Ensaio redobrando intracelular

O objetivo geral do experimento a seguir é medir a proteína intracelular dependente de chaperona, redobrando após choque térmico. Usando um repórter de luciferase, primeiro transfecte células com plasmídeos revestindo o gene repórter de luciferase e o acompanhante de interesse. Em seguida, divida as células transfectadas para pontos de tempo de recuperação no projeto experimental.

No dia seguinte, o calor choca as células para induzir o desdobramento da proteína. Permita que a recuperação recupere o dobramento da proteína intracelular e, em seguida, meça a atividade repórter da luciferase. Os resultados medem o redobramento de proteínas dependente do tempo e dependente da chaperona com base no ensaio de luciferase.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o ensaio de redobramento in vitro, é a possibilidade de ter uma leitura fisiológica do efeito de compostos ou proteínas na atividade da chaperona. As implicações desta técnica estendem-se a uma terapia de uma vasta gama de doenças como doenças neurodegenerativas ou cancro, porque as chaperonas desempenham um papel importante no desenvolvimento destas patologias. Primeiro, pré-aqueça o meio de cultura, PBS e tripsina a 37 graus Celsius em banho-maria.

Lave uma cultura confluente de células HEK 2 93 com cinco mililitros de PBS. Em seguida, aplique um mililitro de tripsina contendo 0,025% EDTA, gire suavemente a placa para uma distribuição uniforme da tripsina e incube a 37 graus Celsius. Agite periodicamente a placa para verificar o descolamento da célula.

Agora res suspende as células em 10 mililitros de meio DMEM completo e transfere para um tubo de falcão de 50 mililitros. Em seguida, enumere as células usando uma contraplaca de Beckman. As células em aproximadamente 60 a 70% de fluência e incubam por seis a oito horas.

Equilibre o gene extremo, nove reagentes à temperatura ambiente e a alíquota do meio livre sérico a 37 graus Celsius. Pipetar o meio livre de soro para dois tubos einor. Em seguida, adicione o reagente extremo do gene nove sem tocar na parede do tubo einor e incube por cinco minutos à temperatura ambiente.

Enquanto isso, prepare as misturas de transfecção 2D NA no tubo um, adicione vaga-lume de baunilha e um controle vetorial vazio no tubo dois. Adicione o vaga-lume de baunilha e a chaperona molecular. Adicione o DNA ao vórtice de mistura de reagentes de transfecção e incube em temperatura ambiente por 20 minutos.

Continue a adicionar esta mistura às células revestidas e incube por 24 horas. Colha as células transfectadas usando células de sementes de tripsina a 60 a 70% de fluência de co em placas de seis poços e deixe-as na incubadora durante a noite. Aspire o meio das células transfectadas.

Em seguida, adicione um mililitro de tampão de choque térmico e incube por 30 minutos. Para interromper a síntese de proteínas Denovo, sele as tampas com tiras paraformes e incube em banho-maria a 45 graus Celsius por 30 minutos. Agora remova a paraforma e coloque as células de volta na incubadora para recuperação em pontos de tempo especificados.

Colha as células e lave uma vez em PBS Para um estalo de lise celular eficiente, congele o pellet celular em nitrogênio líquido, adicione 200 microlitros de tampão de lise passiva diluído. Agora alíquota em triplicatas. 30 microlitros do lisado celular por poço de uma placa de 96 poços.

Para avaliar a eficiência da transfecção, comece com as amostras de referência não chocadas. Para medir a atividade da luciferase, prepare um lúcifer 0,2 milimolar fresco em tampão Gly Gly contendo um milimolar A TP e 0,2 tampão de reação ezina micromolar. Insira a placa de 96 poços no luminômetro e inicie o programa.

Estação de trabalho Wallach 1420. Introduza a bomba no tubo Falcon contendo tampão de reação ezine de 0.2 micromolar. Escolha no menu, a opção manutenção do dispensador e marque a bomba um.

Selecione a opção preencher para editar o layout da placa. Escolha a opção, explore o protocolo e os resultados no menu. Selecione o protocolo.

Agora selecione os poços a serem lidos. Volte para o gerenciador Wallach e clique em iniciar para medir as emissões da amostra. A 482 nanômetros, prossiga para a manutenção do dispensador e selecione esvaziar e bombear um para liberar toda a solução residual de volta ao tubo.

Agora mova o tubo para um falcão contendo água e marque, lave. Continue selecionando vazio. Em seguida, colocar o tubo da bomba um no tampão de reação e o tubo da bomba dois na solução LUCIFERIANA.

Altere o layout da placa. Selecione o preenchimento para a bomba um e a bomba dois. No menu de manutenção do dispensador, selecione o protocolo e comece a medir o comprimento de onda da reação de luciferase do vaga-lume de 560 nanômetros.

No final da repetição, repita o procedimento, vazio, lavado, vazio. Para a bomba um e a bomba dois, view os resultados no Wallach 1420 Explorer. Cada experimento está associado a um ensaio.

Numerar nome de usuário data de início e término resultados da exportação como um arquivo do Excel. Para análise, o redobramento de proteínas está diretamente relacionado ao tempo de recuperação. Neste experimento, as células são avaliadas em diferentes momentos após o choque térmico.

Na ausência e na presença de chaperona molecular. Como esperado, a porcentagem de luciferase redobrada aumenta com o tempo de recuperação prolongado em controles e células transfectadas com a chaperona molecular. Por outro lado, um conjunto de dados inválido exibe valores ruins de R ao quadrado para correlação entre tempo e redobramento.

Seguindo esta técnica, outros métodos, como o ensaio de TPAs in vitro, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a inibição da atividade enzimática da chaperona. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a proteína intracelular. Seguimos após o choque do engate.