Name: Visualização dos Vascular Ca 2 + Sinalização Disparado por parácrina ROS Derivado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Aprenda a visualizar a sinalização de cálcio vascular desencadeada por espécies reativas de oxigênio derivadas de macrófagos. Este método utiliza corantes sensíveis à oxidação e sensores fluorescentes em um modelo de co-cultura de células endoteliais.

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Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde de subvenção (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) a MM. Nosso artigo é parcialmente suportado pelo Carl Zeiss microfilmagem LLC.

Espécies reativas de oxigênio pode ser medido em células vivas usando corantes de oxidação sensíveis (1 e 2) ou usando sensores de plasmídeo (3 e 4) por microscopia confocal. 1. Visualização de citosólica ROS em células J774 <ol><li> Crescer J774.1 rato macrófagos derivados de monócitos (10 6 células / ml) em fundo de vidro de 35 mm pratos (Harvard Apparatus) durante 48 h. </li><li> Células desafio com agonistas TLR (2 mg / ml, Lipo-Teicóicos acid-agonista TLR2; 10μg/ml, Poly (I: C) TLR3-agonista, 1 mg / ml LPS-agonista TLR4) por 6 horas a 37 ° C. Nota: Os macrófagos tratados em condições semelhantes foram utilizados para co-cultura modelo de Ca 2 + mobilização. </li><li> Adicione o corante de oxidação-sensível H 2 DCF-DA (Invitrogen) para obter uma concentração final de 10 mM em ECM (meio extracelular: 121 mM NaCl, 5 mM NaHCO 3, 10 mM Na-HEPES, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 10glucose mM e 2,0% de dextran, pH 7,4; todos obtidos da Sigma) contendo BSA 2% para os pratos e as células incubar por 20 min antes visualização sob microscopia confocal. </li><li> Depois de carregar dye, visualize as células colocadas em um palco temperatura controlada de um sistema de imagem apropriado. Usamos Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema de imagem confocal juntamente com fonte de laser de argônio em um íon de excitação de 488 nm para DCF fluorescência usando objetivo de petróleo 40x 13 (Fig. 1A e D). </li><li> Analisar imagens usando software ImageJ (1,44), software disponível gratuitamente a partir do National Institutes of Health (Rasband, WS, ImageJ, EUA National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EUA, <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij /</a> , 1997-2009). </li></ol> 2. Visualização das operações principais de refinanciamento em células J774 <ol><li> Crescer J774.1 rato macrófagos derivados de monócitos (10 6 células / ml) em fundo de vidro de 35 mm pratos (Harvard Apparatus) durante 48 h. </li><li>Desafio as células com ligantes TLR para induzir OPR de produção (2 mg / ml, Lipo-Teicóicos ácido TLR2; 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4) por 6 h, a 37 ° C. </li><li> Adicionar superóxido mitocondrial indicador MitoSOX Red (Invitrogen) para dar uma concentração final de 5 mM em ECM contendo BSA 2% para os pratos e as células incubar por 30 min a 37 ° C para permitir carregamento de MitoSOX Vermelho. </li><li> Depois de carregar dye, visualize as células em um estágio de temperatura controlada de uma lente Carl Zeiss LSM 510 Meta confocal casal sistema de imagem com Argon fonte de laser de íons em uma excitação de 561 nm para MitoSOX Red fluorescência usando objetiva 40x de óleo (Fig. 1B e E). </li><li> Para os experimentos de controle, depois de carregar adicionar corante PBS ou DMSO (controle negativo) ou Antimicina 2μM A. (Como superóxido mitocondrial de controle do gerador-positivo) para as células antes de a imagem da amostra, conforme descrito em 2.4 (Fig 1C) </li><li> Analisar as imagens usando o software ImageJ (1,44). </li></ol> 3. Visualizatiem citosólica de ROS na estáveis ​​Hyper-cito MPMVECs <ol><li> Usamos pHyPer-cito (Evrogen) uma codificação de vetor de expressão de mamífero uma hiper sensor fluorescente que localiza no citoplasma e especificamente a concentração sentidos submicromolar de H 2 O 2 14. </li><li> Transfectar murino pulmonar células endoteliais microvasculares (MPMVECs) com pHyPer-cito vector usando eletroporação ou reagentes de transfecção. Nós usamos 10 x 10 6 células e transfecção com 10μg de pHyPer-cito via eletroporação usando BioRad Gene pulser sistema electroporator (250V, 500 mF). MPMVECs cultivo em meio DMEM suplementado com 10% FBS, aminoácidos não essenciais, suplemento de crescimento endotelial e antibióticos. Nota: Após transfecção, as células da placa em baixa densidade para facilitar o crescimento da colônia. </li><li> Substituir médio com meio de cultura completo suplementado com 500 mg / ml G418, 48 horas após transfecção. Tela para clones que têm maior percentual de H yper células positivas ea passagem Hiper clones positivos para aumentar o número de hiper células positivas (Fig. 2). Nota: Nós usamos diluição seriada de células para a seleção clonal de células individuais e tela para as células altamente estáveis ​​expressando Hyper. </li><li> Crescer estável Hyper-cito MPMVECs em 0,2% de gelatina lamínulas revestido (80 confluência%). Células dia seguinte desafio com ligantes TLR (2 mg / ml, ácido-TLR2 lipoteicóico; 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4) por 6 horas a 37 ° C. Células não tratadas servir como controle. </li><li> Após o tratamento, montar as lamelas em Attofluor células na câmara (Invitrogen). Adicionar 1 ml de pré aquecido Hanks solução salina balanceada (HBSS) para a câmara e colocar a câmara em um palco temperatura controlada de Carl Zeiss LSM 510 Meta confocal sistema de imagem. Visualizar e mudar a imagem de fluorescência de uma excitação de 488 nm usando objetiva 40x de óleo (Fig. 3A e D). </li><li> Analisar imagens usando software ImageJ (1,44) (ver secção 6). </li></ol>ESIGNAÇÃO "&gt; Visualization 4. mitocondrial de ROS na estáveis ​​Hyper-dMito MPMVECs <ol><li> Usamos pHyPer-dMito (Evrogen) uma expressão de mamíferos vetor de codificação mitocôndrias Hiper-alvo que localiza na concentração sentidos mitocôndria e, especificamente, submicromolar de H 2 O 2. </li><li> MPMVECs transfecção com pHyPer-dMito e gerar estável Hyper-dMito MPMVECs seguintes passos descritos na secção de 3,2-3,3. </li><li> Crescer estável Hyper-dMito MPMVECs em 0,2% de gelatina lamínulas revestido (80 confluência%). </li><li> Células dia seguinte desafio com ligantes TLR (2 mg / ml, ácido-TLR2 lipoteicóico; 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4) por 6 horas a 37 ° C. Células não tratadas servem como controle negativo. Adicionar Antimicina 2μM A amostra (superóxido mitocondrial controle indutor positivo) antes da visualização. </li><li> Após o tratamento, montar as lamelas em Attofluor células na câmara (Invitrogen). Adicionar 1 ml de solução pré-aquecida de sal equilibrada Hanks (HBSS) para a câmarae colocar a câmara em um palco temperatura controlada de Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema de imagem confocal. Visualizar e mudar a imagem de fluorescência de uma excitação de 488 nm usando objetiva 40x de óleo (Fig. 3B, C e E). </li><li> Analisar imagens usando software ImageJ (1,44) (ver secção 6). </li></ol> 5. Co-cultura modelo para a visualização de parácrinos derivados ROS desencadeada Ca 2 + de sinalização em células endoteliais Para a visualização e medição de [Ca 2 +] i mudanças que usar um Ca 2 + sensíveis corante fluorescente fluo-04:00 (Invitrogen). <ol><li> MPMVECs crescer em 0,2% de gelatina revestidos lamínulas de vidro 25mm (80 confluência%). </li><li> Incubar as células cultivadas em lamínulas em temperatura ambiente por 30 min em ECM contendo BSA 2% e ácido PLURONIC 0,003% com 5 mM fluo-04:00 concentração (Invitrogen) final para permitir carregamento de fluo-04:00. Depois de carregar, lavar as células com uma solução de imaging experimental (ECM contendo 0.25% BSA) contendo sulfinpirazona para minimizar a perda de corante. </li><li> Depois de carregar fluo-4, monte lamínulas para Attofluor células na câmara (Invitrogen). Adicionar 800μl de pré aquecido solução de imagem experimental para a câmara e colocá-lo em um palco temperatura controlada de Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema de imagem confocal. </li><li> Em uma etiqueta do tubo separar os macrófagos ativados ou não ativadas isolado de qualquer tipo selvagem ou gp91 phox-/ - ratos (tratados com LPS por 6 hr) com rastreador celular vermelho CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen) em ECM contendo BSA 2% e ácido PLURONIC 0,003%. Lavar e ressuspender as células com 200μl de solução de imaging experimental. </li><li> Adicionar macrófagos marcados para fluo-04:00 carregado MPMVECs na montagem de câmara. </li><li> Registre a fluorescência verde e vermelho a cada 3s por 10-20 min usando Carl Zeiss LSM510 Meta sistema de imagem confocal com uma fonte de laser de argônio ion com excitação a 488 e 561 nm para fluo-04:00 e rastreador celular fluorescência vermelha respectively (Fig.4 AC). Nota: Como alternativa, J774.1 linhagem de células poderiam ser usadas para provocar MPMVECs Ca 2 + mobilização. </li><li> Analisar fluo-4 mudanças de intensidade de fluorescência usando software ImageJ (1,44) (ver secção 6). </li></ol> 6. Análise de dados usando software ImageJ Transferir as imagens obtidas a partir do sistema confocal como um arquivo de formato. Lsm para análise de dados. ZEN ZEN 2009 e 2010, desde software com microscópio LSM 510 Meta ou confocal LSM 710 microscópio confocal multifotônica respectivamente salva os arquivos em formato. Lsm. Recomendamos o uso desse nativo. Lsm arquivos para análise de imagens como a qualidade original é mantida. Este formato de arquivo pode ser diretamente aberto em análise de imagem programa Image J. Os passos seguintes são um exemplo de análise quantitativa de imagem única. Sem plugins adicionais são necessários para a análise desses dados. <ol><li> Lsm. Abertas ou arquivo. TIFF no programa Image J usando FILE&gt; OPEN </li><li> Clique na guia IMAGE&gt; COCANAIS LOR&gt; SPLIT e dividir os canais verde e DIC. Use a imagem do canal verde para análise posterior. </li><li> Dê um duplo clique e selecione o "Elliptical escova seleção tab" e defina o valor de pixels a 20. </li><li> Para o Hyper-cito imagens, clique em uma única célula para definir a área circular de medição. Em seguida, pressione "M" para medir a intensidade da área selecionada. Os valores são mantidos em uma janela de novos resultados. </li><li> Em seguida, segurando "Shift", clique em uma célula-chave diferentes para selecionar uma outra área, seguido da opção "M". A intensidade é registrado na janela de resultado. Repita os passos 4-5 na 50 células diferentes. </li><li> Para o Hyper-d mito imagens, defina o valor de pixels a 10 na seleção escova elípticas. Região de interesse (ROI) tem de ser rastreada manualmente incluindo as mitocôndrias das células particular. </li><li> Usando freehand, trace a região de cerca de mitocôndrias e pressione "M". Repita os passos 6-7 em 50 células diferentes. </li><li> Copie o me valores de uma janela de resultados e cole em uma folha de Excel ou qualquer outro software para plotar os resultados. Usamos tanto SigmaPlot ou GraphPad Prism para plotar os dados como gráfico. </li></ol> 7. Resultados representante A Figura 1 mostra citosólica e mitocondrial de produção ROS após desafio com ligantes TLR. Representante imagens confocal mostram aumento de DCF (citosólicos) e Red MitoSOX (mitocôndrias) fluorescência após 6 horas de estimulação. Mudanças de fluorescência foram normalizados e expressa como alteração fold. A Figura 2 mostra a geração de estável Hyper-cito e Hyper-dMito células endoteliais. Células endoteliais do mouse foram transfectadas com pHyPer-cito ou pHyPer-dMito constrói plasmídeo via eletroporação. Células plasmídeos expressando estavelmente foram selecionados com G418 por duas semanas. Após a seleção, as células diluídas foram semeadas em placas de 96 também. Colônias individuais foram isolados e fotografada para a expressão homogênea. e_content "&gt; Figura 3 mostra a medição da endoteliais citosólica e mitocondrial H 2 O 2 níveis. Representante imagens confocal mostram o aumento do Hyper-cito (citosólicos) e hiper-dMito (mitocôndrias) fluorescência após 6 horas de estimulação. alterações de intensidade de fluorescência foram normalizados e expressa como alteração fold. A Figura 4 mostra a avaliação dos macrófagos derivados de ROS induzida endotelial citosólica Ca 2 + mobilização. LPS-estimulado macrófagos pulmonares foram adicionados em células endoteliais microvasculares (PMVEC) que tinha sido previamente carregado com o Ca 2 + intracelular ([Ca 2 +] i) corante indicador de Fluo-4. Aplicação de tipo selvagem LPS-macrófagos ativados evocou uma [Ca 2 +] i aumento PMVECs que foi atenuada por nocaute de oxidase NADPH funcional (gp91 phox-/ -). <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Visualizatiem celulares de macrófagos gerada ROS e superóxido mitocondrial. J774.1 células foram desafiados com ligantes TLR2, 3 e 4 (2 mg / ml, ácido-TLR2 lipoteicóico; 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4). Por 6 h em 37 ° C. Após tratamento as células foram carregadas com (A) celular ROS indicador (H 2 DCF-DA; fluorescência verde) ou (B) O indicador de superóxido mitocondrial (MitoSOX Vermelho; fluorescência vermelha). (C) A Antimicina foi usado como um controle positivo para a produção de ROS mitocondrial. Alterações intensidade de fluorescência foram avaliadas através de microscopia confocal. (D) e (E) A determinação quantitativa da mudança de fluorescência média. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Representação esquemática de geração de expressão estável de citosólica das células endoteliais e indicadores mitocondrial ROS. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. V. isualization da endoteliais citosólica e mitocondrial H 2 O 2 níveis MPMVECs expressar de forma estável (A) Hyper-cito ou (B) Hyper-dMito foram desafiados com TLR2, 3 e 4 ligantes (2 mg / ml, ácido-TLR2 lipoteicóico; 10μg / ml, Poly (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4) por 6 horas a 37 ° C. (C) A Antimicina foi usado como um controle positivo para a produção de ROS mitocondrial. Após o tratamento, alterações de intensidade de fluorescência foram avaliadas através de microscopia confocal. (D) e (E) A determinação quantitativa da mudança de fluorescência média. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Macrófagos derivados de ROS provocar deficiência de células endoteliais Ca 2 + mobilização. (A) Representação esquemática de células endoteliais / estudo do modelo de macrófagos co-cultura. (B), recentemente isolado macrófagos murinos de ambos os WT e camundongos gp91phox nulo (O Laboratório Jackson) foram ativadas por 1 mg / ml LPS por 6 h. Macrophages foram marcados com células-tracker Red (vermelho) e depois acrescentada a Fluo-4 PMVECs carregado (verde) para avaliar parácrina O 2 • -. sinalização (C) LPS-activated macrófagos isolados de camundongos WT desencadeou grandes e rápidas Ca 2 + mobilização PMVECs em comparação com macrófagos de camundongos nulos gp91phox. Validação de ativação de macrófagos tem sido demonstrada anteriormente.

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<li>Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reactive+oxygen+species+regulate+cellular+signaling+and+dictate+biological+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes.</a> Trends Biochem. Sci. 35, 505-513 Forthcoming.</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método descrito aqui permite a medição rápida e quantitativa de espécies reativas de oxigênio em células vivas ou usando corantes de oxidação ou sensores sensíveis plasmídeo. Agonistas de TLRs (Toll-like receptors) são compostos que estimulam as células através dos TLRs presentes na superfície das células e acionar as vias de sinalização a jusante 15. Em nosso protocolo, usamos três diferentes TLR viz agonistas, Lipo-Teicóicos acid-agonista TLR2; Poly (I: C). TLR3-agonista; LPS-TLR4 agonista que são relatad...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Attofluor câmara de celular </td><td> Invitrogen </td><td> A7816 </td></tr><tr><td> A Antimicina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A8674 </td></tr><tr><td> DMEM baixa glicose </td><td> Invitrogen </td><td> 10567-014 </td></tr><tr><td> Suplemento de fator de crescimento endotelial (ECGS) </td><td> Norte do estado </td><td> 02-102 </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 12662011 </td></tr><tr><td> G418 </td><td> Invitrogen </td><td> 10131-027 </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1393 </td></tr><tr><td> H 2 DCFDA </td><td> Invitrogen </td><td> D-399 </td></tr><tr><td> LPS </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L4516 </td></tr><tr><td> LTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L2515 </td></tr><tr><td> MitoSOX Red </td><td> Invitrogen </td><td> M36008 </td></tr><tr><td> Opti-MEM eu Redução Médio de soro </td><td> Invitrogen </td><td> 51985091 </td></tr><tr><td> Pen / Strep (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140163 </td></tr><tr><td> pHyPer-cito </td><td> Evrogen </td><td> FP941 </td></tr><tr><td> pHyPer-dMito </td><td> Evrogen </td><td> FP942 </td></tr><tr><td> Poli (I: C) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P0913 </td></tr><tr><td> Prism software 5,0 </td><td> GraphPad Software, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> SigmaPlot 11,0 </td><td> Systat software, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400054 </td></tr><tr><td> T-25 Frascos </td><td> Corning </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> T-75 Frascos </td><td> BD Falcon </td><td> 353136 </td></tr><tr><td> 96-T bemC micro placa bem </td><td> BD Falcon </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> Zen software 2009 </td><td> Carl Zeiss 510 microscopia confocal Meta </td><td></td></tr></tbody></table>

visualização dos vascular ca 2 + sinalização disparado por parácrina ros derivado

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

O estresse oxidativo tem sido implicado em uma série de condições patológicas, incluindo isquemia / reperfusão e sepse danos. O conceito de estresse oxidativo refere-se a formação aberrante de ROS (espécies reativas de oxigênio), que incluem O 2 • -, H 2 O 2, e radicais hidroxila. Espécies reativas de oxigênio influencia uma grande variedade de processos celulares, incluindo transdução de sinal, a proliferação celular e morte celular 1-6. ROS têm o potencial de dano vascular e células de órgãos diretamente, e pode iniciar reações químicas secundárias e alterações genéticas que acabará por resultar em uma ampliação do dano tecidual inicial ROS-mediada. Um componente-chave da cascata de amplificação que agrava prejuízos irreversíveis é o recrutamento e ativação de células inflamatórias circulantes. Durante a inflamação, as células inflamatórias produzem citocinas como fator de necrose tumoral α (TNF) e IL-1, queativam as células endoteliais (CE) e células epiteliais e aumentar ainda mais os 7 resposta inflamatória. Disfunção endotelial vascular é uma característica estabelecida de inflamação aguda. Macrófagos contribuir para a disfunção endotelial durante a inflamação por mecanismos que permanecem obscuros. Ativação de macrófagos resulta na liberação extracelular de O 2 • - e várias citocinas pró-inflamatórias, o que desencadeia a sinalização patológicos nas células adjacentes 8. Oxidases NADPH são a principal fonte primária de ROS e na maioria dos tipos de células. Recentemente, ele é mostrado por nós e outros 9,10 que ROS produzidos por oxidases NADPH induzir a produção de ROS mitocondrial durante muitas condições fisiopatológicas. Daí a medição da produção de ROS mitocondrial é igualmente importante, além de medir citosólica ROS. Macrófagos produzem ROS pela oxidase NADPH flavoproteína enzima que desempenha um papel fundamental na inflamação. Uma vez ativado,NADPH oxidase fagocítica produz grandes quantidades de O 2 • - que são importantes no mecanismo de defesa hospedeiro 11,12. Embora parácrinos derivados de O 2 • - desempenha um papel importante na patogênese de doenças vasculares, visualização de parácrina ROS induzida pela sinalização intracelular, incluindo Ca 2 + mobilização ainda é hipótese. Nós desenvolvemos um modelo em que macrófagos ativados são usados ​​como uma fonte de O 2 • - para transdução do sinal para as células endoteliais adjacentes. Usando esse modelo, demonstramos que macrófagos derivados de O 2 • - levar ao cálcio sinalização em células endoteliais adjacentes.

Um método eficiente para obter insights sobre visualizando o parácrinos derivados de indução de ROS endotelial sinalização de Ca2 + é descrito. Esse método leva vantagem de medir parácrina ROS derivados provocou mobilização de Ca2 + em células endoteliais vasculares em um modelo de co-cultura.

Visualização dos Vascular Ca 2 + Sinalização Disparado por parácrina ROS Derivado

O estresse oxidativo tem sido implicado em diversas condições patológicas, incluindo danos por isquemia/reperfusão e sepse. O conceito de oxidative...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a sinalização vascular de cálcio desencadeada por espécies reativas de oxigênio derivadas de pericrinas ou EROs. Isso é realizado primeiramente visualizando as EROs com corantes sensíveis à oxidação em macrófagos ativos. As EROs também podem ser visualizadas em células endoteliais utilizando sensores fluorescentes baseados em plasmídeo.Em seguida, prossiga para visualizar simultaneamente macrófagos ativados marcados com rastreador celular vermelho e células endoteliais marcadas com fluorescência em um modelo de co-cultura. Por fim, meça a sinalização de cálcio nas células endoteliais desencadeada por espécies reativas de oxigênio derivadas de macrófagos, utilizando um sistema de imagem por microscopia confocal.Esses resultados podem demonstrar os níveis de ERO independentemente, bem como avaliar simultaneamente a mobilização intracelular de cálcio desencadeada por ERO derivadas de Peregrine. Este método permite a avaliação simultânea de duas moléculas sinalizadoras diferentes que intimamente induzem um ambiente de sinalização vascular e condição patofisiológica simulada. Dois pós-doutorandos no meu laboratório, Karthik e Raj, demonstrarão o procedimento sobre medições de ERO e cálcio e interações entre macrófagos e células endoteliais.Cultive macrófagos derivados de monócitos de camundongo em placas de fundo de vidro de 35 milímetros. Em seguida, desafie as células com agonistas do receptor tipo toll e incube por seis horas a 37 graus Celsius. Para visualização do citosol.Adicione o corante sensível à oxidação e incube as células por 20 minutos. Em seguida, visualize as células em uma platina controlada por temperatura de um sistema de imagem confocal. Alternativamente, para visualizar as ERO mitocondriais em células ativadas por TLR, adicione o indicador de superóxido mitocondrial e incube as células por 30 minutos a 37 graus Celsius.Como controle negativo, trate as células com PBS ou DMSO para um controle positivo. Trate as células com antimicina a dois milimolares. A seguir, prossiga para visualizar todas as células na platina controlada por temperatura de um sistema de imagem confocal.Utilizando o software ImageJ, analise todos os dados de imagem. O sensor fluorescente detecta de forma hiperespecífica concentrações submicromolares de peróxido e, com base no desenho do vetor de expressão em mamíferos, pode ser direcionado para o citoplasma ou para as mitocôndrias. Utilizando eletroporação, crie linhagens estáveis de células endoteliais microvasculares pulmonares de camundongo portadoras do plasmídeo de expressão apropriada de Hyper. Para facilitar o crescimento de colônias, plaque as células em baixa densidade em TMEM completo e incube por 48 horas; substitua o meio por meio de cultura completo suplementado com um antibiótico de seleção. Selecionar as linhagens com a maior porcentagem de células hiperpositivas e amplificar o cultivo para criar linhagens estáveis hiperpositivas em experimentos individuais. Semear as células em lamínulas revestidas com gelatina a 0,2% e cultivar durante a noite até atingir 80% de confluência.Agora, ative as células com ligantes de TLR e incube por seis horas a 37 graus Celsius. Para a detecção de ROS citoplasmática, monte as lamínulas com células em uma câmara de células adelo. Adicione um mililitro de solução salina balanceada pré-aquecida e coloque a câmara em uma platina controlada termicamente do sistema de imagem confocal.Registre as alterações de fluorescência nas células para a detecção de ROS mitocondrial. Inclua um controle positivo de dois micromolares de antimicina A. Em seguida, prepare as lamínulas com células tratadas para microscopia confocal. Realize a análise de imagens utilizando o software ImageJ.Inicie com células endoteliais cultivadas até 80% de confluência sobre lamínulas de vidro revestidas com gelatina para a visualização e medição de alterações intracelulares de cálcio. Incube as células com o corante fluorescente fluo-4 AM, à temperatura ambiente, por 30 minutos para minimizar a perda do corante; lave então as células com a solução de imagem experimental contendo sulfinpirazona. Em seguida, monte as lamínulas em uma câmara de célula Adepo com 800 microlitros de solução de imagem experimental pré-aquecida e posicione as células sobre uma platina controlada termicamente do sistema de imagem confocal em um tubo separado.Utilize 500 nanogramas por mililitro de rastreador celular vermelho C-M-T-P-X durante 15 minutos para marcar a população de macrófagos sob investigação, lave as células e reconstitua os pellets em 200 microlitros de solução experimental de imagem. Em seguida, adicione os macrófagos marcados sobre as células endoteliais carregadas com fluoh 4:00 AM na câmara de montagem para microscopia confocal e registre a fluorescência verde e vermelha a cada três segundos durante 10 minutos.Neste experimento, as células J 7 74 0,1 foram expostas aos ligantes de TLR dois, três e quatro por seis horas. Imagens confocais representativas mostram um aumento na ROS citosólica, medido por DCF. Curiosamente, a fluorescência vermelha do mitotracker indica um aumento semelhante na ROS mitocondrial.Essas alterações de fluorescência são quantitativas. Assim, os resultados devem ser normalizados e expressos como mudança relativa de dobramento por tratamento, sendo o sinal de antimicina A um controle positivo para a produção de ERO mitocondrial. Esta figura mostra imagens dos níveis de peróxido endotelial, citosólico e mitocondrial em células que expressam estavelmente hyper citosólico ou hyper mitocondrial D.MP ECS estimuladas com agonistas de TLR. A quantificação da variação média da fluorescência demonstra aumento da fluorescência hiper citoplasmática e hiper D mito após seis horas de estimulação em um sistema de co-cultura. Para avaliar a sinalização de ROS Peregrine, macrófagos mirin recém-isolados de camundongos selvagens e de camundongos nulos para GP 91 Fox foram ativados com um micrograma por mililitro de LPS durante seis horas.Os macrófagos foram marcados em vermelho com C-M-T-P-X e adicionados sobre MPM ECS carregados com flu verde quatro. Curiosamente, macrófagos ativados com LPS isolados de camundongos selvagens induziram uma grande e rápida mobilização de cálcio nas MPM ECS em comparação com macrófagos de camundongos nulos para GP 91 Fox.Embora a tentativa LI utilize este procedimento, é importante lembrar que tanto a incubação prolongada quanto a exposição ao laser levam à auto-oxidação do DCF. É crucial evitar o branqueamento fotônico da hiper cito e da hiper D mitral. Uma vez dominada, a medida de RA em macrófagos, bem como em células endoteliais, pode ser realizada em sete horas, se for executada corretamente.

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JoVE Journal

Biology

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Visualização dos Vascular Ca^{2 +} Sinalização Disparado por parácrina ROS Derivado

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