Visualização dos Vascular Ca ^{2 +} Sinalização Disparado por parácrina ROS Derivado

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a sinalização vascular de cálcio desencadeada por espécies reativas de oxigênio derivadas do perícrino ou r os. Isso é feito primeiro visualizando R os usando corantes sensíveis à oxidação em macrófagos ativos. As ROS também podem ser visualizadas em células endoteliais usando sensores fluorescentes baseados em plasmídeo.

Em seguida, prossiga para visualizar simultaneamente o rastreador de células macrófagos ativados marcados em vermelho e a gripe de quatro células endoteliais marcadas em um modelo de co-cultura. Finalmente, medir a sinalização de cálcio em células endoteliais desencadeada por R os derivados de macrófagos. Usando um sistema de imagem confocal.

Esses resultados podem demonstrar os níveis de R os de forma independente, bem como avaliar simultaneamente a mobilização intracelular de cálcio desencadeada por ROS derivadas de Peregrine. Este método permite a avaliação simultânea de duas moléculas de sinalização diferentes que provocam intimamente uma sinalização vascular e um cenário fisiopatológico do simulador. Dois pós-doutorandos em meu laboratório, Karthik e Raj, demonstrarão o procedimento em medições brutas e de cálcio e interações de células endoteliais de macrófagos.

Cultura de macrófagos derivados de monócitos de camundongos em placas de 35 milímetros com fundo de vidro. Em seguida, desafie as células com agonistas do receptor toll-like e incube por seis horas a 37 graus Celsius. Para visualização do citosólico.

ROS adicionam corante sensível à oxidação e incubam as células por 20 minutos. Agora visualize as células em um estágio de temperatura controlada de um sistema de imagem confocal. Alternativamente, para visualizar ROS mitocondriais em células ativadas por TLR, adicione o indicador de superóxido mitocondrial e incube as células por 30 minutos a 37 graus Celsius.

Para um controle negativo, trate as células com PBS ou DMSO para um controle positivo. Trate as células com antimicina dois milimolares. Prossiga para visualizar todas as células no estágio de temperatura controlada de um sistema de imagem confocal.

Usando o software de imagem J, analise todos os dados da imagem. O sensor fluorescente detecta hiperespecificamente concentrações submicromolares de peróxido e, com base na expressão de mamíferos, o design do vetor pode ser direcionado ao citoplasma ou às mitocôndrias. Usando eletroporação, crie linhas estáveis de células endoteliais microvasculares pulmonares de camundongo com plasmídeo de hiperexpressão inadequado.

Para facilitar o crescimento de células da placa de crescimento de colônias em baixa densidade em TMEM completo e incubar por 48 horas, substitua o meio por meio de cultura completo suplementado com um antibiótico de seleção. Faça a triagem de clones para a maior porcentagem de células hiperpositivas e amplifique a cultura para criar linhas hiperpositivas estáveis em experimentos individuais. Células de sementes em lamínulas revestidas com gelatina a 0,2% e cultura durante a noite para 80% de confluência.

Agora ative as células com ligantes TLR e incube por seis horas a 37 graus Celsius. Para a detecção de ROS citoplasmáticas, monte as lamínulas de cobertura das células em uma câmara celular adelo. Adicione um mililitro de tanques pré-aquecidos, equilibre a solução salina e coloque a câmara em um estágio com temperatura controlada do sistema de imagem confocal.

Registre as alterações de fluorescência nas células para a detecção de mitocôndrias. ROS. Inclua um controle positivo de dois antimicina A micromolar. Em seguida, prepare as lamínulas das células tratadas para microscopia confocal. Realize a análise de imagem usando o software de imagem J.

Comece com células endoteliais crescidas até 80% de confluência em lamínulas de vidro revestidas com gelatina para a visualização e medição das alterações intracelulares de cálcio. Incube as células no corante fluorescente da gripe oh 4:00 da manhã em temperatura ambiente por 30 minutos para minimizar a perda de corante lave as células com solução de imagem experimental contendo suen pyro zone. Agora monte as lamelas de cobertura em uma câmara de célula adelo a 800 microlitros de solução de imagem experimental pré-aquecida e posicione as células em um estágio de temperatura controlada do sistema de imagem confocal em um tubo separado.

Use 500 nanogramas por mililitro de rastreador de células vermelho C-M-T-P-X por 15 minutos para rotular a população de macrófagos sob investigação, lavar as células e ressuspender os pellets em 200 microlitros de solução de imagem experimental. Agora adicione os macrófagos rotulados na gripe oh 4:00 AM carregado. As células endoteliais no conjunto da câmara confocal registram a fluorescência verde e vermelha a cada três segundos por 10 minutos.

Neste experimento, células J 7 74 0,1 foram desafiadas com TLR dois, três e quatro ligantes por seis horas. Imagens confocais representativas mostram um aumento do R os citosólico medido pelo DCF. Curiosamente, a fluorescência vermelha das meias mitoses indica um aumento semelhante nas ROS mitocondriais.

Essas mudanças de fluorescência são quantitativas. Assim, os resultados devem ser normalizados e expressos como mudança relativa de dobra por tratamento, o sinal de antimicina a valida um controle positivo para a produção de ROS mitocondrial. Esta figura mostra imagens dos níveis de peróxido endotelial, citosólico e mitocondrial na expressão estável de hiper cyto ou hiper D mito.

MP ECS estimulado com agonistas de TLR. A quantificação da mudança média de fluorescência demonstra aumento da hiperfluorescência do cito e hiper D mito após seis horas de estimulação em um sistema de co-cultura. Para avaliar a sinalização de ROS peregrinas recém-isoladas, macrófagos mirin do tipo selvagem e GP 91 Fox nulos foram ativados por um micrograma por mililitro de LPS por seis horas.

Os macrófagos foram marcados em vermelho com C-M-T-P-X e adicionados à gripe verde quatro. Carregado. MPM ecs. Curiosamente, macrófagos ativados por LPS isolados de camundongos do tipo selvagem desencadearam grande e rápida mobilização de cálcio no MPM ECS em comparação com macrófagos de camundongos GP 91 Fox nulos.

Embora o LI tente realizar esse procedimento, é importante lembrar que o download prolongado ou a exposição ao laser levam à autooxidação do DCF. É crucial evitar o fotobranqueamento do hiper cyto e hiper D mitral. Uma vez dominado, a medição da AR em macrófagos, bem como em células endoteliais, pode ser feita em sete horas se for realizada corretamente.