Ensaio redobrando intracelular
24 de janeiro de 2012
Neste protocolo um método para medir refolding proteína intracelular após choque térmico é descrito. Este método pode ser usado para estudar foldases como chaperonas moleculares e seus co-fatores ou compostos capazes de influenciar a sua actividade. Firefly luciferase atividade é utilizado como repórter para medir a atividade refolding acompanhante.
O objetivo geral do experimento a seguir é medir a refoldagem intracelular de proteínas dependente de chaperonas após choque térmico. Utilizando um repórter de luciferase, transfete primeiro as células com plasmídeos contendo o gene repórter de luciferase e a chaperona de interesse. Em seguida, divida as células transfectadas para os pontos de tempo de recuperação no delineamento experimental.
No dia seguinte, submeta as células a um choque térmico para induzir o desdobramento proteico. Permita um período de recuperação para restabelecer a refoldagem intracelular das proteínas e, em seguida, meça a atividade do repórter luciferase. Os resultados medem a refoldagem proteica dependente do tempo e de chaperonas, com base no ensaio de luciferase.
A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o ensaio de refoldagem in vitro, é a possibilidade de obter uma leitura fisiológica do efeito de compostos ou proteínas sobre a atividade de chaperonas. As implicações desta técnica estendem-se a terapias para uma ampla gama de doenças, como doenças neurodegenerativas ou câncer, porque as chaperonas desempenham um papel importante no desenvolvimento dessas patologias. Primeiro, aqueça previamente o meio de cultura, o PBS e a tripsina a 37 graus Celsius em banho-maria.
Lave uma cultura confluente de células HEK 293 com cinco mililitros de PBS. Em seguida, adicione um mililitro de tripsina contendo 0,025% de EDTA, rotacione suavemente a placa para uma distribuição uniforme da tripsina e incube a 37 graus Celsius. Agite periodicamente a placa para verificar a dessanexão celular.
Agora, ressuspenda as células em 10 mililitros de meio DMEM completo e transfira para um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, conte as células utilizando uma placa de contagem Beckman. Incube as células em torno de 60 a 70% de confluência por seis a oito horas.
Equilibre o reagente Extreme Gene Nine à temperatura ambiente e o alíquota do meio sem soro a 37 graus Celsius. Pipete o meio sem soro em dois tubos Eppendorf. Em seguida, adicione o reagente Extreme Gene Nine sem tocar na parede do tubo Eppendorf e incube por cinco minutos à temperatura ambiente.
Enquanto isso, prepare as misturas de transfeção 2D NA no tubo um, adicione ran vanilla firefly e um controle de vetor vazio no tubo dois. Adicione o ran vanilla firefly e a chaperona molecular. Adicione o DNA à mistura do reagente de transfeção, vortexie e incube em temperatura ambiente por 20 minutos.
Continue adicionando essa mistura sobre as células cultivadas e incube por 24 horas. Colete as células transfectadas utilizando tripsina, semeie as células com 60 a 70% de confluência em placas de seis poços e deixe-as no incubador durante a noite. Aspire o meio das células transfectadas.
Em seguida, adicione um mililitro de tampão de choque térmico e incube por 30 minutos. Para interromper a síntese de proteínas Denovo, feche as tampas com tiras de paraforma e incube em banho-maria a 45 graus Celsius por 30 minutos. Agora remova a paraforma e coloque as células de volta no incubador para recuperação nos pontos de tempo especificados.
Colete as células e lave uma vez com PBS. Para uma lise celular eficiente, congele rapidamente o pellet celular em nitrogênio líquido, adicione 200 microlitros de tampão de lise passiva diluído. Em seguida, alíquota em triplicata. 30 microlitros do lisado celular por poço de uma placa de 96 poços.
Para avaliar a eficiência de transfeção, comece com as amostras de referência não submetidas à choque térmico. Para medir a atividade da luciferase ran, prepare um tampão de reação fresco de Lucifer a 0,2 milimolar em tampão glicina-glicina contendo 1 milimolar de ATP e 0,2 micromolar de tampão de reação ezina. Insira a placa de 96 poços no luminômetro e inicie o programa.
Estação de trabalho Wallach 1420. Introduza a bomba um no tubo Falcon contendo tampão de reação de ezina 0,2 micromolar. No menu, selecione a opção manutenção do dispensador e marque a bomba um.
Selecione a opção preencher para editar o layout da placa. Escolha a opção, explore o protocolo e os resultados no menu. Selecione o protocolo.
Agora selecione os poços a serem lidos. Volte ao Wallach manager e clique em iniciar para medir as emissões das amostras. Em 482 nanômetros, prossiga para a manutenção do dispensador e selecione esvaziar e bombear um para liberar toda a solução residual de volta ao tubo.
Agora, mova o tubo para um tubo cônico contendo água e marque, enxague. Continue selecionando vazio. Em seguida, coloque o tubo da bomba um no tampão de reação e o tubo da bomba dois na solução de LUCIFERINA.
Altere o layout da placa. Selecione preencher para a bomba um e a bomba dois. No menu de manutenção do dispensador, selecione o protocolo e inicie a medição do comprimento de onda da reação da luciferase de vaga-lume de 560 nanômetros.
No final da repetição, repita o procedimento: esvazie, lave, esvazie. Para a bomba um e a bomba dois, visualize os resultados no Wallach 1420 Explorer. Cada experimento está associado a um ensaio.
Número de nome de usuário, datas de início e fim, exportar resultados como um arquivo Excel. Para análise, o refolding de proteínas está diretamente relacionado ao tempo de recuperação. Neste experimento, as células são avaliadas em diferentes pontos de tempo após o choque térmico.
Na ausência e na presença do chaperone molecular. Como esperado, a porcentagem de luciferase renaturada aumenta com o tempo prolongado de recuperação tanto nos controles quanto nas células transfectadas com o chaperone molecular. Em contraste, um conjunto de dados inválido exibe baixos valores de R quadrado para a correlação entre tempo e renaturation.
Após esta técnica, outros métodos, como o ensaio de TPA in vitro, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a inibição da atividade enzimática da chaperona. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir proteínas intracelulares. Nós seguimos após o choque térmico.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para medir a refoldagem de proteínas intracelulares após choque térmico, com foco no papel das chaperonas moleculares. A atividade da luciferase de vaga-lume serve como repórter para avaliar a atividade de refoldagem das chaperonas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Dobramento de Proteínas
- Chaperonas Moleculares
Antecedentes
- Compreender o refoldamento de proteínas é essencial para a função celular.
- O choque térmico pode levar ao desdobramento de proteínas, exigindo mecanismos de refoldamento.
- As chaperonas moleculares auxiliam no processo de refoldamento.
- Os ensaios de luciferase fornecem uma medida quantitativa da atividade de refoldamento.
Objetivo do Estudo
- Medir a refoldagem proteica intracelular dependente de chaperonas.
- Investigar os efeitos do choque térmico na estrutura proteica.
- Utilizar a luciferase como repórter para avaliar a atividade de chaperonas.
Métodos Utilizados
- Transfecção de células com plasmídeos contendo os genes da luciferase e de chaperonas.
- Estabelecimento de pontos de tempo para recuperação após transfeção.
- Indução de choque térmico para promover o desdobramento proteico.
- Medição da atividade da luciferase para avaliar a eficiência de refoldamento.
Resultados Principais
- Observou-se o refolding dependente do tempo de proteínas.
- A atividade de chaperonas foi confirmada por meio de ensaios de luciferase.
- Os resultados indicaram a eficácia das chaperonas na recuperação de proteínas.
- Os dados apoiam o papel das chaperonas moleculares nas respostas celulares ao estresse.
Conclusões
- O método mede efetivamente o refolding de proteínas após choque térmico.
- Ensaios de luciferase são uma ferramenta confiável para estudar a atividade de chaperonas.
- Os resultados contribuem para a compreensão da homeostase proteica em células.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este ensaio de refoldamento intracelular fornece uma leitura baseada em células para medir a atividade de chaperonas moleculares, permitindo a validação de alvos em vias de homeostase proteica. Ao associar a função da chaperona ao refoldamento da luciferase, ele auxilia na redução de riscos mecanicistas na descoberta de fármacos para oncologia e neurodegeneração. O ensaio facilita a triagem de compostos moduladores da atividade de chaperonas, contribuindo para a identificação de compostos líderes e confiança preditiva em modelos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar o refoldamento de proteínas dependente de chaperonas como uma hipótese terapêutica em vias de resposta ao estresse.
- Valor Operacional: Fornece uma leitura quantitativa baseada na luciferase para avaliar a função de chaperonas em células vivas.
- Valor Preditivo: Reforça a confiança no alvo ao medir os efeitos de compostos sobre a atividade intracelular de refoldamento.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera dados de resposta dose-dependente para compostos que inibem ou estimulam o refoldamento mediado por chaperonas.
- Valor Operacional: Utiliza um sistema dual de luciferase normalizado (luciferase de vaga-lume/renilha) para controlar a eficiência de transfeção e a variabilidade.
- Escalabilidade: Compatível com formatos de placas de 96 poços para campanhas de triagem de média escala.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela o envolvimento de chaperonas na quimiorresistência ao câncer e na neurodegeneração, apoiando o alinhamento translacional de biomarcadores.
- Continuidade Pré-clínica: Conecta a validação de alvos à avaliação funcional da atividade de chaperonas em sistemas relevantes para doenças.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Permite decisões de avançar/não avançar com base nos efeitos do composto sobre mecanismos de proteostase.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores e a avaliação pré-clínica, especialmente para moduladores das redes de dobramento proteico.
- Biologia da Descoberta: Testa hipóteses sobre a função de chaperonas no refolhamento intracelular após o desdobramento proteico induzido por choque térmico.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis de luminescência adequadas para triagem de bibliotecas de compostos.
- Análise: Fornece métricas de refolhamento dependentes do tempo e das chaperonas, para comparação de condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se a modelos pré-clínicos nos quais as chaperonas influenciam a progressão da doença em câncer e neurodegeneração.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliação de moduladores de chaperonas em múltiplas classes de alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Mede o engajamento do alvo por meio da saída funcional de refolding, reduzindo a ambiguidade mecanicista na modulação de chaperonas.
- Valor Operacional: Padroniza as condições do ensaio utilizando protocolos definidos de transfeção e recuperação para reprodutibilidade entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Melhora a priorização de portfólios ao identificar compostos com efeitos desejados sobre as vias de proteostase.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço ajustado ao risco de candidatos direcionados a chaperonas nas áreas terapêuticas de oncologia e sistema nervoso central.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em transfeção de células de mamíferos e ensaios de repórter luciferase.
- Depende da compatibilidade do luminômetro para detecção de luciferase em duplo comprimento de onda.
- Necessita condições padronizadas de choque térmico e recuperação em todos os lotes experimentais.
- A adaptação a outros pares chaperona-cliente pode exigir validação da dependência no refreamento.
- Limitado a repórteres proteicos solúveis e capazes de refreamento, como a luciferase; não é adequado para clientes propensos à agregação sem modificações.
