Name: Ensaio de aderência de freqüência para In Situ Análise Cinética de Cross-juncional interações moleculares na interface célula-célula (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Aprenda a medir a cinética de interações receptor-ligante em superfícies celulares usando o ensaio de frequência de adesão com hemácias funcionalizadas como sensores. Este método permite estimar afinidade e taxa de dissociação.

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Este estudo foi financiado pelo NIH concede R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 e R01GM096187.

1. RBCs isolamento do sangue total <ol><li> Prepare EAS-45 soluções. Pesar até todos os ingredientes da Tabela I e dissolver em 100-200ml de água DI. Adicionar água para fazer a solução de 1000ml e ajustar o pH para 8,0. Filtrar e alíquota, de acordo 50ml. Congelar a -20 ° C para armazenamento. </li></ol> Nota: Passo 1.2 deve ser realizada por um médico treinado profissional, como enfermeira, com um Conselho de Revisão Institucional protocolo aprovado. <ol start="2"><li> Desenhe 3-5ml de sangue da veia cubital mediana em um tubo de 10 ml contendo EDTA e delicadamente misturar o sangue com EDTA imediata e cuidadosamente para evitar a coagulação. </li><li> Processo de amostra de sangue o mais rapidamente possível. Todos os passos a seguir, exceto centrifugação deve ser feita sob o capô para manter a preparação estéril. Transferir o sangue para um tubo de centrífuga 50ml, adicione 10 ml de Histopaque frio e estéril 1077 e centrifugar por 5 min @ 1000 rpm, 4 ° C. Repita duas vezes. </li><li> Adicionar 10ml frio e estéril PBS, centrifugue por 5min @ 1000 rpm, 4 ° C. Retire o sobrenadante. Repita 4 vezes (total de 5 vezes). </li><li> Lavar com estéril EAS-45 (5min @ 1000 rpm, 4 ° C) duas vezes. Durante os últimos RBCs mover de lavagem para um novo tubo estéril 15ml. </li><li> Ressuspender RBCs in10ml EAS-45. </li></ol> 2. Biotinilação RBCs <ol><li> Pegue o tubo com hemácias a partir do passo 1. Remover todas as sobrenadante após a centrifugação para 5min @ 1000 rpm, 4 ° C. Coloque 10μl de hemácias pellet a cada um dos vários frascos e adicionar uma quantidade correspondente de PBS a cada frasco (ver Tabela II, por exemplo, de preparação de seis diferentes concentrações de hemácias Biotinilação). </li><li> Faça novos Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 diluições de acordo com a Tabela II. </li><li> Adicionar 10μl de tampão borato 0,1 M para cada frasco. </li><li> Adicionar montante calculado de solução biotina para cada frasco (ver Tabela II como exemplo) e vortex imediatamente. </li><li> Coloque cada frasco RBCdentro de um tubo cônico de 50ml e incubar no rotador por 30min em temperatura ambiente. </li><li> Lave cada frasco 3 vezes com 800μl de EAS-45 para 2min @ 2000 rpm. </li><li> Adicionar 100μl da EAS-45 para cada frasco e armazenar a 4 ° C. Em cada 1μl da solução final deve ser agora ~ 1mln de hemácias. </li></ol> 3. Funcionalização da biotina ligada * ligantes na RBCs <ol><li> Prepare 2mg/ml solução estreptavidina de acordo com instruções do fabricante. Aliqouted solução pode ser armazenada a -20 ° C. </li><li> Misture uma quantidade igual de glóbulos vermelhos a partir do passo 2.7 (10μl) com estreptavidina solução, imediatamente vortex e incubar no rotador por 30min a 4 ° C. </li><li> Lavar 3 vezes com 500μl de EAS-45 para 2min @ 2000 rpm. Adicionar 15μl EAS-45 / 1% BSA para armazenamento. </li><li> Mix igual quantidade de glóbulos vermelhos a partir do passo 3.3 (10μl) com solução de ligante 20μg/ml, imediatamente vortex e incubar no rotador por 30min em temperatura ambiente. </li><li> Lave duas vezes com 500μl de EAS-BSA 45 / 1% para 2min @ 2000 rpm. Adicionar 15μl de BSA EAS-45 / 1% para armazenamento. </li></ol> * Se sua proteína não tem nenhuma ligação biotina você pode usar um dos kits disponíveis comercialmente para Biotinilação proteína (por exemplo, Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Kit Micro NHS-PEG4 Biotinilação) ou usar biotinilado anticorpos captura como um passo intermediário, como mostrado no vídeo. 4. Quantificação da densidade do receptor e ligante <ol><li> Incubar ligante revestido hemácias a partir do passo 3 e, em diferentes frasco, receptor-rolamento células com concentrações de saturação de mAbs respectivos por 30min em temperatura ambiente. Incubar em celas separadas frascos com irrelevantes isotipo pareados anticorpos para o controle. Se os anticorpos primários não são etiquetadas fluorescente, fluorescente incube com anticorpos conjugados secundários de acordo com instruções do fabricante. </li><li> Analisar amostras preparada no passo 4.1 por cytometery fluxo com correspondentes fluorescentes calbração contas. Calcular as densidades como mostrado na figura. 1. </li></ol> 5. Preparação para micropipeta e câmara de celular <ol><li> Puxe micropipetas de tubos capilares usando PN-30 Narishige 'Puller microeletrodos Magnetic Vidro Horizontal ou Sutter Instruments Micropipeta Puller. </li><li> Use micromanipulador com microforge para ajustar a ponta da micropipeta puxado para o tamanho desejado (geralmente o diâmetro necessário varia de 1-5m, dependendo do tamanho das células para ser utilizada no estudo). </li><li> Prepare a câmara de célula cortando tampa de vidro do microscópio para o tamanho desejado. Vedação da câmara utilizando óleo mineral de ambos os lados para evitar a evaporação média para mudar a osmolaridade durante o experimento. </li><li> Adicione a células receptoras e de suporte de ligante para a câmara. </li></ol> 6. Micropipeta ensaio de freqüência de adesão <ol><li> Aspirar as células interagindo por pipetas respectivos e uso do computador programado piezoelectr Tradutor ic para conduzir o RBC dentro e fora de contato com a outra célula com área de contato controlado e tempo. Detectar eventos de adesão, observando alongamento RBC sobre separação de células. </li><li> Repetir o ciclo de contato-retração 5-10 vezes para um tempo de contato fornecido. Registrar os eventos de adesão observado pela adição de "1" para a adesão ou "0" para não adesão em uma coluna de planilha Excel. Você pode usar um dispositivo de gravação, por exemplo, a mídia digital ou fita de vídeo, para as imagens microscópicas. </li><li> Registrar a freqüência de aderência versus a curva do tempo de contato com pelo menos três pares de células diferentes para cada tempo de contato para obter uma média e SEM. </li><li> Registro da curva de inespecífica para o controle usando hemácias revestidas com ligantes irrelevantes (por exemplo BSA) e / ou bloquear os receptores ou ligantes específicos usando seus mAbs bloqueio funcional. Freqüência de adesão específicas em cada ponto de tempo de contato pode ser calculado pela remoção da freqüência de adesão inespecífica 1. </li></ol>ove_title "análise&gt; 7. Dados <ol><li> Fit a freqüência específica de adesão P uma relação de contato de dados em tempo t por um modelo probabilístico (Equação 1) que descreve uma segunda ordem para a frente e de primeira ordem inversa, a interação de um único passo entre uma única espécie de receptores e uma única espécie de ligantes um : <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Equação 1"> onde K a é a afinidade de ligação eficaz 2D, k off é o desconto na tarifa, m r e m l são os respectivos receptores e densidades ligante medida no passo 4, e A c é a área de contato. A curva de ajuste tem dois parâmetros, A c K a k e fora, como um C e um K são agrupados e chamados coletivamente como afinidade 2D eficaz. Seu produto com o desconto na tarifa é a taxa efetiva 2D-on: A c k = A em c K a k x off. A freqüência específica de adesão P a é calculado pela subtração da fração de adesão inespecífica (P inespecíficos) da adesão total medidos (medidos P) 1,21: <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Equação 2"></li></ol> 8. Resultados representativos: <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Determinação da integrina β 2 L α densidade site em neutrófilos. Neutrófilos foram primeiro incubadas com 1μg/ml de E-selectina-Ig de 10min para coincidir com a condição experimental utilizada nas Figuras 3,4 ou sem E-selectina-Ig, e depois com as concentrações de saturação (10μg/ml) de conjugado anti-PE -humano CD11a mAb (Clone HI111, consulte a Tabela de específicasreagentes e equipamentos) ou rato IgG1 irrelevante para controle, lavados, e analisadas imediatamente. As amostras foram lidas no citômetro de fluxo BD LSR com o padrão QuantiBRITE contas calibração PE. Um painel mostra os histogramas de fluorescência de contas de calibração (rosa), juntamente com os de E-selectina-Ig células tratadas (cor azul) ou sem tratamento (cor verde). Específicas CD11a coloração mAb é mostrado nas curvas de sólidos e coloração do anticorpo irrelevante isotipo controle pareados é mostrado nas curvas pontilhadas. Células tratadas com E-selectina-Ig (presença em todas as etapas de lavar e em tampão FACS) não afetou a densidade CD11a como pode ser visto a partir da comparação com células não tratadas. Painel B mostra o processo de quantificação de densidade. Log10 foi calculado para a intensidade média fluorescente (FI) de cada valor de pico de quatro histogramas talão de calibração a partir do Painel A (círculos cor de rosa) e para as moléculas muito específicas PE por talão (do fabricante). Uma regressão linear de moléculas Log10 PE por talão contra Log10 fluoresccia foi plotada. Por E-selectina células tratadas a Log10 FI (y) valores iguais 3,99 (círculo sólido azul) e 2.23 (círculo aberto azul) para mAb específico e anticorpo controle, respectivly. Resolvemos a equação linear de x (os valores são representados como círculos verde e azul no painel B) x = Log10 PE / célula e, como PE:. MAb proporção de 1:1, o número total de α β L 2 em neutrófilos foi calculado como 9587. Densidade de superfície foi calculada em 43 moléculas / M 2, usando 8.4μm como o diâmetro de neutrófilos 22. Densidade de ICAM-1 foi igualmente medido pelo cytometery de fluxo, utilizando-PE anti-CD54 humano mAb, que igualou 65 mol / M 2. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 sistema de esquemas Micropipeta. Nosso sistema de micropipeta foi montado em casa e é composto por três subsistemas: um subsistema de imagem para permitir que se observe, record e analisar os movimentos da célula micropipeta de aspiração; um subsistema de micromanipulação para habilitar uma para selecionar as células da câmara de célula, e um subsistema de pressão para permitir uma para aspirar as células em micropipetas. A peça central do subsistema de imagem é invertida microscópio (Olympus IMT-2 IMT2) com um óleo de imersão 100x 1,25 NA objetivo. A imagem é enviada para um gravador de vídeo através de um dispositivo casal de carga (CCD) da câmera. Um temporizador de vídeo é acoplado ao sistema para manter a noção do tempo. Cada micropipeta pode ser manipulado por um acionamento mecânico montado no microscópio e finamente posicionado com um micromanipulador de três eixos hidráulicos. Manipuladores mecânicos de Newport poderia ser usado também. Um dos titulares micropipeta é montado em um tradutor piezoelétrico, o condutor de que é controlado por um computador LabView código (disponível a pedido) e os traduz sinal através de uma placa DAQ através de um amplificador de tensão (caseiro) para o atuador piezo. Este umllows um para mover a pipeta de forma precisa e repetidamente em um ciclo de teste de aderência. O subsistema de regulagem de pressão é usado para controle de sucção durante o experimento. A linha hidráulica conecta o titular micropipeta para um reservatório de fluido. Um posicionador fino mecânica permite que a altura do reservatório a ser manipuladas com precisão. Micropipetas são gerados usando a fusão KIMAX ponto de tubos de vidro borossilicato capilar (com diâmetro externo de 1,0 ± 0,07 mm e um diâmetro interno de 0,7 ± 0,07 mm. Primeiro, o micropipetas de tubos capilares são puxados usando PN-30 Narishige 'Puller microeletrodos Magnetic Vidro Horizontal (Sutter Instruments Micropipeta Puller é outra opção extrator). Em segundo lugar, o sistema Microforge (construído em casa) é usado para cortar o micropipetas para a abertura tamanho desejado. Commercial modelos de sistemas de Microforge também estão disponíveis. Para evitar a vibração do micropipetas durante o experimento, o Microscope, juntamente com o micromanipuladores, é colocado em uma mesa de suspensão a ar. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 Executando F freqüência de adesão específica para i (A) e inespecíficos (B) ligação em 1s (vermelho) e 10s vezes (azul) de contato medido a partir de ciclos repetidos de adesão de teste entre hemácias revestidas com ICAM-1 (A) ou hIgG (B ) com neutrófilos humanos expressando integrina α β L 2. F i = (X 1 + X 2 + ... + X i) / i (1 ≤ i ≤ n), onde i é o índice de ciclo de teste, X i é igual a "1" (aderência) ou "0" (sem adesão). F n (n = 50) foi usado como a melhor estimativa para a probabilidade de adesão. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4 Cinética deICAM-1 vinculativo para neutrófilos integrina β L α 2 ( <img alt="Praça" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Praça"> ). Probabilidade de adesão, como indicado na Figura 3 para três pares de células em cada tempo de contato é média e plotados versus tempo de contato. O meio de câmara foi HBSS com 1mm de cada um de Ca 2 + e Mg 2 +, mais 1μg/ml dimérica de E-selectina-Ig para upregulate α β L 2 vinculativo. Para capturar ICAM-1-Ig de hemácias, uma etapa intermediária foi adicionado para incubar hemácias com anticorpos de captura de 10μg/ml (biotinilado de cabra anti-anticorpo humano Fc, eBioscience) após a etapa de incubação estreptavidina. Para controlar inespecífica duas condições diferentes foram utilizados: 1) hemácias revestidas com o anticorpo de captura anti-humano Fc e incubadas com IgG humana em vez de ICAM-1-Ig (O) e 2) neutrófilos ligação a eritrócitos não revestidos com o captura de anticorpos (Δ). 10μg/ml IgG humana foi adicionadas ao meio de minimizar ligação de E-Selectina-Ig em solução para o anticorpo de captura na superfície RBC. Ligação não específica registrada como curva de controle humano IgG foi utilizado para obter uma curva de probabilidade específica de adesão ( <img alt="Praça" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Praça"> ) Usando a equação. 2. Curva de probabilidade de montagem específicas de adesão com a Eq.. 1 (linha contínua) retornou afinidade de ligação eficaz A K c a = 1,4 • 10 -4 e μm4 k off = 0,3 s -1. <table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> MW (g / mol) </th><th> Concentração (mM) </th><th> Quantidade (g) </th></tr><tr><td> Adenina </td><td> 135,13 </td><td> 2 </td><td> 0,27 </td></tr><tr><td> D-glicose (dextrose) </td><td> 180,16 </td><td> 110 </td><td> 19,82 </td></tr><tr><td> D-Manitol </td><td> 182,17 </td><td> 55 </td><td> 10,02 </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio (NaCl) </td><td> 58,44 </td><td>50 </td><td> 2,92 </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio dibásico (Na HPO ) </td><td> 141,95 </td><td> 20 </td><td> 2,84 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> 146,15 </td><td> 10 </td><td> 1,46 </td></tr></tbody></table> Preparação tabela 1. EAS-45 buffer (1L). <table border="1"><tbody><tr><td> 25 mg biotina-XHS em 550 mL de DMF </td><td> 0,1 M solução de biotina </td></tr><tr><td> Diluição de 1:10 de 0,1 biotina w / DMF </td><td> 0,01 M solução de biotina </td></tr><tr><td> Diluição 1:100 de 0,1 biotina w / DMF </td><td> 0,001 m solução de biotina </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Preparação da solução de biotina. <table border="1"><tbody><tr><th> biotina concentração final (M) </th><th> 4 </th><th> 10 </th><th> 20 </th><th> 50 </th><th> 100 </th><th> 160 </th></tr><tr><td> RBCs pellet de ações (mL) </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 1x PBS (mL) </td><td> 179,2 </td><td> 178 </td><td> 176 </td><td> 179 </td><td> 178 </td><td> 176,8 </td></tr><tr><td> 0,1 M de borato tampão (mL) </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 0,01 M biotina solução (mL) </td><td></td><td></td><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3,2 </td></tr><tr><td> 0,001 m biotina solução (mL) </td><td> 0,8 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 3. Biotinilação de hemácias.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Para usar com sucesso o ensaio de micropipeta freqüência de adesão deve-se considerar várias etapas críticas. Primeiro, certifique-se de registrar a interação específica para o sistema de receptor-ligante de interesse. Medidas de controle não-específica (cf. fig. 3, 4) garantir a especificidade. Idealmente, as probabilidades de adesão não específica deve ser inferior a 0,05 para todas as durações de tempo de contato e ter uma diferença significativa entre as probabilidades de adesão específicas e não específicas para ca...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Catálogo # </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> PBS 10x </td><td> BioWhittaker </td><td> 17-517Q </td><td> Diluir a 1x com água deionizada antes do uso </td></tr><tr><td> Vacutainer EDTA </td><td> BD </td><td> 366643 </td><td> Isolamento RBCs </td></tr><tr><td> 10ML PK100 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 10771 </td><td> Isolamento RBCs </td></tr><tr><td> Adenina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2786 </td><td> EAS-45 de preparação </td></tr><tr><td> D-glicose (dextrose) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528 </td><td> EAS-45 de preparação </td></tr><tr><td> D-Manitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 6360 </td><td> EAS-45 de preparação </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio (NaCl) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7653 </td><td> EAS-45 de preparação </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio dibásico (Na &amp; # x2082; HPO ₄) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S374 </td><td> EAS-45 de preparação </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5763 </td><td> EAS-45 de preparação </td></tr><tr><td> Biotina-X-NHS </td><td> Calbiochem </td><td> 203188 </td><td> Biotinilação RBCs </td></tr><tr><td> Dimetilformamida (DMF) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 20673 </td><td> Biotinilação RBCs </td></tr><tr><td> Borato tampão (0,1 M) </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 11455-90 </td><td> Biotinilação RBCs </td></tr><tr><td> Estreptavidina </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21125 </td><td> Ligante funcionalização </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0336 </td><td> Ligante funcionalização </td></tr><tr><td> Beads Quantibrite PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 340495 </td><td> Quantificação da densidade </td></tr><tr><td> Citômetro de fluxo </td><td> BD Immunocytometry Sistemas </td><td> BD LSR II </td><td> Densidade quantificação </td></tr><tr><td> Tubo capilar 0.7-1,0 milímetros x 30 &quot; </td><td> Kimble Glass Inc. </td><td> 46.485-1 </td><td> Micropipeta puxando </td></tr><tr><td> Óleo mineral </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2629-1 </td><td> Câmara de montagem </td></tr><tr><td> Tampa de vidro de microscópio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-G </td><td> Câmara de montagem </td></tr><tr><td> PE α-humano CD11a Clone HI 111 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0119-71 </td><td> Reagente para Fig.1 </td></tr><tr><td> PE anti-CD54 humano </td><td> eBioscience </td><td> 12-0549 </td><td> Reagente para Fig.1 </td></tr><tr><td> IgG1 Isotype Controle PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-4714 </td><td> Reagente para Fig.1 </td></tr><tr><td> micromanipulador hidráulico </td><td> Narishige </td><td> MO-303 </td><td> Micropipeta sistema </td></tr><tr><td> Manipulador mecânico </td><td> Newport </td><td> 461-xyz-m, SM-13, DM-13 </td><td> Micropipeta sistema </td></tr><tr><td> Tradutor piezoelétrico </td><td> Physik Instrumente </td><td> P-840 </td><td> Micropipeta sistema </td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td> Versão 8.6 </td><td> Micropipeta sistema </td></tr><tr><td> DAQ bordo </td><td> National Instruments </td><td> USB-6008 </td><td> Micropipeta sistema </td></tr><tr><td> Tabela óptica </td><td> Cinética de Sistemas </td><td> 5200 Series </td><td> Micropipeta sistema </td></tr></tbody></table>

ensaio de aderência de freqüência para in situ análise cinética de cross-juncional interações moleculares na interface célula-célula

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

O ensaio de adesão micropipeta foi desenvolvido em 1998 para medir a duas dimensões (2D) receptor-ligante cinética de ligação 1. O ensaio utiliza uma célula vermelha do sangue humano (RBC) como sensor de adesão e apresentar célula de uma das moléculas que interagem. Ela emprega micromanipulação para trazer o RBC em contato com outra célula que expressa a molécula de interagir com outras área controlada com precisão e tempo para permitir a formação de vínculo. O evento de adesão é detectado como alongamento RBC em cima puxando as duas células separadas. Ao controlar a densidade dos ligantes imobilizados na superfície RBC, a probabilidade de adesão é mantido em mid-range entre 0 e 1. A probabilidade de adesão é estimada a partir da freqüência de eventos de aderência em uma seqüência de ciclos de repetição do contato entre as duas células de um determinado tempo de contato. Variando o tempo de contato gera uma curva de ligação. Montagem de um modelo probabilístico para o receptor-ligante reação cinética de 1 a a ligaçãocurva retorna a afinidade 2D e desconto na tarifa. O teste foi validado usando interações de receptores Fcγ com IgG Fc 1-6, selectinas com ligantes glicoconjugada 6-9, integrinas com ligantes 10-13, homotypical caderina vinculativo 14, T receptor celular e co-receptor com complexos peptídeo-major de histocompatibilidade 15 - 19. O método tem sido utilizado para quantificar os regulamentos da cinética 2D por fatores biofísicos, tais como a membrana microtopology 5, membrana âncora 2, orientação molecular e comprimento 6, rigidez transportadora 9, 20 curvatura, e força impingement 20, bem como os fatores bioquímicos, tais como moduladores do microambiente citoesqueleto e membrana onde as moléculas interagem e reside na organização superfície dessas moléculas 15,17,19. O método também foi usado to estudo a ligação simultânea de dupla receptor-ligante 3,4 espécies e interações trimolecular 19 usando um modelo modificado 21. A principal vantagem do método é que ele permite estudo de receptores de membrana em seu ambiente nativo. Os resultados poderiam ser muito diferentes daqueles obtidos com receptores purificada 17. Ele também permite estudo das interações receptor-ligante em uma escala de tempo sub-segundo, com resolução temporal muito além dos métodos típicos bioquímicos. Para ilustrar o método de freqüência de adesão micropipeta, mostramos a cinética de medição da molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) em hemácias funcionalizados ligação a integrina β α L 2 em neutrófilos com dimérica E-selectina na solução para ativar α β L 2.

Um ensaio de freqüência de adesão para medir cinética de interação receptor-ligante, quando ambas as moléculas estão ancoradas nas superfícies das células que interagem é descrito. Este ensaio mecanicamente baseado é exemplificado usando uma micropipeta pressurizado glóbulo vermelho humano como sensor de adesão e integrinas αLβ2 e molécula-1 de adesão intercelular como interagindo receptores e ligantes.

Ensaio de aderência de freqüência para In Situ Análise Cinética de Cross-juncional interações moleculares na interface célula-célula

O ensaio de adesão por micropipeta foi desenvolvido em 1998 para medir a cinética de ligação receptor-ligante bidimensional (2D)1. O ensaio utiliza um eritrócito humano...

O objetivo geral do experimento a seguir é medir a cinética da interação entre receptor e ligante quando ambas as moléculas estão ancoradas nas superfícies das células que interagem. Isso é alcançado primeiramente funcionalizando as hemácias, que atuam como sensores de adesão, com ligantes, e preparando células portadoras de receptores. Como segundo passo, a câmara de micropipeta é montada e testes de adesão são realizados para registrar os eventos de adesão.Em seguida, traça-se a curva da probabilidade de adesão em função do tempo de contato entre as células e realiza-se o ajuste com o modelo. Para estimar os parâmetros cinéticos, obtêm-se resultados que mostram a afinidade efetiva de ligação em duas dimensões e a taxa de dissociação estimadas a partir dos dados. De onde surge então a ideia deste ensaio?As pessoas estudam a interação entre receptores e ligantes. Na maioria das vezes, medem as forças de ruptura, e estamos fazendo a mesma coisa, mas um dia pensamos: será que poderíamos simplesmente medir o resultado binário — zero para ausência de adesão e um para adesão — e derivar a medição da cinética a partir dessas medições binárias para demonstrar o ensaio de frequência de microcanal? A Dra. Veronica Zana Zina, cientista pesquisadora do meu laboratório, mostrará o experimento a vocês.Hemácias isoladas de sangue total são biotiniladas para o ensaio de frequência de adesão. Para iniciar este procedimento, centrifugue o tubo contendo hemácias isoladas, alíquota 10 microlitros do pellet de hemácias em cada um de vários frascos e adicione a quantidade correspondente de PBS a cada frasco para preparar múltiplas concentrações de biotinilação de hemácias. Em seguida, adicione 10 microlitros de tampão bore oito 0,1 molar a cada frasco.Em seguida, adicione uma quantidade calculada de solução de biotina a cada frasco e agite imediatamente em vórtex. Por alguns segundos, coloque cada frasco de hemácias dentro de um tubo cônico de 50 mililitros e incube em rotação durante 30 minutos à temperatura ambiente. Após 30 minutos, adicione o tampão EAS 45 a cada frasco e centrifugue por dois minutos a 2000 rotações por minuto. Repita a lavagem com o tampão EAS 45 duas vezes, totalizando três lavagens.Finalmente, adicione 100 microlitros de tampão EAS 45 a cada frasco e armazene a quatro graus Celsius para funcionalizar os ligantes na superfície dos eritrócitos por meio do método descrito no passo anterior. Os eritrócitos são incubados com uma concentração saturada de strep TTR durante 30 minutos a quatro graus Celsius e lavados três vezes com tampão EAS 45 por dois minutos a 2000 rotações por minuto. Após isso, incube os eritrócitos diretamente com o ligante biotinilado ou incube os eritrócitos com o respectivo anticorpo capturador biotinilado, seguido pela incubação com os ligantes. O protocolo mostrado neste vídeo utiliza o anticorpo capturador biotinilado.Micro pipetas são fabricadas utilizando tubos capilares de vidro borossilicato com ponto de fusão baixo. Primeiro, utilize um puxador de micro pipetas para puxar os tubos capilares. Em seguida, utilize um micro manipulador com uma micro fornalha para cortar a ponta da micro pipeta até obter uma abertura do tamanho desejado.O diâmetro necessário geralmente varia de um a cinco mícrons, dependendo do tamanho das células a serem utilizadas no estudo. Para preparar a câmara de células, utilize dois pedaços de lamínulas de microscópio cortados no tamanho desejado, remova a poeira das lamínulas com um spray de ar comprimido, adicione o meio da câmara de células e feche a câmara usando óleo mineral por ambos os lados para evitar a evaporação do meio. Isso alteraria a osmolaridade durante o experimento.O sistema de micropipeta utilizado neste ensaio consiste em três subsistemas: um subsistema de imagem para observar, registrar e analisar os movimentos da célula aspirada pela micropipeta, um subsistema de micro-manipulação para permitir a seleção de células da câmara de células e um subsistema de pressão para aspirar as células para dentro das micropipetas. A peça central do subsistema de imagem é um microscópio invertido com objetivo de imersão em óleo de 100 vezes. As imagens do objetivo são detectadas por uma câmera de dispositivo de carga acoplada e enviadas a um gravador de vídeo.Um cronômetro em vídeo é acoplado ao sistema para acompanhar o tempo. Após preencher a micropipeta com água desionizada, coloque-a em seu suporte sobre uma unidade mecânica montada no microscópio. A micropipeta pode ser posicionada com precisão por meio de um micromanipulador hidráulico de três eixos.Um dos suportes para micropipetas é montado em um tradutor piezoelétrico programado por computador. Isso permite que a pipeta seja movida com precisão e em um ciclo de teste de adesão. O subsistema de regulação de pressão é usado para controlar a sucção.Durante o experimento, uma linha hidráulica conecta o suporte de micropipeta a um reservatório de fluido. Um posicionador mecânico fino permite que a altura do reservatório seja manipulada com precisão. Após a montagem da câmara, as micropipetas são posicionadas, as células são injetadas na câmara para iniciar o ensaio, as células interagentes são aspiradas pelas respectivas pipetas e o tradutor elétrico PSO é usado para movimentar o glóbulo vermelho para dentro e para fora do contato com o neutrófilo, controlando a área e o tempo de contato.Um evento de adesão é observado quando o glóbulo vermelho se alonga durante a separação celular; um evento sem adesão corresponde à ausência de alongamento do glóbulo vermelho. Registre os eventos de adesão observados adicionando um para adesão ou zero para ausência de adesão em uma coluna de uma planilha do Excel.Registre a curva de frequência de adesão versus tempo de contato utilizando pelo menos três pares diferentes de células para cada tempo de contato. Para obter uma média e erro padrão da média (SEM) como controle, registre a curva de ligação não específica utilizando eritrócitos revestidos com ligantes relevantes e/ou bloqueando os ligantes ou receptores com seu bloqueio funcional específico. Utilizando anticorpos monoclonais, a frequência específica de adesão em cada ponto de tempo de contato pode ser calculada subtraindo-se a frequência de adesão não específica.A frequência específica de adesão versus os dados de tempo de contato são ajustados por um modelo probabilístico que descreve uma interação de único passo de segunda ordem direta e de primeira ordem inversa entre uma única espécie de receptores e uma única espécie de ligantes. Nesta equação, KA é a afinidade 2D. KA é a taxa de dissociação 2D.MR e ML são as densidades do receptor e do ligante, respectivamente, e AC é a área de contato. O ajuste da curva possui dois parâmetros, ac, k, a, e K off, já que AC e KA são agrupados e denominados coletivamente afinidade efetiva 2D; seu produto com a taxa de dissociação é a taxa efetiva de associação 2D: AC K on equivale a AC KA multiplicado por K off. É apresentado aqui um exemplo da determinação da integrina alfa L beta dois.Densidade do sítio em neutrófilos. Os neutrófilos foram primeiro incubados com um micrograma por mililitro de E-selectina IG e, em seguida, com concentrações saturantes de anti-CD11a conjugado com PE, um anticorpo monoclonal, ou IgG de camundongo relevante como controle. Após 30 minutos de incubação, as amostras foram lavadas e analisadas em um citômetro de fluxo com quantidade padrão.Esferas de calibração PE brilhantes. O painel A mostra histogramas de fluorescência de esferas de calibração juntamente com os de células tratadas ou não tratadas com E-selectina IG. A marcação com anticorpo monoclonal específico para CD11A é mostrada em curvas contínuas e a marcação com anticorpo controle de isotipo correspondente é mostrada em curvas tracejadas.O painel B mostra o processo de quantificação da densidade. O log 10 foi calculado para a intensidade média de fluorescência de cada uma das quatro esferas. Valor do pico de calibração do painel A e do lote específico de moléculas de PE por esfera.Uma regressão linear de log₁₀ de moléculas de PE por microesfera em função do log₁₀ de fluorescência foi traçada para reselecionar as células infiltradas. O valor de log₁₀ fi é igual a 3,99, indicado pelo círculo azul preenchido, e 2,23, indicado pelo círculo azul aberto, para o anticorpo monoclonal específico e para o anticorpo controle, respectivamente. Quando a equação linear para X foi resolvida, o número total de alfa L beta dois ou neutrófilos foi calculado como 9.587.A densidade superficial foi calculada como 43 sítios por micrômetro quadrado, utilizando 8,4 micrômetros como diâmetro do neutrófilo. O próximo gráfico mostra a frequência acumulada de adesão fi para ligação específica em um segundo e 10 segundos. Os tempos de contato foram medidos a partir de ciclos repetidos de teste de adesão entre eritrócitos revestidos com ICAM-1 e neutrófilos humanos expressando integrina alfa L beta 2.Em contraste, é mostrada aqui a frequência de adesão corrida fi para ligação inespecífica em tempos de contato de um segundo e dez segundos, medidos a partir de ciclos repetidos de teste de adesão entre hemácias revestidas com IgG humana e neutrófilos humanos expressando integrina alfa L beta dois. Este gráfico final ilustra a cinética das probabilidades de ligação da I A um à integrina alfa L beta dois em neutrófilos, medidas para três pares de células em cada tempo de contato, que foram médias e plotadas em função do tempo de contato para controle da ligação inespecífica. Duas condições diferentes foram utilizadas.Um glóbulo vermelho recoberto com o anticorpo de captura anti-TFC e incubado com IgG humana em vez de ICAM-1, IG e dois neutrófilos ligando-se a glóbulos vermelhos não recobertos com o anticorpo de captura. A ligação não específica registrada como curva de controle com IgG humana foi utilizada para obter uma curva específica de probabilidade de adesão. Utilizando a equação previamente descrita para correção de ligação não específica.A curva corrigida de probabilidade de adesão específica foi ajustada com o ajuste de modelo. A curva de probabilidade de adesão específica retornou a afinidade de ligação efetiva. Um CKA equivale a 1,4 vezes 10 elevado a menos quatro mícrons à quarta potência e koff equivale a 0,3 s⁻¹.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir a cinética da interação receptor-ligante quando ambas as moléculas estão ancoradas nas superfícies das células de interação I. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de testar inicialmente diferentes densidades no lado do ligante, de modo que a frequência de adesão fique na faixa média, e lembrar-se de que trabalhar com sangue e alguns reagentes específicos para tratamento, por exemplo, azida de sódio e DM, pode ser extremamente perigoso. Portanto, precauções como a leitura cuidadosa das FISP dos reagentes e o uso de luvas durante a realização deste procedimento são obrigatórias.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Neste vídeo, demonstramos a técnica para medir as interações transcelulares entre moléculas de adesão celular sináptica por meio do ensaio de agregação de células HEK. Neste ensaio, um número igual de células HEK expressando uma molécula de adesão celular pré-sináptica desejada e uma proteína fluorescente são misturadas com células HEK expressando uma molécula de adesão celular pós-sináptica e outra proteína fluorescente. A interação entre as moléculas de adesão celular força as células a se...

Ensaio de agregação celular para detectar interações trans entre moléculas de adesão celular

Este protocolo avaliados eléctrico Cell-substrato impedância de detecção, um método para gravar e analisar o espectro de impedância de células aderentes, para a quantificação da ligação da célula, a proliferação, a motilidade, e as respostas celulares a estímulos farmacológicos e tóxicos. Detecção de permeabilidade endotelial e avaliação de célula-célula e célula-substrato contatos são enfatizadas.

Elétrica Cell-substrato impedância Sensing para a quantificação do endotelial Proliferação, Barreira Function, e Motilidade

Esta apresentação demonstra um método pelo qual a eletroporação de células aderentes e cultivadas é usada para o estudo da comunicação intercelular e juncional, enquanto as células crescem em uma lâmina revestida com óxido de índio-estanho condutor e transparente.

Um ensaio funcional para juncional Exame; Eletroporação de aderentes em células no Índio-Tin Oxide

Aqui nós descrevemos um protocolo que os casais duas técnicas proteômicas, ou seja, 2-dimensional Eletroforese (2DE) e Espectrometria de Massa (MS), para identificar diferencialmente expressos / proteínas pós-traducionais modificados entre dois ou mais grupos de amostras primárias. Esta abordagem, em conjunto com ensaios funcionais, permite a identificação e caracterização de marcadores / alvos terapêuticos prognósticos.

A partir de um ponto 2DE-Gel para a função da proteína: lição aprendida com HS1 em leucemia linfocítica crônica

Descrevemos uma técnica para medir simultaneamente a cinética de ligação de um único receptor-ligante regulada por força e imagens em tempo real da sinalização de cálcio em um único linfócito T.

Fluorescência Biomembrane Força Probe: quantificação simultânea de Kinetics receptor de ligando e induzida Encadernação-Sinalização Intracelular em uma única célula

Este ensaio de adesão fluxo fornece um modelo de impacto simples, alta de interações celulares de células-epitelial T. Uma bomba de seringa é utilizado para gerar a tensão de corte, e microscopia confocal captura imagens para efeitos de quantificação. O objectivo destes estudos é o de quantificar eficazmente a adesão de células T utilizando condições de fluxo.

Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações

Este estudo demonstra a utilidade e a facilidade de medição de extensão quantitativa da membrana celular e sua correlação com capacidade adesiva de células. Como um exemplo representativo, mostramos aqui essa proteína relacionada ao Dickkopf 3 (DKK3) promove aumento lobopodia formação e aderência de célula em carcinoma adrenocortical em vitrode células.

Caracterização de extensões da membrana celular e estudando seus papéis na dinâmica de adesão celular câncer

Adesão dinâmica de células imunes a parede do vaso é um pré-requisito para hospedagens de intestino. Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio funcional em vitro para a análise de impacto de anticorpos anti-integrina, quimiocinas ou outros fatores sobre a adesão da dinâmica celular de células humanas usando capilares morada-revestido.

Ensaio de adesão dinâmico para a análise funcional das terapias antiaderência na doença inflamatória intestinal

Este protocolo descreve uma abordagem de baseados em espectroscopia de flutuação de fluorescência para investigar interações entre proteínas mediando as interações célula-célula, ou seja, as proteínas localizadas em cruzamentos de célula, diretamente em células vivas. Nós fornecemos orientações detalhadas na calibração de instrumentos, aquisição de dados e análise, incluindo correcções de fontes possível artefato.

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para medir rapidamente e semiquantitativamente as interações ligantes-receptores em trans em um sistema celular heterologous usando microscopia de fluorescência.

Medindo interações transcelulares através da agregação de proteínas em um sistema celular heterologous

Este protocolo apresenta os procedimentos experimentais para realizar o ensaio da pegada de adesão para a imagem dos eventos de adesão durante a adesão rápida ao rolamento celular.

A adesão molecular de imagem em rolamento celular por ensaio de pegada de adesão

Aprenda a medir a cinética de interações receptor-ligante em superfícies celulares usando o ensaio de frequência de adesão com hemácias funcionalizadas como sensores. Este método permite estimar afinidade e taxa de dissociação.

Ensaio de aderência de freqüência para In Situ Análise Cinética de Cross-juncional interações moleculares na interface célula-célula (Vídeo) | JoVE Journal

Ensaio de aderência de freqüência para In Situ Análise Cinética de Cross-juncional interações moleculares na interface célula-célula

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