Name: Preparação de Intact Discos cauda bovina Intervertebral de Cultura de Órgãos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: Aprenda a preparar discos intervertebrais intactos de cauda bovina para cultura de órgãos em bioreator. Este método permite estudar efeitos mecânicos na regeneração de tecidos da coluna vertebral.

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Este projecto foi apoiado pela National Science Foundation suíço (SNF # 310030-127586/1).

1. A colheita do disco intervertebral <ol><li> Cauda bovina toda comprimento é obtido a partir de um matadouro local, se possível sem pele, pois a presença de pele aumenta a chance de contaminação (Fig. 2). </li><li> Prepare tábua de cortar e preparar grandes estação de trabalho estéril e instrumentos em cima de uma tábua de corte (Fig. 2). </li><li> Prepare sob a gaze estéril capa de fluxo laminar estéril umedecido com cloreto de sódio 0,9% contendo citrato de sódio 55mm e colocado em cada poço da placa de 6 poços. </li><li> Prepare uma bacia e diluir 1:100 de solução Betadine com água da torneira. </li><li> Mergulhe a cauda inteira bovina em uma bacia contendo solução de Betadine 1% por 5 min. </li><li> Brevemente cauda seca com gaze estéril e colocá-lo na estação de trabalho estéril. </li><li> Remova cuidadosamente muscular ao redor da cauda com lâmina de bisturi # 22. </li><li> Corta fora as partes da cauda, ​​que não são necessários, normalmente ambas as extremidades da cauda, ​​que contêm relativamente grandes e muito pequenosIVDs (Fig. 3). </li><li> Guarnição ainda mais o músculo e tendões ao redor do IVD utilizando lâmina de bisturi n º 10. Cuidado para não cortar o anel externo dos discos. </li><li> Marca anterior da IVD com um marcador de pele cirúrgica (este passo é opcional, ele ajuda a determinar o centro de rotação axial em nosso biorreator). </li><li> Localize o IVD e vértebra ponto de conexão, movendo a cauda suavemente. Sinta-se a fronteira entre IVD e osso com o lado chato de uma lâmina de bisturi. O site clivagem deve ser de 1-2 mm de distância do IVD para a vértebra. Personalizado lugar feito lâmina industrial no site clivagem (Fig. 4). </li><li> Cleave e IVD vértebra martelando em cima do suporte de lâmina custom-made industrial (Fig. 3). </li><li> Repita do outro lado da conexão IVD-vértebra. </li><li> Enrole isolado IVD com gaze esterilizada umedecida com cloreto de sódio 0,9% contendo citrato de sódio 55mm. </li><li> Continue o isolamento de IVDs para o número da amostra desejada (geralmente em torno de 6 podeser colhida com diâmetro entre 10-20 mm). </li><li> Conectar o sistema de lavagem a jato (Zimmer, inc.) Com solução de Ringer Lactato estéril é, 5L sacos são um tamanho útil (PBS estéril ou, alternativamente solução salina 0,9%). </li><li> Segure o IVD com uma pinça e jato de lavagem ambos os lados da superfície de placa terminal usando Zimmer Pulsavac sistema de jato de lavagem (Fig. 1C). A arma do jato deveria ser fuzilada na superfície da placa terminal em um ângulo entre 30 - 60 ° por cerca de 30s de cada lado. (Figs. 1 e 7) </li><li> Coloque o IVDs volta para a placa 6-bem e enrole com uma gaze umedecida, enquanto a jato de lavar outra amostra do disco. </li><li> IVDs estão prontos para a cultura de órgãos ea jusante aplicações (por exemplo, a viabilidade celular, carga mecânica, a cultura de órgãos) (Figura 1D). </li></ol> 2. Resultados representante Avaliação dos resultados de julgar uma preparação do disco intervertebral de sucesso pode ser uma experiência de difusão onde um corante fluorescente de baixo peso molecular (por exemplo, vermelho Procion)é preparado como uma solução a 1% em PBS 2. O IVD é mantida com pelo menos 100 mL de solução corante e do corante é permitido então difusa passivamente no IVD por 24h sob inchaço livre. O IVD é, então, flash-congelados em nitrogênio líquido e trazido de volta à temperatura ambiente e desidratados por uma série de transferências de acetona (primeiro pré-resfriada em -80 ° C, em seguida, -20 ° C, então 4 ° C e, finalmente, à temperatura ambiente ). O disco pode então ser incorporados em poli-metil-acrilato (PMMA) e cortar com uma lâmina afiada para produzir 100 mm de espessura. Essas seções podem ser visualizados por qualquer microscópio de campo claro padrão, mas preferencialmente pelo uso de microscopia de fluorescência desde Procion vermelha emite uma fluorescência vermelha (Figs. 5-6). O trabéculas da superfície óssea aparecem muito limpo após a etapa lavaging jet (Fig. 7). Parâmetros para uma cultura de órgão bem-sucedidos são, antes de tudo a ausência de contaminação viabilidade celular, mantido (Figs. 8-9), altura do disco e"integridade do disco" em geral, medida com cortes histológicos e safranina O / verde rápido mancha ou Hematoxilina de Meyer 3. Nós desenvolvemos protocolos e macros publicados em outros lugares 4,5 a mancha tecido do disco ao vivo e para verificar a viabilidade das células em 3D usando um microscópio de varredura confocal a laser eo kit de coloração ao vivo / morto (Molecular Probes, Invitrogen, Basel, Suíça). Nós ainda desenvolveu uma macro e de rotina para realizar a contagem de células automatizado para estimar a viabilidade das células no tecido 3D ou portadores 3D usando a plataforma ImageJ NIH 4-6. Protocolos alternativos têm sido propostos para determinar a viabilidade das células disco pela digestão inicial usando a digestão sequencial da matriz extracelular utilizando pronase colagenase e tipo 2 e em seguida, para manchar a suspensão de células 7. Uma versão anterior do protocolo envolveu um passo de incubação no PBS contendo dez vezes mais concentrado concentração de penicilina / estreptomicina por 10 min após a colheita dos discos anteriores órgão cuLTURE. Com o passo a lavagem a jato esta etapa torna-se obsoleta, pois esta etapa parece benéfica para fins de cultura. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Visão geral das etapas metodológicas para preparar bovina coccígea discos intervertebrais com placas terminais intactas e uma fina camada (1-2mm) do osso. A) Visão esquemática do disco intervertebral (IVD) e seus caminhos nutricionais. B) Procedimento para cortar o IVD com um personalizado porta-lâmina e uma lâmina afiada industrial. C) lavagem Jet passo para garantir a viabilidade das células de alta e para permitir a troca de nutrientes mantendo a placas e 1-2 mm de osso anexado em ambos os lados. D) Finalmente, o IVD podem ser cultivadas na câmara de espécime de um biorreator ou ser usado para qualquer aplicação a jusante. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 TOP:. Todo o comprimento da cauda de bovino fresca (de preferência obtaINED dentro de 2-3 horas post-mortem para garantir a viabilidade das células de altura. Baixo: imagem de raios-X de uma cauda de bovinos com idade entre cerca de 6 meses, ilustrando a existência de placas de crescimento (GP), centro secundário de ossificação, entre as placas ósseas (EP) e os corpos vertebrais (VB). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. A Tools) para dissecar a cauda bovina em condições estéreis. B) Customized porta-lâmina para cortar-out segmentos dinâmicas da cauda de bovinos de corte em ação, enquanto o disco intervertebral. C) Vista lateral do porta-lâmina personalizado com uma lâmina de padrão industrial (Lutz, Alemanha). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Desenho e imagem da cauda bovina após a remoção do ligamento muscular circundante e ilustrando os sites cleaving para cortar os segmentos de dinâmicas. Vértebra parcial deve ser "rachado" wiª o porta-lâmina custom-made idealmente 1-2 mm de distância da placas terminais cartilaginosas para garantir superfície óssea completa. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Demonstração da limpeza eficaz da etapa de lavagem a jato, antes (A) e após (B). Observe as superfícies limpas óssea dos segmentos do disco intervertebral após o procedimento de pulverização. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig6.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Free-inchaço experiência difusão de recém-preparados excisadas discos cauda bovina intervertebral (IVDs) saiu por 24 horas em solução Procion 1% vermelho, demonstrando efeito bloqueio pela placa de crescimento. A vista digitais de raios-X sagital de um IVD ainda contendo a placa de crescimento e uma segunda camada de imagem de microscopia fluorescente de osso corte sagital através do explante disco intervertebral coccígea bovina com placa terminal cartilaginosa e óssea após 24h livre difusão. GP: placa de crescimento, 2ndry CO: centro secundário de ossificação. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig7.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Free-inchaço experiência de recém-preparados excisadas discos cauda bovina intervertebral (IVDs) saiu por 24 horas em solução Procion 1% vermelho, demonstrando efeito do tratamento de limpeza a jato lavagem. Sagital de espessura (~ 100 mm) de excisadas IVDs bovina com ~ 1,5 mmthick placas final ósseo que sofreu lavagem a jato de tratamento (Esquerda) lado controle sem tratamento (Direito) jet-lavaged tratamento. Entrada mostra o padrão de pulverização, que foi usado a partir do sistema Zimmer desbridamento da ferida 24h experimentos livre difusão de bovinos explantes disco intervertebral em vermelho Procion 1%. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig8.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Images Live / Dead of projeções de pilhas confocal Imaging (250μm), proveniente de bovinsegmentos do disco intervertebral e preparado com este método a jato de lavagem mantidos sob livre inchaço para 0 e 14 dias respectivamente para o núcleo pulposo (NP), o interior anel fibroso (IA) eo anel fibroso exterior (OA). Células verde = células vivas manchada pelo calceína AM (acetil metílico), glóbulos vermelhos = núcleo células mortas coradas pelo homodímero de etídio-1. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig9.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 9"> Figura 9. Viabilidade celular de disco intervertebral usando microscopia confocal a laser de varredura em tecido vivo e digitalização 3D de pilha. A viabilidade das células de núcleo pulposo (NP) e fibrose do anel (AF) ao longo dos 21 dias de cultura em free-inchaço condição. (Média ± EPM, N = 6) As diferenças estatísticas foram testados usando não-paramétrico Kruskal-Wallis assinado Rank Sum Test entre os grupos. Foram encontradas diferenças significativas entre o dia 21 e todos os pontos de outra época da NP. Enquanto na AF diferenças significativas foram encontradas entre os dias 7 adia 0. (* P &lt;0,05, ** p &lt;0,01).

<ol><li>Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+organ+culture+of+the+bovine+intervertebral+disc%3A+effects+of+vertebral+endplate+and+potential+for+mechanobiology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa++1976%29%22%5BJournal%5D)">In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies.</a> Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).</li>
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<li>Gantenbein, B., Grünhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+organ+culturing+system+for+intervertebral+disc+explants+with+vertebral+endplates%3A+a+feasibility+study+with+ovine+caudal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs.</a> Spine. 31, 2665-2673 (2006).</li>
<li>Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervertebral+disc+cell+response+to+dynamic+compression+is+age+and+frequency+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent.</a> J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).</li>
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<li>Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intact+intervertebral+disc+organ+culture+system+in+which+degeneration+can+be+induced+as+a+prelude+to+studying+repair+potential%5BTitle%5D)+AND+%22European+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential.</a> European Spine Journal. , 1-11 (2011).</li>
</ol>

Não temos nada a revelar.

O primeiro passo para a cultura de órgão bem-sucedido é ter certeza de que o explante não deve ser contaminada. A cauda deve ser descascado antes de começar com o procedimento. Qualquer pêlos levados a um laboratório estéril pode ser problemático em termos de contaminação. A cauda bovina deveriam idealmente ser o mais fresco possível (isso afeta a viabilidade celular inicial). Além disso, a etapa de lavagem betadine é recomendada para reduzir o risco de novas contaminações. Em vez de usar uma lâmina custom-made e um mar...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comments (opcional) </td></tr><tr><td colspan="4"> Tecido do disco intervertebral de bovino fresca da cauda de bovinos, de matadouro local (de preferência dentro de horas post-mortem e sem pele). </td></tr><tr><td> Além disso Pulsavac AC Sistema </td><td> Zimmer inc., Suíça </td><td> 00-5150-486-01 </td><td> Melhor desempenho com a cabeça hip-spray e com fonte de alimentação AC (aquele com os 8 AA bateria que também trabalham, mas é menos conveniente) </td></tr><tr><td> Alta Capacidade Fan spray w / Splash Shield, 12,7 centímetros de comprimento </td><td> Zimmer inc., Suíça </td><td> 00-5150-175-00 </td><td> Existem vários pulverizadores disponíveis, nós testamos esta um sucesso </td></tr><tr><td> Lâminas de bisturi # 22 e # 10 </td><td> Swann-Mortem, Inglaterra </td><td> # 10: 0201 # 22: 0208 </td><td></td></tr><tr><td> Titular lâmina de bisturi # 3 e # 4 </td><td> Hausmann, Alemanha </td><td> # 3: 06.103.00 # 4: 06.104.00 </td><td></td></tr><tr><td> Lutz industrial blade </td><td> Lutz, Alemanha </td><td> 1022.0884 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão fosfato salino (PBS) </td><td> Invitrogen, Suíça </td><td> 10010-023 </td><td></td></tr><tr><td> Modificado Dulbecco Eagle Medium (DMEM) </td><td> Gibco, Suíça </td><td> 11960-044 </td><td></td></tr><tr><td> Solução de Ringer com lactato (sem glicose) </td><td> Bichsel, Suíça </td><td> 133 0002 </td><td></td></tr><tr><td> 6 bem-placa multi-bem </td><td> TPP, Suíça </td><td> 92006 </td><td></td></tr><tr><td> Solução de Betadine </td><td> Mundipharma, Suíça </td&gt; <td> 10055025 </td><td></td></tr><tr><td> Marcador cirúrgico da pele </td><td> Porex Cirúrgica, Suíça </td><td> 9560 </td><td></td></tr><tr><td> Tábua de corte grande </td><td></td><td></td><td> Qualquer marca é possível </td></tr></tbody></table>

preparação de intact discos cauda bovina intervertebral de cultura de Órgãos

Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture

O disco intervertebral (IVD) é a articulação da coluna vertebral conectando vértebra em vértebra. Ele funciona para transmitir carga de coluna vertebral e dar flexibilidade à coluna vertebral. Compõe de três compartimentos: o núcleo pulposo interior (NP) que abrange pelo anel fibroso (AF) e duas placas terminais cartilaginosas que liga o NP e AF do corpo vertebral em ambos os lados. Dor discogênica possivelmente causada por uma doença degenerativa do disco intervertebral (DDD) e hérnia discal tem sido identificada como um problema grave em nossa sociedade moderna. Para estudar possíveis mecanismos de degeneração IVD, em sistemas de órgãos de cultura in vitro com células de discos ao vivo são altamente atraente. O cultivo in vitro de bovinos intactos IVDs coccígea tem avançado a um sistema-modelo relevante, que permite o estudo de mecano-biológico aspectos em um ambiente bem controlado fisiológicas e mecânicas. IVDs cauda de bovinos podem ser obtidos relativamente fácil em maior número umd são muito semelhantes ao humano IVDs lombar em relação à densidade celular, a população de células e dimensões. No entanto, anterior caudal bovina técnicas de colheita IVD retenção placas terminais cartilaginosas e ósseas placas terminais falhou após 1-2 dias de cultura desde as vias de nutrição foram, obviamente, bloqueada por sangue coagulado. IVDs são os maiores órgãos avascular, assim, os nutrientes para as células do NP são exclusivamente dependentes de difusão através da brotos capilares do corpo vertebral adjacente. Presença de resíduos de osso e sangue coagulado nas superfícies placa motora pode dificultar a difusão de nutrientes para o centro do disco e viabilidade celular compromisso. O nosso grupo estabeleceu um protocolo relativamente rápida de &quot;crack&quot;-out do IVDs da cauda com um baixo risco de contaminação. Somos capazes de permeabilizar o recém-cortadas superfícies ósseas placa terminal usando um sistema de lavagem a jato cirúrgica, que remove os coágulos de sangue e restos de corte e de forma muito eficiente reabre o caminho de difusão de nutriçãopara o centro do IVD. A presença de placas de crescimento em ambos os lados do osso vertebral tem que ser evitado e ser removidos antes da cultura. Neste vídeo, que descrevem as etapas cruciais durante a preparação e demonstrar a chave para uma cultura de órgão bem-sucedido manter a viabilidade celular de alta por 14 dias, sob inchaço cultura livre. O tempo de cultura poderia ser estendido quando o ambiente mecânico adequado pode ser mantida usando biorreator carga mecânica. A técnica demonstrada aqui pode ser estendido a outras espécies animais, como suínos, ovinos e isolamento caudal e lombar leporinos IVD.

Este protocolo ilustra uma técnica de colheita, para coccígea bovina discos intervertebrais para a cultura de órgãos para<em&gt; In vitro</em&gt; Cultura do órgão.

Preparação de Intact Discos cauda bovina Intervertebral de Cultura de Órgãos

O disco intervertebral (DIV) é a articulação da coluna vertebral que conecta vértebra a vértebra. Ele funciona para transmitir a carga da coluna e proporcionar...

O objetivo geral deste procedimento é preparar discos intervertebrais intactos provenientes da cauda de bovino para cultura e outras aplicações subsequentes; em nosso caso, preparar discos intervertebrais para cultura em um biorreator utilizando carga mecânica complexa. Isso é realizado primeiramente desinfetando a cauda de bezerro e, em seguida, removendo os músculos para obter uma visão clara das estruturas ósseas e dos discos. Em seguida, um único disco intervertebral é cortado, mantendo dois a três milímetros da vértebra parcial presos em ambos os lados, utilizando uma ferramenta de corte personalizada.O terceiro passo é limpar as superfícies ósseas do disco intervertebral com o sistema de lavagem por jato, o que garante a difusão de pequenas soluções, como glicose, até o centro do disco intervertebral. O passo final é colocar o disco intervertebral em um tampão estabilizante ou envolvê-lo em gaze estéril para mantê-lo úmido para aplicações posteriores. Em última análise, o sucesso do procedimento é avaliado por meio de uma coloração de células vivas e mortas para verificar a presença de células viáveis após 14 ou 21 dias do início do cultivo do disco intervertebral.O protocolo a seguir tem como objetivo demonstrar como segmentos de discos invertíveis podem ser preservados para cultura de órgãos, o que pode auxiliar na resposta a questões fundamentais em mecanobiologia e engenharia de tecidos. Há boas razões pelas quais o disco da cauda de bovino se tornou um tipo de sistema modelo na engenharia de tecidos. Primeiramente, a densidade celular é muito semelhante e muito baixa, como no disco intervertebral humano.Em segundo lugar, a população celular presente é a ausência de células cordais, o que é bastante semelhante também à situação humana. Em terceiro lugar, as dimensões e a composição bioquímica são muito semelhantes à situação humana. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é difícil distinguir a placa óssea terminal do osso da vértebra, e, portanto, será difícil garantir a presença da placa de crescimento cartilaginosa.Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando estávamos procurando uma técnica rápida e estéril para isolar o disco invertível com placa vertebral para cultura individual. A demonstração visual destes métodos é importante porque é difícil localizar um local de corte, já que o local de corte está situado a apenas um milímetro de distância da placa óssea. Primeiro, obtenha uma cauda bovina inteira de um matadouro local.Idealmente, a cauda deve ser obtida não mais do que quatro horas após a morte e deve ser coletada com a pele removida. Como a presença de pele aumenta a possibilidade de contaminação, certifique-se de que todos os instrumentos a serem utilizados no processo de dissecação sejam estéreis. Além disso, crie uma estação de trabalho estéril colocando uma tábua de corte autoclavada sobre a superfície de trabalho.Em seguida, trabalhando em uma cabine de fluxo laminar estéril, umedeça um pedaço de gaze estéril com solução estéril de cloreto de sódio a 0,9% contendo citrato de sódio a 55 milimolar. Coloque um pedaço de gaze umedecida em cada poço de uma placa de seis poços. A seguir, encha uma bacia limpa com solução de Betadine de 1 a 100 diluída em água da torneira e imerja a cauda na solução por cinco minutos.Após a imersão, remova a cauda. Seque-a brevemente com gaze estéril e coloque-a na bancada estéril. Primeiro, utilize um bisturi número 20 ou número 22 para remover o músculo ao redor da cauda. Em seguida, use uma guilhotina para cortar as partes indesejadas da cauda, geralmente das regiões proximal e distal, que contêm discos intervertebrais relativamente grandes e muito pequenos.Em seguida, utilize uma lâmina número 10 para remover os músculos e tendões ao redor dos discos intervertebrais. Tenha cuidado para não cortar o anel externo dos discos, se necessário. Para fins de orientação, marque a face anterior do disco intervertebral usando um marcador cirúrgico para pele.Em seguida, mova suavemente a cauda para localizar o disco intervertebral e o ponto de conexão com a vértebra. Use o lado rombo da lâmina de bisturi para delinear o limite entre o disco intervertebral e o osso. Em seguida, localize o local de clivagem, que deve estar a um ou dois milímetros de distância do disco intervertebral em direção à vértebra.Coloque o suporte personalizado para lâmina industrial no local de corte. Este diagrama mostra claramente o local de corte. Corte o disco intervertebral e as vértebras batendo na parte superior do suporte personalizado para lâmina industrial. Em seguida, mova o suporte da lâmina para o outro lado da articulação entre o disco intervertebral e as vértebras e bata por este lado da conexão entre o disco intervertebral e as vértebras para liberar o disco intervertebral.Em seguida, isole rapidamente o disco intervertebral com gaze estéril umedecida com cloreto de sódio 0,9% contendo citrato de sódio 55 milimolar. Repita o processo para obter o número desejado de discos intervertebrais. Geralmente, cerca de seis discos com diâmetro entre 10 e 20 milímetros podem ser obtidos de uma única cauda.Após a coleta de todos os discos invertíveis, conecte o sistema de lavagem por jato a um saco de três litros de solução de Ringer com lactato estéril, PBS estéril ou solução salina estéril a 0,9%. Em seguida, segure um disco invertível com pinça e realize a lavagem por jato em ambos os lados da superfície da placa terminal por 30 segundos em cada lado, mantendo o jato em um ângulo de 30 a 60 graus em relação à superfície da placa terminal; esta imagem mostra o efeito de limpeza da lavagem por jato. A fileira superior de discos mostra os discos invertíveis antes da limpeza, enquanto a fileira inferior mostra os mesmos discos após a limpeza.Após lavar o primeiro disco intervertebral, envolva-o em gaze úmida enquanto lava os outros discos invertidos. Após a lavagem, os discos invertidos estão prontos para o cultivo de órgãos. Além disso, um experimento de difusão pode ser realizado para determinar o sucesso do preparo do disco invertido enquanto se trabalha em uma capela de fluxo laminar.Prepare 40 mililitros de meio de cultura DMEM estéril contendo 5% de soro bovino fetal por disco. Transfira o meio para um béquer e, em seguida, mergulhe um único disco intervertebral no meio. Coloque o béquer em uma plataforma agitadora dentro de uma incubadora de cultura de tecidos ajustada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Os discos intervertebrais podem ser cultivados dessa maneira por cerca de 14 dias. O uso dessas câmaras de espécime personalizadas mantém uma carga mecânica apropriada, o que permite um tempo prolongado de cultivo. Primeiro, prepare 40 mililitros de meio de cultura DMEM estéril contendo 5% de soro fetal bovino por disco, como anteriormente.Em seguida, coloque o disco invertível em uma das câmaras de cultura personalizadas e adicione 40 mililitros do meio recém-preparado. Feche a câmara sob a capela de fluxo. Coloque a câmara de espécimes personalizada em uma incubadora de cultura de tecidos.Adicione peso à câmara de acordo com a área superficial dos discos. Primeiro, prepare 100 mililitros de uma solução a 1% de um corante fluorescente, como o proso red em PBS, por disco intervertebral. Em seguida, imerja o disco na solução e incube durante a noite sob as mesmas condições.No caso do cultivo com inchaço livre, após a incubação, congele rapidamente o disco em nitrogênio líquido e, em seguida, imerja na acetona a menos 80 graus Celsius. Em seguida, o disco intervertebral é trazido lentamente de volta à temperatura ambiente por meio de incubações de 24 horas em acetona a menos 20 graus Celsius, a quatro graus Celsius e, finalmente, em acetona à temperatura ambiente. Após o disco ser restaurado à temperatura ambiente, embutir completamente o disco em polimetilmetacrilato por um a duas semanas, conforme procedimentos padrão.Uma vez totalmente embutido, o disco é processado mediante corte com uma lâmina afiada e polimento com uma retificadora. Após o processamento, a difusão do pro cy red por todo o disco pode ser avaliada por microscopia. Essas imagens mostram os resultados de um experimento de difusão em inchaço livre.O painel C mostra a visão geral por raios X de um disco invertido com as duas placas ósseas terminais preparadas com o nosso método. No lado superior, a placa de crescimento não foi removida e foi visualizada por microscopia de fluorescência. Pode-se observar que a difusão do corante fluorescente vermelho é bloqueada pela presença da placa de crescimento rotulada como gp, a qual, portanto, atua como uma barreira para a coloração das camadas mais profundas da placa cartilaginosa terminal e do disco invertido.A placa de crescimento situa-se entre os centros primário e secundário de ossificação, identificados como co. Se a placa de crescimento tiver sido removida com sucesso, o corante fluorescente vermelho pode difundir-se livremente até o núcleo pulposo, identificado como np. Essas imagens demonstram o efeito de limpeza do tratamento com lavagem por jato. As seções sagitais têm uma espessura de cerca de 100 micrômetros e as placas terminais ósseas têm cerca de 1,5 milímetro de espessura. Aqui, o disco intervertebral foi submetido ao tratamento com lavagem por jato e a difusão do corante pode ser observada ao longo de toda a placa terminal. No entanto, o corante não se difunde bem no lado controle, onde o tratamento com lavagem por jato não foi realizado.Aqui observamos imagens de microscopia confocal de células vivas e mortas obtidas de segmentos de disco invertido bovino preparados com este método de lavagem por jato e mantidos em condições de inchaço livre para o processo nuclear, rotulado como np, o anel fibroso interno, rotulado como IA, e o anel fibroso externo, rotulado como oa. As regiões verdes são células vivas coradas com acetoximetil de cálcio, e as áreas vermelhas são núcleos de células mortas corados com aum. Homodímero um aqui, imagens das mesmas regiões demonstram que um grande número de células viáveis, indicado pela fluorescência verde, permanece após 14 dias em condições de inchaço livre.Este gráfico mostra a viabilidade celular das regiões do núcleo pulposo e da fibrose do anel dos discos intervertebrais ao longo do período de cultivo de 21 dias, com resultados médios mais ou menos o erro padrão da média para seis amostras. Conforme mostrado. As diferenças estatísticas foram testadas utilizando testes não paramétricos de soma de postos sinalizados de Rosco Wallace entre os grupos.Foram encontradas diferenças significativas entre o dia 21 e todos os demais pontos temporais no núcleo pulposo, enquanto no anel fibroso. Foram encontradas diferenças significativas entre o dia sete e o dia zero. Após este procedimento, essa condição de cultivo pode ser modificada para responder a perguntas adicionais, como a entrada de carga mecânica, fatores nutricionais ou de crescimento na progressão dessa degeneração ou regeneração. Nosso protocolo acelera a técnica de colheita, permitindo que segmentos de disco interpretáveis possam ser obtidos para abordagens de engenharia tecidual que medem a fisiologia ou a mecanobiologia. Nos métodos tradicionais, utiliza-se uma serra de fita histológica ou técnica de corte com mandril, que demandam cerca de duas horas a mais do que o nosso protocolo.

preparation-intact-bovine-tail-intervertebral-discs-for-organ

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