Name: Determinação da Raft Lipid Particionamento de Sondas marcadas com fluorescência em células vivas por Espectroscopia de Correlação de Fluorescência (FCS) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprenda a quantificar o particionamento de lipid rafts em células vivas usando espectroscopia de correlação de fluorescência. Este método permite medir tempos de difusão de proteínas marcadas com Alexa 488 em domínios de membrana.

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Este trabalho foi financiado por uma subvenção da Agence Nationale de la Recherche (ChoAD). Também somos gratos ao ICM Fondation (Institut du Cerveau et de la Moelle) pelo apoio financeiro.

1. Calibração do Setup FCS <ol><li> Inicie o microscópio confocal, lasers, computadores, incubadora para controle de temperatura e CO 2. </li><li> Certifique-se que a SPAD (Diodo Avalanche de fóton único) é ligado e que o filtro de fluorescência dentro do SPAD está bem adaptado à sua amostra. Verificar que a SPAD está sincronizado com o tempo. Cuidado apenas para iniciar o seu software FCS uma vez que suas configurações SPAD estão prontos para a aquisição. </li><li> Prepara-se uma solução fresca de toxina da cólera-Alexa488 diluído em PBS para atingir uma concentração de 1 ug / ml (17,5 nM). </li><li> Otimizar imagem confocal da solução utilizando detecção interna do microscópio. </li><li> Mude para o modo de digitalização apontar e escolher um ponto na amostra solução. Assegure-se a duração da iluminação laser é suficientemente longo para executar as suas aquisições de FCS (&gt; 5 minutos). </li><li> Alternar para detecção externa pelo SPAD e para o software de FCS. Monitore seu sinal de fluorescência e verifique se ele está bem suibuído para a SPAD (sinal suficiente, mas sem saturação, 10 000 a 50 000 contagens / s é bom). Se necessário, modificar a posição z, ganho e / ou potência do laser para atingir sinal de fluorescência correcta. </li><li> Adquirir 10 conjuntos de 30 medições segundos. Tempo de aquisição deve ser otimizado para a sua amostra (compromisso entre a melhor amostragem e problemas fotodegradação). </li><li> Analise seus dados (ver passo 4) para assegurar que você tem uma curva de auto-correlação correspondente a uma espécie fluorescentes difusão em solução (equação da Figura. 2) e que o tempo de difusão obtidas após a montagem está correta (aproximadamente 0,2 ms) (Fig. . 3). </li></ol> 2. A coloração de células vivas com marcador de balsas lipídicas <ol><li> Placa células HEK293 sobre 8-assim Labteks revestidas com poli-L-lisina (1mg/ml) um dia antes de imagem para se certificar de que a sua aderência é correcta. Use meio sem vermelho de fenol para assegurar que não há perturbação do sinal de fluorescência. </li><li>Lave as células duas vezes com HBSS (Solução de Hank sal tamponada). </li><li> Adicionar toxina da cólera-Alexa488 (1 ug / ml) / BSA (0,1%) em 500 uL HBSS para as células durante 30 minutos a 37 ° C. Toxina da cólera vai ligar para o gangliosídeo GM1, conhecido por ser preferencialmente particionado em balsas lipídicas. </li><li> Lave as células duas vezes com HBSS (Solução de Hank sal tamponada). </li></ol> 3. FCS Aquisição de Dados em células vivas <ol><li> Colocar as células coradas sobre a platina do microscópio. Faça temperatura certa e CO 2 condições são ideais caso contrário isso pode levar a artefactos em tempos de difusão. </li><li> Otimizar imagem confocal de uma célula de interesse usando detecção interna do microscópio (Fig. 4). </li><li> Para apontar modo de digitalização e escolher um ponto na membrana plasmática da célula de interesse. Execute 1-2 imagens ao vivo da célula para garantir que a célula não está se movendo durante a aquisição. </li><li> Mudar para detecção externa pela SPAD e ao macio FCSware. Monitore seu sinal de fluorescência e verifique se ele está bem adaptado à SPAD (sinal suficiente, mas sem saturação, de 10 000 para 50 000 contagens / s é bom). Se necessário, modificar a posição z, ganho e / ou potência do laser para atingir sinal de fluorescência correcta. Se isso não for suficiente, você pode considerar mudanças nas condições de coloração. </li><li> Adquirir 10 amostras de 30 medições segundos. Como a maioria das células são auto-fluorescente, você poderá ver uma diminuição na fluorescência durante as primeiras aquisições, devido a auto-fluorescência desbotamento. </li></ol> 4. FCS Análise de Dados <ol><li> Defina o intervalo de correlação e gerar auto-correlação de curvas com o software FCS. O intervalo de correlação variará tipicamente de o menor tempo de retardação resolúvel até o maior tempo possível (como as estatísticas da medição torna-se cada vez mais insuficiente quando o tempo de correlação máxima se aproxima o tempo de aquisição total, o tempo de atraso máximo é limitado a 80% do tempo de aquisição sobre a Picoquant software). </li><li> Para cada amostra, exportar arquivos correspondentes a flutuações de fluorescência e de auto-correlação como uma função do tempo. </li><li> Use uma análise de dados e software de adaptação, tais como origem Pro para importar os arquivos. </li><li> Para cada amostra, certifique-se não há fotobranqueamento durante a aquisição ou seja, a fluorescência permanece estável durante os 30 segundos. Descarte qualquer medida exibindo fotodegradação, pois isso pode causar artificiais vezes maior difusão. </li><li> Verificar que a forma do restante FCS curvas é correcta (ver Fig. 5). Determinar a curva de FCS média. </li><li> Ajustar a curva com o modelo matemático apropriado (Fig. 2). Este ajuste vai dar-lhe o tempo de difusão (s) e da proporção de moléculas de difusão com este tempo de difusão (ese) (s). </li></ol> 5. Os resultados representativos Um exemplo de uma calibração de FCS, com uma solução de toxina da cólera-Alexa488 é mostrado na Figura 3 (Figura 3A), individuais e médios curvas de FCS foram calculados. Curvas médias FCS foram equipados com as equações que correspondem a modelos de difusão diferentes (exemplos da Figura 2). O parâmetro classicamente considerado para determinar a qualidade de um ajuste é o coeficiente de determinação R 2. Quanto mais próximo de R 2 é de 1, melhor o ajuste. Neste caso, o modelo mais preciso para se ajustar a curva de FCS média é a uma descrevendo uma população de moléculas fluorescentes que difundem livremente em três dimensões (equação 1 na Figura 2 e Figura 3B). O tempo de difusão derivado do ajuste é 0,32 ms. Resíduos de ajuste de curva-(Figura 3C) e factor de R 2 (0,99906) fornecer uma estimativa da qualidade do ajuste. Um exemplo de análise de FCS para a cólera manchado-toxina Alexa488 HEK293 células é mostrado na Figura 5. A forma da curva média multifásica FCS revela a existência de populações de moléculas fluorescentes com diferentes tempos de difusão. O melhor ajuste para esta curva corresponde a um modelo com três populações de sondas fluorescentes: dois com uma difusão impedida (difusão em duas dimensões como no plano da membrana) e um difusor livremente em três dimensões (equação 2 na Figura 2 e Figura 5) . Esta última corresponde à população de moléculas fluorescentes que se deslocam para fora do plano da membrana, isto é, ou ligação ou unbinding para os seus objectivos de membrana, atingindo a membrana através da via de secreção ou reciclagem, ou deixando a membrana por endocitose. Os dois tempos de difusão na membrana, correspondentes a toxina da cólera ligado a GM1, eram de 2 ms (25% de moléculas), correspondendo a difusão para fora do balsas lipídicas, e 75 ms (50% de moléculas), correspondendo a difusão em balsas lipídicas . Por favor, note que qualquer photobleachção durante a aquisição levará a difusão artificiais vezes mais, portanto, possivelmente criando um viés para a localização de GM1 em domínios rafts lipídicos. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Representação esquemática do conjunto de FCS até-(modificado a partir de imagem Marquer et al. 12) <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Exemplo de modelos de difusão e equações correspondentes utilizados para o ajuste de curvas de autocorrelação. O parâmetro S estrutura pode ser escrita como S = 0 z / w 0 com 0 z o raio eficaz focal ao longo do eixo óptico a 1/2 e intensidade e w0 a la eficazraio focal parenteral a 1 / e intensidade 2. Estes valores podem ser extraídos a partir de um ponto de propagação clássica função de medição (PSF). <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Avaliação do tempo de difusão de toxina da cólera-Alexa488 em solução para a calibração de FCS. A) flutuação de fluorescência como uma função do tempo para um exemplo representativo de um segundo aquisição 30. B) A média de curva de autocorrelação obtido a partir de 10 amostras de 30 aquisição segundo equipado com a equação 1 (ver Figura 2). C) resíduos de ajuste de curva. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. HEK-293 de células coradas com toxina da cólera-Alexa488. As células foram gravadas em um microscópio confocal SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha) com a linha de laser interna 488nm. Fluorescência foi coletado com um plano objectivo Apochromat x60 imersão em óleo entre 500e 650 nm. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Avaliação do tempo de difusão de toxina da cólera-Alexa488 na membrana plasmática de células HEK293. A) média da curva de autocorrelação equipado com a equação 2 (ver Figura 2). B) Resíduos de ajuste de curva. (Modificado de Marquer et al. 12)

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Não há conflitos de interesse declarados.

O método aqui apresentado FCS permite uma análise sensível e rápido da compartimentação jangada lipídico de sondas fluorescentes de interesse em células vivas. FCS combina a precisão da localização de microscopia confocal com a sensibilidade de contagem de fotão único. A principal diferença entre FCS e técnicas padrão de bioquímicos é que permite a determinação de FCS absoluta da partição jangadas lipídica do alvo e não a partição relativa como é o caso para GDD isolamento ou de co-patching. ...

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Cólera subunidade toxina B-488 Alexa </td><td> Invitrogen </td><td> C-34.775 </td><td> MW (pentâmero) = 57 kg mol / </td></tr><tr><td> Microscópio confocal </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Incubadora de temperatura e CO controle 2 </td><td> Vida serviços de imagem </td><td> O Cubo ea Caixa </td><td></td></tr><tr><td> SPAD (Diodo Avalanche de fóton único) </td><td> MPD (Micro Devices Photon) </td><td> PDM serie (100 mM área sensível) </td><td></td></tr><tr><td> Passa-alto 488 nm filtro </td><td> Semrock </td><td> 488 nm de bloqueio borda BrightLine longo filtro passa Part #ails.aspx? id = FF01-488/LP-25 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; FF01-488/LP-25 </td><td></td></tr><tr><td> FCS unidade de detecção </td><td> Picoquant </td><td> Picoharp módulo 300 </td><td></td></tr><tr><td> Aquisição e auto-correlação software </td><td> Picoquant </td><td> SymPhoTime </td><td></td></tr><tr><td> Software de adaptação </td><td> OriginLab </td><td> OriginPro8 </td><td></td></tr></tbody></table>

determinação da raft lipid particionamento de sondas marcadas com fluorescência em células vivas por espectroscopia de correlação de fluorescência (fcs)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Nos últimos quinze anos, a noção de que as membranas celulares não são homogêneas e dependem de microdomínios de exercer suas funções tornou-se amplamente aceita. Jangadas lipídicas são microdomínios de membrana enriquecidos em colesterol e esfingolipídios. Eles desempenham um papel em processos fisiológicos celulares, tais como sinalização, e 1,2 tráfico, mas também estão pensados ​​para ser os principais intervenientes em várias doenças, incluindo infecções virais ou bacterianas e doenças neurodegenerativas 3. No entanto, sua existência é ainda uma questão controversa 4,5. Na verdade, o tamanho rafts lipídicos foi estimado em cerca de 20 nm 6, muito abaixo do limite de resolução do microscópio convencional (cerca de 200 nm), impossibilitando a sua imagem direta. Até agora, as principais técnicas utilizadas para avaliar a partição de proteínas de interesse dentro de balsas lipídicas foram Membranas resistentes detergentes (DRMs) de isolamento, e co-patch com os anticorpos. Beca Embora amplamente utilizadauso de sua execução bastante fácil, estas técnicas eram propensos a artefatos e, portanto, criticou 7,8. Melhoramentos técnicos foram, portanto, necessário para ultrapassar estes artefactos e para ser capaz de detectar partição jangadas lipídica em células vivas. Apresentamos aqui um método para a análise sensível de partição lípido jangadas de proteínas fluorescentes-etiquetados ou lípidos na membrana plasmática de células vivas. Este método, denominado Espectroscopia de Correlação de fluorescência (FCS), baseia-se na disparidade em tempos de difusão de sondas fluorescentes localizados dentro ou fora de jangadas lipídicas. De fato, como evidenciado em ambas as membranas artificiais e culturas de células, as sondas seria difundir muito mais rapidamente do lado de fora balsas lipídicas densos 9,10. Para determinar tempos de difusão, hora flutuações de fluorescência são medidos como uma função do tempo em um volume focal (aproximadamente 1 femtoliter), localizada na membrana plasmática de células com um microscópio confocal (Fig.1). As curvas de auto-correlação pode, então, ser extraída estas flutuações e equipado com modelos de difusão adequadas matemáticas 11. FCS pode ser usado para determinar a jangada lípido particionamento de sondas diferentes, contanto que eles são fluorescentemente marcado. Fluorescente marcação pode ser conseguida através da expressão de proteínas de fusão fluorescentes ou por ligação de ligandos fluorescentes. Além disso, FCS pode ser usado não apenas em membranas artificiais e linhas de células, mas também em culturas primárias, como descrito recentemente 12. Também pode ser utilizado para seguir a dinâmica da compartimentação jangada lípido após a adição da droga ou a mudança de membrana composição lipídica 12.

Uma técnica para sondar o particionamento jangada lipídico de proteínas fluorescentes na membrana plasmática de células vivas é descrito. Leva vantagem da disparidade em tempos de difusão de proteínas localizadas dentro ou fora de jangadas lipídicas. A aquisição pode ser realizada de forma dinâmica em condições de controlo ou após a adição da droga.

Determinação da Raft Lipid Particionamento de Sondas marcadas com fluorescência em células vivas por Espectroscopia de Correlação de Fluorescência (FCS)

Nos últimos quinze anos, a noção de que as membranas celulares não são homogêneas e dependem de microdomínios para exercer suas funções tornou-se amplamente aceita. ...

Microdomínios lipídicos são regiões especializadas dentro da membrana plasmática que atuam como centros organizadores para processos celulares como sinalização e tráfego. Aqui, a partição de microdomínios lipídicos na membrana plasmática de células vivas é quantificada utilizando espectroscopia de correlação de fluorescência para examinar a partição do gangliosídeo GM1. Células de mamíferos são analisadas com subunidades B do toxina da cólera marcadas com Alexa 488.As proteínas fluorescentes ligam-se ao gangliosídeo GM um, que é preferencialmente particionado em microdomínios lipídicos, utilizando microscopia confocal. Flutuações fluorescentes de curta duração na membrana plasmática são medidas. Curvas de autocorrelação são geradas e ajustadas com modelos matemáticos apropriados de difusão para determinar os tempos de difusão do Fluor.Como as sondas se difundem muito mais rapidamente fora do que dentro das microdomínios lipídicos densos, os resultados obtidos indicam o grau de particionamento. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o isolamento de membranas resistentes a detergentes ou o co-patching com anticorpos, é que a FCS permite a determinação do padrão absoluto, e não relativo, de enxerto lipídico do alvo. Além disso, pode ser utilizada tanto para lipídios quanto para proteínas, desde que sejam marcados fluorescentemente.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da doença de Alzheimer, como qual é a importância do lipídio na produção do beta amiloide? Isso levará a descobertas importantes, como novos inibidores que se ligam especificamente aos componentes do enxerto lipídico. Inicie este procedimento calibrando o sistema de espectroscopia de correlação de fluorescência ou FCS.Esta configuração de FCS é composta por um microscópio confocal conectado a uma unidade de detecção externa com um filtro de detecção e um fotodiodo de avalanche, além de um sistema de contagem de fótons únicos com correlação temporal. Ligue os lasers do microscópio confocal, o computador de imagem confocal e o computador de aquisição de FCS. Em seguida, ligue o incubador e ajuste-o para 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Certifique-se de que o diodo avalanche de fóton único ou SPAD está ligado e de que o filtro de fluorescência dentro do SPAD é adequado para a amostra. Verifique se o SPAD está sincronizado no tempo. Uma vez que as configurações do SPAD estejam prontas para aquisição, inicie o software FCS PICO quant.Prepare uma solução fresca de toxina do cólera Alexa 488 diluída em PBS, com concentração final de um micrograma por mililitro. Pipete a solução sobre uma lamínula. Em seguida, ajuste as configurações de Z no microscópio para encontrar o plano em que a fluorescência é mais intensa.Para alternar para o modo de varredura por ponto, clique no botão de fotobranqueamento por ponto e, em seguida, clique na tela da imagem para escolher uma região de interesse pontual na amostra da solução. Utilizando o software, ajuste o tempo de exposição para mais de cinco minutos. Isso garante que a iluminação a laser seja suficientemente longa para realizar as aquisições de FCS.Em seguida, utilizando o software FCS, alterne para a detecção externa pelo spad. Certifique-se de que o sinal fluorescente esteja na faixa de 10.000 a 50.000 contagens por segundo. O objetivo é obter um bom sinal, mas sem saturação.Adquira 10 conjuntos de medições de 32ª ordem no mesmo campo. O tempo de aquisição deve ser otimizado para a amostra, de modo que seja obtida uma amostragem de alta qualidade sem fotobranqueamento. Após a aquisição dos dados da amostra de otimização, eles são utilizados para gerar curvas de autocorrelação, a partir das quais os tempos de difusão das espécies fluorescentes serão determinados. Primeiro.Utilizando o software FCS, defina o intervalo de correlação e gere uma curva de autocorrelação correspondente às espécies fluorescentes que difundem em solução. Para cada 32ª medição, o software analisará cada 32ª amostra independentemente e gerará curvas de autocorrelação a partir das intensidades de fluorescência, utilizando uma função matemática clássica que indica a semelhança entre observações em função do intervalo de tempo entre elas. O intervalo de correlação normalmente variará desde o tempo LAC mais curto resolvível até o tempo mais longo possível.Como pode ser visto aqui, a medição torna-se menos precisa à medida que o tempo máximo de correlação se aproxima do tempo total de aquisição. Neste caso, o tempo de retardo máximo é limitado a 80% do tempo de aquisição. Em seguida, para cada amostra, exporte os arquivos correspondentes às flutuações de fluorescência e à autocorrelação em função do tempo. Depois, importe os arquivos para um software de análise e ajuste de dados, como o Origin Pro, para verificar se o branqueamento fotônico não ocorreu durante a aquisição.Examine o arquivo de flutuações de fluorescência. A fluorescência deve permanecer estável durante os 30 segundos e deve ser representada como uma linha plana. Quando as medidas de fluorescência exibirem fotodegradação.Não utilize as curvas FCS correspondentes para análises adicionais, pois isso pode causar tempos de difusão artificialmente mais longos nas demais curvas FCS. Determine a curva média de FCS fazendo a média dos valores de autocorrelação para cada ponto temporal. Por fim, para ajustar a curva ao modelo matemático apropriado, utilize o módulo de ajuste do Origin Pro com a equação adequada.Esse ajuste fornecerá o tempo de difusão das moléculas e da solução. Neste caso, há apenas uma população se difundindo livremente na difusão. Se o tempo de difusão obtido estiver correto, será aproximadamente 0,2 milissegundos.A configuração está bem calibrada e pode ser utilizada para experimentos adicionais. Agora que a configuração foi verificada quanto à calibração, o sistema pode ser usado para medir a partição de RAFs lipídicos de uma flora. Quatro células vivas de interesse removem as células HEC 2 93 do incubador.As células devem ter sido semeadas no dia anterior em lâminas revestidas com poli-L-lisina Lab Tech de oito poços, para que tenham tempo de aderir ao meio sem fenol. Deve-se usar vermelho para garantir que não haja perturbação do sinal de fluorescência. Utilize uma pipeta para remover suavemente a maior parte do meio do poço, assegurando-se de que as células não sequem.Em seguida, adicione suavemente HBSS ao poço. Repita essa lavagem uma vez para cada poço. Adicione 500 microlitros de toxina do cólera diluída, Alexa 488, às células por 30 minutos.A 37 graus Celsius, a toxina do cólera se ligará ao gangliosídeo GM1, sabidamente particionado preferencialmente em microdomínios lipídicos após a incubação. Lave as células duas vezes com HBSS, como antes, pois as células já estão prontas para a aquisição de dados de FCS. Coloque as células coradas na platina do microscópio e verifique as configurações de temperatura e dióxido de carbono.Otimize a imagem confocal de uma célula de interesse utilizando a detecção interna do microscópio. Encontre uma célula com membrana bem marcada. Alterne para o modo de varredura pontual como antes e escolha um ponto na membrana plasmática da célula de interesse.Capture de um a dois instantâneos da célula para garantir que ela não esteja se movendo durante a aquisição. Alterne para detecção externa pelo spad e para o software FCS, como antes, para assegurar o sinal adequado entre 10.000 e 50.000. Modifique o ganho da posição Z e/ou a potência do laser.Adquira 10 amostras de medições no 32º estágio, pois a maioria das células é autofluorescente. Pode haver uma diminuição na fluorescência durante as primeiras aquisições devido ao desvanecimento da autofluorescência. Analise as flutuações de fluorescência como anteriormente para determinar a curva média de FCS.Em seguida, ajuste a curva média de FCS multifásica com o modelo matemático apropriado. Utilize o módulo de ajuste do Origin Pro com a equação adequada. Esse ajuste fornecerá os tempos de difusão e a proporção de moléculas que difundem com esses tempos de difusão.Esta figura mostra um exemplo de calibração de FCS com uma solução de toxina do cólera marcada com Alexa 488. Após verificar que as medidas individuais de fluorescência em função do tempo não apresentaram fotobranqueamento, foram calculadas as curvas médias de FCS. As curvas médias de FCS foram ajustadas com equações correspondentes a diversos modelos de difusão.O parâmetro classicamente considerado para determinar a qualidade de um ajuste é o coeficiente de determinação R quadrado. Quanto mais próximo de um estiver o R quadrado, melhor será o ajuste, neste caso, o modelo mais preciso para o ajuste. A curva média de FCS é aquela que descreve uma população de moléculas fluorescentes difundindo livremente em três dimensões.O tempo de difusão derivado do ajuste é de 0,32 milissegundos. Os resíduos do ajuste da curva e o fator R quadrado fornecem uma estimativa da qualidade do ajuste aqui. O valor de R quadrado é 0,99906, indicando um bom ajuste.Um exemplo de análise por FCS para células HC 2 93 coradas com toxina do cólera Alexa 4 88 é mostrado aqui. Neste exemplo, a toxina está começando a ser endocitada, como demonstrado pela presença de pequenos pontos fluorescentes intracelulares para avaliar a difusão. Tempo da toxina do cólera Alexa 4 88 na membrana plasmática.Os dados foram coletados e analisados conforme descrito neste vídeo. A forma da curva média de FCS multiphasica revela a existência de populações de moléculas fluorescentes com diferentes tempos de difusão. O melhor ajuste para esta curva corresponde a um modelo com três populações de sondas fluorescentes, duas com difusão impedida.Difusão em duas dimensões, como no plano da membrana, e uma população difundindo livremente em três dimensões. Esta última população corresponde a moléculas fluorescentes que se movem fora do plano da membrana. Em outras palavras, as moléculas fluorescentes estão se ligando ou se dissociando de alvos na membrana, alcançando a membrana por meio da via de secreção ou reciclagem, ou deixando a membrana por endocitose.Dois tempos de difusão foram observados na membrana. 25% das moléculas apresentaram taxas de difusão de dois milissegundos, correspondentes à difusão fora das balsas lipídicas. 50% das moléculas apresentaram tempos de difusão de 75 milissegundos, correspondentes à difusão nas balsas lipídicas.Após o desenvolvimento deste procedimento, ao acoplar configurações ópticas alternativas e, em seguida, realizar a detecção de moléculas individuais abaixo do limite de difração, é possível acessar uma faixa mais ampla de tempos de difusão. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de microdomínios lipídicos estudarem a dinâmica relacionada a doenças da partição de microdomínios lipídicos após alterações na composição lipídica da membrana induzidas por fármacos em linhagens celulares e culturas primárias.

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Determinação da Raft Lipid Particionamento de Sondas marcadas com fluorescência em células vivas por Espectroscopia de Correlação de Fluorescência (FCS) (Vídeo) | JoVE Journal

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