Ensaio de aderência de freqüência para In Situ Análise Cinética de Cross-juncional interações moleculares na interface célula-célula

O objetivo geral do experimento a seguir é medir a cinética da interação entre receptor e ligante quando ambas as moléculas estão ancoradas nas superfícies das células que interagem. Isso é alcançado primeiramente funcionalizando as hemácias, que atuam como sensores de adesão, com ligantes, e preparando células portadoras de receptores. Como segundo passo, a câmara de micropipeta é montada e testes de adesão são realizados para registrar os eventos de adesão.

Em seguida, traça-se a curva da probabilidade de adesão em função do tempo de contato entre as células e realiza-se o ajuste com o modelo. Para estimar os parâmetros cinéticos, obtêm-se resultados que mostram a afinidade efetiva de ligação em duas dimensões e a taxa de dissociação estimadas a partir dos dados. De onde surge então a ideia deste ensaio?

As pessoas estudam a interação entre receptores e ligantes. Na maioria das vezes, medem as forças de ruptura, e estamos fazendo a mesma coisa, mas um dia pensamos: será que poderíamos simplesmente medir o resultado binário — zero para ausência de adesão e um para adesão — e derivar a medição da cinética a partir dessas medições binárias para demonstrar o ensaio de frequência de microcanal? A Dra. Veronica Zana Zina, cientista pesquisadora do meu laboratório, mostrará o experimento a vocês.

Hemácias isoladas de sangue total são biotiniladas para o ensaio de frequência de adesão. Para iniciar este procedimento, centrifugue o tubo contendo hemácias isoladas, alíquota 10 microlitros do pellet de hemácias em cada um de vários frascos e adicione a quantidade correspondente de PBS a cada frasco para preparar múltiplas concentrações de biotinilação de hemácias. Em seguida, adicione 10 microlitros de tampão bore oito 0,1 molar a cada frasco.

Em seguida, adicione uma quantidade calculada de solução de biotina a cada frasco e agite imediatamente em vórtex. Por alguns segundos, coloque cada frasco de hemácias dentro de um tubo cônico de 50 mililitros e incube em rotação durante 30 minutos à temperatura ambiente. Após 30 minutos, adicione o tampão EAS 45 a cada frasco e centrifugue por dois minutos a 2000 rotações por minuto. Repita a lavagem com o tampão EAS 45 duas vezes, totalizando três lavagens.

Finalmente, adicione 100 microlitros de tampão EAS 45 a cada frasco e armazene a quatro graus Celsius para funcionalizar os ligantes na superfície dos eritrócitos por meio do método descrito no passo anterior. Os eritrócitos são incubados com uma concentração saturada de strep TTR durante 30 minutos a quatro graus Celsius e lavados três vezes com tampão EAS 45 por dois minutos a 2000 rotações por minuto. Após isso, incube os eritrócitos diretamente com o ligante biotinilado ou incube os eritrócitos com o respectivo anticorpo capturador biotinilado, seguido pela incubação com os ligantes. O protocolo mostrado neste vídeo utiliza o anticorpo capturador biotinilado.

Micro pipetas são fabricadas utilizando tubos capilares de vidro borossilicato com ponto de fusão baixo. Primeiro, utilize um puxador de micro pipetas para puxar os tubos capilares. Em seguida, utilize um micro manipulador com uma micro fornalha para cortar a ponta da micro pipeta até obter uma abertura do tamanho desejado.

O diâmetro necessário geralmente varia de um a cinco mícrons, dependendo do tamanho das células a serem utilizadas no estudo. Para preparar a câmara de células, utilize dois pedaços de lamínulas de microscópio cortados no tamanho desejado, remova a poeira das lamínulas com um spray de ar comprimido, adicione o meio da câmara de células e feche a câmara usando óleo mineral por ambos os lados para evitar a evaporação do meio. Isso alteraria a osmolaridade durante o experimento.

O sistema de micropipeta utilizado neste ensaio consiste em três subsistemas: um subsistema de imagem para observar, registrar e analisar os movimentos da célula aspirada pela micropipeta, um subsistema de micro-manipulação para permitir a seleção de células da câmara de células e um subsistema de pressão para aspirar as células para dentro das micropipetas. A peça central do subsistema de imagem é um microscópio invertido com objetivo de imersão em óleo de 100 vezes. As imagens do objetivo são detectadas por uma câmera de dispositivo de carga acoplada e enviadas a um gravador de vídeo.

Um cronômetro em vídeo é acoplado ao sistema para acompanhar o tempo. Após preencher a micropipeta com água desionizada, coloque-a em seu suporte sobre uma unidade mecânica montada no microscópio. A micropipeta pode ser posicionada com precisão por meio de um micromanipulador hidráulico de três eixos.

Um dos suportes para micropipetas é montado em um tradutor piezoelétrico programado por computador. Isso permite que a pipeta seja movida com precisão e em um ciclo de teste de adesão. O subsistema de regulação de pressão é usado para controlar a sucção.

Durante o experimento, uma linha hidráulica conecta o suporte de micropipeta a um reservatório de fluido. Um posicionador mecânico fino permite que a altura do reservatório seja manipulada com precisão. Após a montagem da câmara, as micropipetas são posicionadas, as células são injetadas na câmara para iniciar o ensaio, as células interagentes são aspiradas pelas respectivas pipetas e o tradutor elétrico PSO é usado para movimentar o glóbulo vermelho para dentro e para fora do contato com o neutrófilo, controlando a área e o tempo de contato.

Um evento de adesão é observado quando o glóbulo vermelho se alonga durante a separação celular; um evento sem adesão corresponde à ausência de alongamento do glóbulo vermelho. Registre os eventos de adesão observados adicionando um para adesão ou zero para ausência de adesão em uma coluna de uma planilha do Excel.

Registre a curva de frequência de adesão versus tempo de contato utilizando pelo menos três pares diferentes de células para cada tempo de contato. Para obter uma média e erro padrão da média (SEM) como controle, registre a curva de ligação não específica utilizando eritrócitos revestidos com ligantes relevantes e/ou bloqueando os ligantes ou receptores com seu bloqueio funcional específico. Utilizando anticorpos monoclonais, a frequência específica de adesão em cada ponto de tempo de contato pode ser calculada subtraindo-se a frequência de adesão não específica.

A frequência específica de adesão versus os dados de tempo de contato são ajustados por um modelo probabilístico que descreve uma interação de único passo de segunda ordem direta e de primeira ordem inversa entre uma única espécie de receptores e uma única espécie de ligantes. Nesta equação, KA é a afinidade 2D. KA é a taxa de dissociação 2D.

MR e ML são as densidades do receptor e do ligante, respectivamente, e AC é a área de contato. O ajuste da curva possui dois parâmetros, ac, k, a, e K off, já que AC e KA são agrupados e denominados coletivamente afinidade efetiva 2D; seu produto com a taxa de dissociação é a taxa efetiva de associação 2D: AC K on equivale a AC KA multiplicado por K off. É apresentado aqui um exemplo da determinação da integrina alfa L beta dois.

Densidade do sítio em neutrófilos. Os neutrófilos foram primeiro incubados com um micrograma por mililitro de E-selectina IG e, em seguida, com concentrações saturantes de anti-CD11a conjugado com PE, um anticorpo monoclonal, ou IgG de camundongo relevante como controle. Após 30 minutos de incubação, as amostras foram lavadas e analisadas em um citômetro de fluxo com quantidade padrão.

Esferas de calibração PE brilhantes. O painel A mostra histogramas de fluorescência de esferas de calibração juntamente com os de células tratadas ou não tratadas com E-selectina IG. A marcação com anticorpo monoclonal específico para CD11A é mostrada em curvas contínuas e a marcação com anticorpo controle de isotipo correspondente é mostrada em curvas tracejadas.

O painel B mostra o processo de quantificação da densidade. O log 10 foi calculado para a intensidade média de fluorescência de cada uma das quatro esferas. Valor do pico de calibração do painel A e do lote específico de moléculas de PE por esfera.

Uma regressão linear de log₁₀ de moléculas de PE por microesfera em função do log₁₀ de fluorescência foi traçada para reselecionar as células infiltradas. O valor de log₁₀ fi é igual a 3,99, indicado pelo círculo azul preenchido, e 2,23, indicado pelo círculo azul aberto, para o anticorpo monoclonal específico e para o anticorpo controle, respectivamente. Quando a equação linear para X foi resolvida, o número total de alfa L beta dois ou neutrófilos foi calculado como 9.587.

A densidade superficial foi calculada como 43 sítios por micrômetro quadrado, utilizando 8,4 micrômetros como diâmetro do neutrófilo. O próximo gráfico mostra a frequência acumulada de adesão fi para ligação específica em um segundo e 10 segundos. Os tempos de contato foram medidos a partir de ciclos repetidos de teste de adesão entre eritrócitos revestidos com ICAM-1 e neutrófilos humanos expressando integrina alfa L beta 2.

Em contraste, é mostrada aqui a frequência de adesão corrida fi para ligação inespecífica em tempos de contato de um segundo e dez segundos, medidos a partir de ciclos repetidos de teste de adesão entre hemácias revestidas com IgG humana e neutrófilos humanos expressando integrina alfa L beta dois. Este gráfico final ilustra a cinética das probabilidades de ligação da I A um à integrina alfa L beta dois em neutrófilos, medidas para três pares de células em cada tempo de contato, que foram médias e plotadas em função do tempo de contato para controle da ligação inespecífica. Duas condições diferentes foram utilizadas.

Um glóbulo vermelho recoberto com o anticorpo de captura anti-TFC e incubado com IgG humana em vez de ICAM-1, IG e dois neutrófilos ligando-se a glóbulos vermelhos não recobertos com o anticorpo de captura. A ligação não específica registrada como curva de controle com IgG humana foi utilizada para obter uma curva específica de probabilidade de adesão. Utilizando a equação previamente descrita para correção de ligação não específica.

A curva corrigida de probabilidade de adesão específica foi ajustada com o ajuste de modelo. A curva de probabilidade de adesão específica retornou a afinidade de ligação efetiva. Um CKA equivale a 1,4 vezes 10 elevado a menos quatro mícrons à quarta potência e koff equivale a 0,3 s⁻¹.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir a cinética da interação receptor-ligante quando ambas as moléculas estão ancoradas nas superfícies das células de interação I. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de testar inicialmente diferentes densidades no lado do ligante, de modo que a frequência de adesão fique na faixa média, e lembrar-se de que trabalhar com sangue e alguns reagentes específicos para tratamento, por exemplo, azida de sódio e DM, pode ser extremamente perigoso. Portanto, precauções como a leitura cuidadosa das FISP dos reagentes e o uso de luvas durante a realização deste procedimento são obrigatórias.