de barbear, corte seis a sete milímetros da extremidade de uma ponteira de micropipeta de um mililitro e pré-condicione o interior da ponteira aspirando várias vezes 1% de soro bovino fetal em PBS 0,1 molar para evitar que as seções de tecido aderem às paredes da ponteira. Transfira oito a dez seções obtidas por punção plantar para cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Em seguida, lave-as três vezes com 500 microlitros de PBS 0,1 molar por poço durante cinco minutos com mistura vigorosa em um agitador orbital à temperatura ambiente.Em seguida, incubar os cortes na solução bloqueadora com agitação suave durante uma hora a quatro graus Celsius e, depois, prosseguir com as incubações com os anticorpos primário e secundário. Após uma lavagem final em pb, utilizar uma pipeta micrométrica recortada e tratada com FBS fresco para transferir os cortes para lâminas. Organizar os cortes com um pincel e absorver qualquer umidade em excesso, evitando exposição à luz.Incube as lâminas em temperatura ambiente para secar os cortes sobre a superfície por cinco a 30 minutos. Após secagem, aplique várias gotas de meio de montagem lentamente. Coloque uma lamínula de vidro sobre os cortes.Deixe as lâminas em repouso no escuro por cinco minutos e, em seguida, selar as bordas da lamínula com esmalte incolor. Antes da aquisição de imagens, após descongelar as lâminas à temperatura ambiente, use uma caneta de barreira hidrofóbica para delimitar a região da lâmina contendo as seções ósseas e, então, deixe secar ao ar por 10 a 15 minutos. Usando uma pipeta, aplique 250 microlitros de PBS 0,1 molar na região delimitada e lave as seções ósseas por cinco minutos.Remova o PB inclinando a lâmina e repita por mais duas vezes. Em seguida, adicione 250 microlitros de solução bloqueadora e incube as seções por uma hora a quatro graus Celsius. Após o bloqueio, prossiga com as incubações com os anticorpos primário e secundário, certificando-se de manter as lâminas em uma câmara umidificada durante as incubações noturnas.Por fim, lave com 500 microlitros de PB 0,05 molar por 15 minutos. À temperatura ambiente, mergulhe brevemente em água destilada desionizada para enxaguar as lâminas e, em seguida, deixe as seções ósseas secarem ao ar à temperatura ambiente por cinco a 30 minutos, evitando exposição prolongada à luz. Aplique o meio de montagem e coloque uma lamínula de vidro sobre as seções após deixar as lâminas em repouso no escuro por cinco minutos.Selar as bordas da lamínula com esmalte de unha utilizando microscopia epifluorescente. Aqui, diversas fibras positivas para CGRP e NF 200 são observadas como áreas vermelhas distribuídas ao longo das membranas basais na junção dérmica epidérmica na região plantar, que foram coradas com anticollagen quatro em verde; tanto as fibras positivas para CGRP quanto para NF 200 na região plantar também são visíveis por microscopia confocal, mostradas novamente em vermelho, conforme indicado pelas cabeças de seta. Enquanto isso, o marcador pan-neuronal beta três tubulina é amplamente expresso na região plantar.A marcação do TRPV1 está principalmente confinada a fibras de pequeno diâmetro que também são positivas para CGRP; tanto fibras positivas para CGRP quanto para NF200 podem ser detectadas no tecido ósseo dos membros, como mostrado aqui distribuídas por toda a matriz óssea na região esponjosa da cabeça do fêmur de camundongo, em vermelho, utilizando microscopia epifluorescente e confocal. O TRPV1 também está presente no tecido ósseo dos membros, mostrado aqui em vermelho por microscopia confocal, e co-localiza com anti-CGRP em verde.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter informações sobre as características anatômicas da inervação sensorial periférica em tecidos como pele e osso, bem como sobre a expressão e localização de diversas proteínas dentro dessas fibras nervosas sensoriais. Todo o processo, desde a dissecação até a análise microscópica, deve levar aproximadamente quatro dias para o tecido da pele e 11 dias para o tecido ósseo.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra a coloração imuno-histoquímica de fibras colinérgicas no núcleo basal da região de Meynert de seções cerebrais de camundongos. As seções são bloqueadas e tratadas com anticorpos primários contra colina acetiltransferase, seguidos por anticorpos secundários biotinilados. São adicionados complexos avidina-biotina-peroxidase, que se ligam a anticorpos secundários, seguidos pelo substrato cromogênico. As seções são então desidratadas e montadas antes de serem visualizadas ao...

Coloração imuno-histoquímica de fibras nervosas no núcleo basal de Meyner do cérebro de camundongo

Source: Boyer, N. P. et. al., Imagem e análise do transporte de neurofilamentos no nervo tibial de camundongo excisado. J. Vis. Exp. (2020) Este vídeo demonstra o método de fotoativação por fluorescência para analisar o transporte de neurofilamentos em axônios mielinizados de nervos periféricos. Ao rastrear neurofilamentos marcados com fluoróforo verde fotoativado, a técnica fornece informações sobre o transporte axonal em doenças neurodegenerativas.

Imagem de fotoativação de fluorescência do transporte de neurofilamentos em axônios mielinizados de camundongos 

O protocolo para a imagem latente longitudinal dinâmico e lesão seletiva a laser de terminações nervosas em repórter camundongos transgênicos é apresentado.

In Vivo Two-Photon Microscopia de terminações nervosas individuais em Pele

Muscle neurônios sensoriais estão envolvidos na sinalização proprioceptor e também informar sobre eventos estaduais e lesão relacionada com o metabolismo. Nós descrevemos um rato adulto em preparação músculo-nervo vitro para estudos sobre músculos aferentes ativado por estiramento.

Um In Vitro Adulto mouse para estudar as propriedades de queima de músculos aferentes

Aqui descrevemos uma nova preparação para imagens de terminais sensoriais lanceolados vivos de terminações paliçadas que inervam os folículos pilosos da pele da orelha de camundongo durante a coloração e descoloração com corantes de estiril piridínio.

Monitoramento óptico do nervo Viver Terminal Etiquetagem na folículo piloso Lanceolate Endings da<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse pele da orelha

Este artigo inclui protocolos detalhados para marcação genética de pele de camundongo, denervação cirúrgica, biópsia de pele e visualização de epitélios marcados por coloração de β-galactosidase de montagem total. Esses métodos podem ser usados para testar a necessidade de nervos em modelos de camundongos de pele normal e patológica.

A desnervação cirúrgica cutânea: um método para testar o requisito para os nervos no mouse modelos de doença de pele

Este estudo estabelece um modelo experimental de neuropatia de pura fibra pequena com reductase (RTX). Uma única dose de RTX (50 µ g/kg) é ideal para o desenvolvimento de um modelo de neuropatia de pequenas fibras que imita as características do pacientes e pode ajudar a investigar o significado molecular nociceptivo subjacente a dor neuropática.

Estabelecer um modelo de Mouse de uma neuropatia de pura fibra pequena com o ultrapotente agonista do Receptor transitório potencial Vanilloid tipo 1

Aqui nós apresentamos um protocolo para visualizar belas estruturas de nervos periféricos obtendo e seções de 1-2 µm com toluidina a coloração...

Azul de toluidina mancha de resina-incorporado seções para avaliação da morfologia do nervo periférico

Descrevemos métodos de fotoativação de fluorescência para analisar o transporte axonal de neurofilamentos em axônios mieliados únicos de nervos periféricos de camundongos transgênicos que expressam uma proteína de neurofilamento fotoativavel.

Imagem e Análise do Transporte de Neurofilamento em Nervo Tibial de Camundongo Excised

A espessura das seções teciduais limitou o estudo morfológico da inervação da pele. O presente protocolo descreve uma técnica única de limpeza tecidual para visualizar fibras nervosas cutâneas em seções de tecido espessas de 300 μm sob microscopia confocal.

Demonstrando a inervação da pele cabeluda e glabrous em um padrão 3D usando múltiplas abordagens de coloração fluorescente e limpeza de tecidos

Este manuscrito apresenta um protocolo para remoção cirúrgica dos neurônios simpáticos lombares pós-ganglionares de um camundongo. Este procedimento facilitará uma infinidade de estudos destinados a investigar o papel da inervação simpática em alvos de tecido distais.

Simpatectomia Lombar Cirúrgica em Camundongos

Aprenda a preparar tecidos e realizar imunocoloração de fibras nervosas sensoriais em pele e ossos de ratos. Este método permite visualizar a expressão proteica e os padrões de inervação periférica.

Preparação do tecido e imunocoloração de Fibras nervosas sensoriais que inervam rato da Pele e Ossos Limb

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