Name: Ensaio redobrando intracelular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Aprenda a medir o reenrolamento intracelular de proteínas após choque térmico usando luciferase como repórter. Este método avalia a atividade de chaperonas moleculares em células HEK293.

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Danilo Maddalo é beneficiário de uma bolsa de pesquisa no Grupo de Jovem Pesquisador (YIG) do Instituto de Tecnologia de Karlsruhe.

1. Semeadura das células <ol><li> Antes de começar, aqueça o meio de cultura, a PBS 1X e da tripsina em banho-maria a 37 ˚ C </li><li> Tome as células fora da incubadora e aspirar o médio. </li><li> Aplicar suavemente 5 mL de PBS 1X sobre as células de lavá-las. </li><li> Aspirar o PBS 1X e aplicar 1 mL de tripsina contendo 0,025% EDTA. </li><li> Gire gentilmente a placa para ter uma distribuição uniforme da tripsina. </li><li> Coloque as células na incubadora a 37 ˚ C por 5-10 minutos (dependendo do tipo de célula). De tempos para verificar o tempo se as células são separadas por agitação da placa. </li><li> Ressuspender as células em 10-20 mL de meio e recolhê-las em um tubo falcon 50 mL. </li><li> Contar as células utilizando um contador Beckman. O número de células deve ser suficiente para garantir uma confluência de aproximadamente 60-70%. </li><li> Placa das células e permitir-lhes sementes de 6-8 horas. </li></ol> 2. Transfection <ol><li> Antes de transfecção, aquecer uma alíquota de soro livre médio em banho-maria a 37 ˚ C. </li><li> Trazer o Gene X-treme 9 a temperatura ambiente. </li><li> Pipeta o meio isento de soro em dois tubos de eppendorf (1 tubo de transfecção = 1). </li><li> Pipeta o Gene X-treme 9 na atenção meio isento de soro pagar que a ponta não toca a parede de plástico do eppendorf e incubar por 5 minutos. Nesse meio tempo preparar duas mixagens DNA: em um tubo de misturar os plasmídeos para renilla, vagalume e um controle do vetor vazio, em outro renilla tubo, firefly ea acompanhante molecular. </li><li> Adicione a mistura de DNA de cada eppendorf contendo meio livre de soro + X-treme Gene 9, vortex e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos. </li><li> Adicionar gota a gota cada mistura em cada placa e incubar por 24 horas a 37 ° C e CO 2 5% </li></ol> 3. Divisão das células <ol><li> 24 horas após a transfecção, trypsinize as células como descrito em 1,4-1,6 e diluí-los a uma confluência final de 60-70% em uma placa de 6 poços. </li><li> Prepare um prato para o controle não-chocado e como muitos pratos como os pontos de tempo de recuperação que têm de ser analisados, como mostrado na figura. 2. </li></ol> 4. Choque térmico <ol><li> Para choque de calor, pré-aquecido soro contendo meio em banho-maria a 37 ˚ C. </li><li> 'Buffer de choque térmico "preparar diluindo em meio cicloheximida soro contendo uma concentração final de 20 mcg / ml e MOPS a 20 mM. </li><li> Agora tire as placas da incubadora e aspire o meio. </li><li> Adicionar a cada 1 mL de bem 'buffer de choque de calor ", e incubar por 30 minutos a 37 ˚ C e 5% de CO 2 (incluem também a placa de referência neste tratamento). Isto irá parar de novo a síntese de proteínas. </li><li> Enquanto isso no interruptor em um banho de água e definir o temperatura de 45 ˚ C. </li><li> Após a incubação, a tampa de vedação das placas com Parafilm previamente cortados em tiras. A placa de referência (100% de refolfed vagalume) fica na incubadora. </li><li> Incubar as placas a 45 ˚ C durante 30 minutos. </li><li> Remova as placas do banho-maria, retire o parafilme e colocar as placas de volta para a incubadora para permitir a recuperação. </li><li> Em cada ponto de colheita o tempo as células e lavá-los em PBS 1X por centrifugação em 2000Xg por 1 minuto a 4 ˚ C. </li></ol> 5. Lise celular e ensaio de luciferase <ol><li> Para uma lise celular eficiente, snap congelar o pellet celular em nitrogênio líquido. </li><li> Adicionar 200 mL de tampão de lise passiva diluído 1:5 em água destilada duas vezes em um tubo de vidro. </li><li> Adicionar 30 mL do lisado de células em uma placa de 96 também. Cada amostra é pipetados em triplicata. </li><li> Apenas o "não chocado" amostras de referência será utilizado paraler a atividade renilla luciferase, uma vez que esta etapa é utilizado para verificar a eficiência de transfecção iguais. </li><li> Preparar as soluções para o ensaio. Para a solução de luciferina luciferina diluir para uma concentração final de 0,2 mM em Gly-Gly buffer. Para o tampão de reação diluir TDT e ATP a concentração final 1mM em Gly-Gly buffer. Para tampão de reação celenterazina, diluir celenterazina para uma concentração final de 0,2 mM em tampão celenterazina. Mantenha solução luciferina e celenterazina luz tampão de reação protegida. </li><li> Agora coloque a placa de 96 poços na luminómetro e iniciar o programa 'Wallac 1420 Workstation. </li><li> Introduzir o Pump1 no tubo falcon contendo a solução celenterazina. Feche a tampa para que a luz não pode entrar em contato com o tubo. </li><li> Escolha no menu 'manutenção Dispenser' a opção e marque Pump1. </li><li> Selecione a opção "Fill". </li><li> Para editar o layout da placa escolha a opção "Explorar protocolo e resultados" no menu. Selecione o protocolo e clique duas vezes sobre ele. Agora selecione os poços a serem lidos. </li><li> Voltar ao 'Wallac Manager' e clique em "Iniciar". A reação entre o luciferase renilla e seu substrato celenterazina emite luz com um comprimento de onda de 482 nm. </li><li> Após a leitura, vá em "manutenção Dispenser 'e selecione' Vazio 'e Pump1 para liberar toda a solução residual de volta para o tubo. </li><li> Agora mova o tubo para um tubo falcon contendo água e marque a opção 'flush'. </li><li> Após a etapa de lavagem, esvaziar o tubo por selecionar 'vazio'. </li><li> Colocar o tubo de Pump1 no tubo do tampão de reação falcon e um da Pump2 no tubo falcon luciferina. </li><li> Alterar o layout da placa. </li><li> Selecione 'Preencher' para Pump1 e Pump2 da Di 'menu de Spenser Manutenção '. </li><li> Selecione o protocolo e iniciar a leitura. A reação entre o Firefly luciferase e luciferina seu substrato emite luz com um comprimento de onda de 560 nm. </li><li> No final da leitura repita o procedimento Vazio-Flush-vazio para Pump1 e Pump2. </li><li> Resultados já estão disponíveis no 'Wallac 1420 Explorer'. </li><li> Cada experimento é associado a um número ensaio, nome de usuário, data de início e fim. </li><li> Resultados podem ser exportados como um arquivo de Excel. </li><li> Para os cálculos, as células são divididas em três grupos: 1. não chocou amostras de referência (definido como 100% de refolded firefly luciferase), 2. células sem chaperone molecular e calor chocado; 3. células com chaperone molecular e calor chocado. </li></ol> 6. Resultados representante Refolding proteína está diretamente relacionada ao tempo de recuperação, portanto, para testar se o sistema está funcionando pro Perly, um ensaio deve ser realizada coleta de células em diferentes momentos. A correlação direta tempo / percentual de refolding indica que o experimento foi devidamente realizado e, portanto, representa um fator limitante. No entanto, deve ser sempre considerado que refolding após choque térmico é um evento saturando e, portanto, uma análise adequada do tempo é claro deve ser realizada antes de iniciar qualquer experimento. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Visão geral do experimento. Ensaio in vivo de refolding exige 3 a 4 dias para ser concluída. No dia 1 células são semeadas e transfectadas. As células são parceladas dia seguinte em um formato menor e no dia 3 de calor são chocados. Neste ponto é possível realizar o ensaio de luciferase logo após a colheita as células ou para salvar o pellet celular a -80 ° C e realizar o teste em outro momento _content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Divisão celular. No dia 2 células dividem-se em uma placa de seis poços. Cada transfecção será diluído em um poço, a fim de ter todos os transfecção no mesmo prato. Cada placa irá corresponder a um tempo de recuperação especial além de uma placa de referência não chocado. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Bom resultado Representante. A. Porcentagem de refolding medido diretamente pela atividade firefly luciferase. Cada gráfico de barras representa a porcentagem de refolding na ausência (barras pretas) e na presença (barras vermelhas) de uma chaperone molecular em diferentes momentos de recuperação. B. Correlação entre tempo e redobrando na ausência (linha preta) e na presença (linha vermelha) de acompanhante. Os valores de r ao quadrado indicam boa correlação. Em Fig.3A é mostrado um resultado representativo onde as células foram coletadas 15, 30, 45, 60 e 120 após choque térmico na ausência (barras pretas) e na presença (barras vermelhas) de chaperone molecular. Percentual de refolded aumenta luciferase com o tempo de recuperação prolongado e com a transfecção do chaperone molecular. A correlação entre refolding e tempo para o controle (Fig. 3B, linha preta) e do chaperone molecular células transfectadas (Fig. 3B, linha vermelha) é mostrado. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Representante mau resultado. A. Porcentagem de refolding medido diretamente pela atividade luciferase. Cada gráfico de barras representa a porcentagem de refolding na ausência (barras pretas) e na presença (barras vermelhas) de uma chaperone molecular em diferentes momentos de recuperação. B. Correlação entre tempo e redobrando na ausência e na presença (vermelho line) de acompanhante. Os valores de r ao quadrado indicam correlação ruim. Figura 4A. Mostra um resultado representativo de uma experiência não adequadamente realizada. Tanto o controle (barras pretas) eo chaperone molecular transfectadas células (barras vermelhas) não mostraram um aumento na proteína refolding com o tempo. Além disso, transfecção do chaperone molecular não resultou em um aumento de renaturação. Esta baixa correlação é confirmada na fig. 4B mostrando um valor de r quadrados de 0,6619 e 0,1882, respectivamente, para o controle (linha preta) e do chaperone molecular transfectadas células (linha vermelha).

<ol><li>Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperones+and+protein+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperones and protein quality control.</a> Cell. 125, 443-443 (2006).</li>
<li>Ritossa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+the+heat+shock+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Discovery of the heat shock response.</a> Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).</li>
<li>Hendrick, J. P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperone+functions+of+heat-shock+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperone functions of heat-shock proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).</li>
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<li>Guzhova, I., Margulis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperone+as+a+survival+factor+in+cell+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology.</a> Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).</li>
<li>Whitesell, L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90+and+the+chaperoning+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">HSP90 and the chaperoning of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).</li>
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<li>Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+provides+neuroprotection+by+reducing+oxidative+stress+and+HSP70+expression+during+chronic+cerebral+hypoperfusion+in+ovariectomized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pineal.+Res%22%5BJournal%5D)">Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats.</a> J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).</li>
<li>Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DnaK%2C+DnaJ+and+GrpE+form+a+cellular+chaperone+machinery+capable+of+repairing+heat-induced+protein+damage%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage.</a> EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).</li>
<li>Thulasiraman, V., Matts, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+geldanamycin+on+the+kinetics+of+chaperone-mediated+renaturation+of+firefly+luciferase+in+rabbit+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate.</a> Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).</li>
<li>Howarth, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp40+molecules+that+target+to+the+ubiquitin-proteasome+system+decrease+inclusion+formation+in+models+of+polyglutamine+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease.</a> Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).</li>
<li>Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bag1+functions+in+vivo+as+a+negative+regulator+of+Hsp70+chaperone+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste trabalho um protocolo para medir a atividade refolding intracelular de chaperones moleculares é apresentado. O ensaio completo pode ser realizado em 3 a 4 dias como mostra a visão geral na fig. 1. A robustez ea linearidade do sinal de luz produzida pelo vaga-lume ea luciferase renilla representam uma base sólida para a reprodutibilidade do protocolo. A etapa crítica do ensaio é a escolha de um reagente de transfecção eficiente para garantir...

Para esta experiência &quot;Luz Vector &#39;a Luminômetro forma Perkin Elmer Contador Luminescência &#39;1420 foi usado Programas para o Luminômetro: Renilla: Bomba 1, 100 mL de injeção Tampão de reação: Pump1, 70 mL de injeção Luciferina: Pump2, a injeção de 30μl Para os buffers preparar estas soluções estoque em água destilada duas vezes: <ul style="list-style:none"><li> - 1M MgSO 4: 246,48 g MgSO 4 * 7H 2 O em 1 litro </li><li> - 0,5 M EGTA: 190,18 g EGTA em 1 litro </li><li> - 1M KH 2 PO 4: 136,09 g KH 2 PO 4 em 1 litro </li><li> - 1M K2 HPO 4: 228,23 g K 2 HPO 4 * 3H 2 O em 1 litro </li><li> - NaCl 5M: 292,2 g de NaCl em 1 litro </li><li> - 0,5 M EDTA: 186,12 g EDTA * 2H 2 O em 1 litro &nbsp;</li></ul> GLI-GLI-buffer: <ul style="list-style:none"><li> - 25mM Glycylglycin </li><li> - 15mm MgSO 4 </li><li> - 4 mM EGTA </li></ul> Para 1 litro use 3,3 g de Glycylglycin, 15ml de uma solução de MgSO4 1M e 8ml de uma solução 0,5 M EGTA. Resolver em água, ajustar o pH para 7,8 e trazer para um volume total de 1 litro. Tampão de reação para Renilla / celenterazina buffer: <ul style="list-style:none"><li> - &amp; Nbsp; 13,4 mM KH 2 PO 4 </li><li> - 86,6 mM KH 2 PO 4 </li><li> - 0,5 M NaCl </li><li> - 1mM EDTA </li></ul> Para 1 litro ml usar 13,4 de um 1M KH 2 PO 4 solução, 86,6 ml de uma 1M K 2 HPO 4 solução, 100ml de uma solução de NaCl 5M e 2ml de uma solução de EDTA 0,5 M. <table border="1"><tr><td></td><td> Companhia </td><td> Catálogo / Produto Número: </td></tr><tr><td> DMEM (Dulbecco Modificado Eagle Medium 1X) </td><td> GIBCO </td><td> 41966029 </td></tr><tr><td> Ouro de soro fetal bovino </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td></tr><tr><td> X-treme Gene 9 Reagente Transfection DNA </td><td> Roche </td><td&gt; 06365809001 </td></tr><tr><td> PBS Phosphate Buffered Saline Dulbecco 1X </td><td> GIBCO </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> MOPS 3 - (N-Morfolino) Propanesulfonic ácido </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Cicloheximida </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> C7698 </td></tr><tr><td> Tampão de Lise passiva 5X </td><td> Promega </td><td> E194A </td></tr><tr><td> Glycylglycin EGTA MgSO 4 (MgSO 4 * 7H 2 O) </td><td> SIGMA-ALDRICH Roth Roth </td><td> G7278 3054,2 P027.1 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 (K 2 HPO 4 * 3H 2 O) NaCl EDTA </td><td> Roth Roth Roth Roth </td><td> 3904,1 6878,2 3957,1 8043,1 </td></tr><tr><td> Luciferina Firefly </td><td> Biosynth </td><td> L8200 </td></tr><tr><td> Celenterazina </td><td> Biosynth </td><td> C7000 </td></tr><tr><td> DTT (Ditiotreitol) </td><td> Roth </td><td> 6908,2 </td></tr><tr><td> ATP (adenosina trifosfato) </td><td> Roche </td><td> 10519987001 </td></tr></table>

ensaio redobrando intracelular

Intracellular Refolding Assay

Este protocolo descreve um método para medir a atividade enzimática de chaperones moleculares em um sistema baseado em células e os possíveis efeitos de compostos com atividade inibitória / estimulante. Chaperones moleculares são proteínas envolvidas na regulação do enovelamento de proteínas 1 e têm um papel crucial na promoção da sobrevivência celular após insultos estresse, como choque térmico 2, a fome de nutrientes e exposição a produtos químicos / venenos 3. Por esta razão chaperones são encontrados para ser envolvido em eventos como o desenvolvimento do tumor, chemioresistance das células cancerosas 4, bem como neurodegeneração 5. Desenho de pequenas moléculas capazes de inibir ou estimular a atividade destas enzimas é, portanto, uma das estratégias mais estudadas para terapia de câncer e doenças neurodegenerativas 7 9. O ensaio aqui descrito oferece a possibilidade de medir a atividade refolding de um chaperone molecular particular e para estudar o efeito da compounds sobre a sua actividade. Neste método o gene da chaperone molecular investigado é transfectadas com uma codificação de vetor de expressão para o gene luciferase vaga-lumes. Já foi descrito que a luciferase firefly desnaturado podem ser reabertos por chaperones moleculares 10,11. Como normalizar o controle de transfecção, uma codificação de vetor para o gene luciferase é renilla transfectadas. Todos os transfections descritos neste protocolo são realizadas com X-treme Gene 11 (Roche) em células HEK-293. Na primeira etapa, a síntese protéica é inibida pelo tratamento das células com cicloheximida. Posteriormente proteína desdobramento é induzida por choque térmico a 45 ° C por 30 minutos. Após a recuperação, a 37 ° C, as proteínas são re-dobrada em sua conformação ativa e da atividade da luciferase firefly é usado como ler-out: quanto mais luz será produzido, o mais proteína terá re-ganhou a conformação original. Não-calor células chocado são definidos como referência (100% de refoldedluciferase).

Neste protocolo um método para medir refolding proteína intracelular após choque térmico é descrito. Este método pode ser usado para estudar foldases como chaperonas moleculares e seus co-fatores ou compostos capazes de influenciar a sua actividade. Firefly luciferase atividade é utilizado como repórter para medir a atividade refolding acompanhante.

Ensaio redobrando intracelular

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

O objetivo geral do experimento a seguir é medir a refoldagem intracelular de proteínas dependente de chaperonas após choque térmico. Utilizando um repórter de luciferase, transfete primeiro as células com plasmídeos contendo o gene repórter de luciferase e a chaperona de interesse. Em seguida, divida as células transfectadas para os pontos de tempo de recuperação no delineamento experimental.No dia seguinte, submeta as células a um choque térmico para induzir o desdobramento proteico. Permita um período de recuperação para restabelecer a refoldagem intracelular das proteínas e, em seguida, meça a atividade do repórter luciferase. Os resultados medem a refoldagem proteica dependente do tempo e de chaperonas, com base no ensaio de luciferase.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o ensaio de refoldagem in vitro, é a possibilidade de obter uma leitura fisiológica do efeito de compostos ou proteínas sobre a atividade de chaperonas. As implicações desta técnica estendem-se a terapias para uma ampla gama de doenças, como doenças neurodegenerativas ou câncer, porque as chaperonas desempenham um papel importante no desenvolvimento dessas patologias. Pri

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