Name: Diagnóstico da tuberculose pulmonar com o teste Xpert MTB / RIF (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprenda o teste Xpert MTB/RIF para diagnóstico rápido de tuberculose pulmonar e resistência à rifampicina em amostras de escarro. Este método utiliza PCR ultra-sensível para detecção em duas horas.

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Os autores agradecem a W. J. Looney pela revisão cuidadosa do manuscrito.

O padrão 2 das Normas Internacionais para o Tratamento da Tuberculose afirma que todos os pacientes suspeitos de ter tuberculose pulmonar devem fornecer pelo menos duas amostras de escarro para exame bacteriológico. Sempre que possível, pelo menos uma amostra matinal deve ser coletada, pois o escarro coletado nesse horário apresenta maior rendimento.11 O ensaio Xpert MTB/RIF pode ser aplicado a amostras de escarro ou sedimentos de escarro concentrados, preparados a partir de escarros induzidos ou espontâneos, sejam eles positivos ou negativos para bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) no exame direto.6, 12, 13 O ensaio destina-se ao uso com espécimes de pacientes com suspeita clínica de tuberculose pulmonar que: 1) não receberam terapia antituberculosa, 2) tiveram &lt; 7 dias de terapia, ou 3) não receberam terapia nos últimos 60 dias. Observe que ele não deve ser utilizado para monitorar os efeitos da terapia medicamentosa7, pois o DNA bacteriano pode persistir após o tratamento antimicrobiano.
Trate espécimes clínicos, incluindo cartuchos usados, como se fossem capazes de transmitir agentes infecciosos. Utilize precauções adequadas, como o uso de luvas descartáveis de proteção, jalecos laboratoriais e proteção ocular, e siga os procedimentos e diretrizes de segurança da sua instituição.
1. Amostras de Escarro Expectorado
Observação: Processe apenas tantos espécimes de cada vez quantos forem os módulos disponíveis no sistema GeneXpert Dx para executar o teste!
<ol>
 <li>Rotule cada cartucho Xpert MTB/RIF com o ID do espécime correspondente.</li>
 <li>Transfira 1,0 ml de escarro expectorado para um tubo cônico com tampa de rosca utilizando uma pipeta de transferência estéril. Alternativamente, todo o espécime pode ser processado no recipiente original de coleta de escarro à prova de vazamentos.</li>
 <li>Adicione 2,0 ml do Reagente para Amostra Xpert MTB/RIF (2:1; v/v) ao escarro expectorado utilizando uma pipeta de transferência estéril.</li>
 <li>Recoloque a tampa e agite vigorosamente o tubo de 10 a 20 vezes. Alternativamente, a mistura pode ser agitada em vórtex (30 segundos).</li>
 <li>Deixe o tubo em posição vertical por 5 minutos à temperatura ambiente.</li>
 <li>Agite vigorosamente o tubo de 10 a 20 vezes. Alternativamente, utilize um vórtex (30 segundos).</li>
 <li>Deixe o tubo em posição vertical por mais 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
 <li>Examine os espécimes: as amostras devem estar liquefeitas, sem grumos visíveis de escarro.</li>
</ol>
2. Sedimentos Concentrados
Observação: Processe apenas tantos espécimes de cada vez quantos forem os módulos disponíveis no sistema GeneXpert Dx para executar os testes!
<ol>
 <li>Rotule cada cartucho Xpert MTB/RIF com o ID correspondente da amostra.</li>
 <li>Transfira 1,5 ml do Reagente para Amostra Xpert MTB/RIF para um tubo cônico com tampa de rosca, utilizando uma pipeta de transferência estéril.</li>
 <li>Adicione pelo menos 0,5 ml do sedimento concentrado ao tubo contendo o Reagente para Amostra, utilizando uma pipeta de transferência estéril.</li>
 <li>Recoloque a tampa e agite vigorosamente o tubo de 10 a 20 vezes. Alternativamente, utilize um vórtex (30 segundos).</li>
 <li>Deixe o tubo em posição vertical por 5 minutos à temperatura ambiente.</li>
 <li>Agite vigorosamente o tubo de 10 a 20 vezes. Alternativamente, utilize um vórtex (30 segundos).</li>
 <li>Deixe o tubo em posição vertical por mais 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
 <li>Inspeccione as amostras: os espécimes devem estar liquefeitos, sem grumos visíveis de escarro.</li>
</ol>
3. Carregamento do Cartucho Xpert MTB/RIF
Observação: Inicie o teste dentro de 30 minutos após adicionar a amostra à cartela!
<ol>
 <li>Verifique as etiquetas no cartucho Xpert MTB/RIF e no ID da amostra.</li>
 <li>Abra a tampa do cartucho.</li>
 <li>Usando a pipeta de transferência estéril fornecida, aspire a amostra liquefeita para dentro da pipeta até que o menisco esteja acima da marca mínima e transfira a amostra para a abertura aberta do cartucho Xpert MTB/RIF.</li>
</ol>
Observação: Dispense lentamente para minimizar o risco de formação de aerossóis!
<ol start="4">
 <li>Feche a tampa do cartucho.</li>
</ol>
4. Iniciando o Teste
Observação: Antes de iniciar o teste, certifique-se de que o sistema GeneXpert Dx esteja equipado com o software GX2.1 e de que o ensaio Xpert MTB/RIF tenha sido importado para o software! 9
<ol>
 <li>Ligue o computador e, em seguida, ligue o instrumento GeneXpert Dx.</li>
 <li>No desktop do Windows, clique duas vezes no ícone de atalho do GeneXpert Dx.</li>
 <li>Faça login no software do Sistema GeneXpert Dx utilizando seu nome de usuário e senha.</li>
 <li>Na janela do Sistema GeneXpert Dx, clique em Criar Teste. A caixa de diálogo Ler Código de Barras do Cartucho aparece.</li>
 <li>No campo ID da Amostra, leia ou digite o ID da amostra.</li>
 <li>Leia o código de barras do cartucho Xpert MTB/RIF. A janela Criar Teste aparece.</li>
 <li>Clique em Iniciar Teste e insira sua senha na caixa de diálogo que aparece.</li>
 <li>Abra a porta do módulo do instrumento com a luz verde piscando e insira o cartucho.</li>
 <li>Feche a porta. O teste é iniciado e a luz deixa de piscar, permanecendo constantemente verde. Quando o teste for concluído, a luz se apaga.</li>
 <li>Aguarde até que o sistema libere o travamento da porta ao final do processo, abra a porta do módulo e remova o cartucho.</li>
 <li>Descarte os cartuchos usados nos recipientes apropriados para resíduos, de acordo com as práticas-padrão da sua instituição.</li>
</ol>
5. Resultados Representativos
Cada cartucho Xpert MTB/RIF inclui reagentes para a detecção do complexo MTB e da resistência à RIF, bem como um controle de processamento da amostra (SPC) para verificar o processamento adequado da bactéria-alvo e monitorar a presença de inibidor(es) na reação de PCR. O controle de verificação da sonda (PCC) confirma a reidratação dos reagentes, o preenchimento do tubo de PCR no cartucho, a integridade da sonda e a estabilidade do corante.9 Os iniciadores no ensaio Xpert MTB/RIF amplificam uma porção do gene rpoB que contém a região "central" de 81 pares de bases. Cinco sondas de hibridização de ácidos nucleicos fluorogênicas com cores diferentes, denominadas balizas moleculares, analisam toda a região central de 81 pb.14 Cada baliza molecular foi projetada para ser tão específica que não se liga ao seu alvo se a sequência-alvo diferir da sequência selvagem de rpoB por apenas uma substituição de nucleotídeo. Como as balizas moleculares emitem fluorescência apenas quando ligadas aos seus alvos, ou seja, à sequência selvagem de rpoB, a ausência de qualquer uma das cinco cores no ensaio diferencia a sequência conservada selvagem das mutações na região central associadas à resistência à RIF.6
O CPS deve ser positivo em uma amostra negativa e pode ser negativo ou positivo em uma amostra positiva. O resultado do teste será "Inválido" se o CPS não for detectado em um teste negativo. Antes do início da reação de PCR, o sistema GeneXpert Dx mede o sinal de fluorescência dos sondas para monitorar a reidratação das microesferas, o preenchimento do tubo de reação, a integridade das sondas e a estabilidade do corante. O CPS é aprovado se o sinal de fluorescência das sondas atender aos critérios de aceitação atribuídos. Os resultados são interpretados pelo sistema GeneXpert Dx a partir dos sinais de fluorescência medidos e de algoritmos de cálculo embutidos e são exibidos na janela Visualizar Resultados9, conforme indicado abaixo:
MTB Detectado: O DNA alvo do MTB é detectado; ambos os controles, SPC e PCC, atendem aos critérios de aceitação estabelecidos. Valores de Ct mais baixos representam uma concentração inicial mais alta de molde de DNA; valores de Ct mais altos representam uma concentração mais baixa de molde de DNA. Nos resultados de MTB DETECTADO, "RESISTÊNCIA À RIFAMPICINA DETECTADA" (Figura 1A), "RESISTÊNCIA À RIFAMPICINA NÃO DETECTADA" (Figura 1B) ou "RESISTÊNCIA À RIFAMPICINA INDETERMINADA" serão exibidos em uma linha separada.
MTB Não Detectado: O DNA alvo de MTB não é detectado; ambas as controles, SPC e PCC, atendem aos critérios de aceitação estabelecidos (Figura 2).
Inválido: A presença ou ausência de MTB não pode ser determinada: o controle de processo de amostra (SPC) não atende aos critérios de aceitação, ou seja, a amostra não foi adequadamente processada ou houve inibição da PCR (Figura 3). Observação: repetir o teste com espécime adicional!
Erro: Um ou mais dos resultados do PCC falharam (FAIL). Tanto o MTB quanto o SPC exibem NENHUM RESULTADO. Observação: repetir o teste com espécime adicional! Se o PCC for aprovado (PASS), o erro é causado por uma falha em um componente do sistema.
Figura 1: O DNA alvo de MTB é detectado; ambos os controles, SPC e PCC, atendem aos critérios de aceitação atribuídos. Valores de Ct mais baixos representam uma concentração inicial mais alta do molde de DNA; valores de Ct mais altos representam uma concentração mais baixa do molde de DNA. Nos resultados de MTB DETECTADO, "RESISTÊNCIA À RIFAMPICINA NÃO DETECTADA" (Figura 1A), "RESISTÊNCIA À RIFAMPICINA DETECTADA" (Figura 1B) ou "RESISTÊNCIA À RIFAMPICINA INDETERMINADA" serão exibidos em uma linha separada.
<img alt="Interface do sistema GeneXpert mostrando resultados diagnósticos de MTB e curvas primárias de fluorescência." src="/files/ftp_upload/3547/3547fig1A.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figura 1A"> 
Figura 1A. MTB DETECTADO; Resistência à RIF NÃO DETECTADA, ou seja, apenas a sequência de ácido nucleico selvagem da região determinante de resistência à RIF (RRDR) de 81 pb do gene rpoB estava presente.6 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig1A.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar a figura em tamanho maior</a>.
<img alt="Interface do software diagnóstico GeneXpert; gráfico de análise de PCR; resultados da detecção de MTB/RIF." src="/files/ftp_upload/3547/3547fig1B.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1B"> 
Figura 1B. MTB DETECTADO; RESISTÊNCIA À RIF DETECTADA. Queda completa da sonda B (seta), que cobre as posições 513 a 517 da RRDR do gene rpoB.6 No exemplo, o sequenciamento parcial revelou que foi detectada a mutação D516V no gene rpoB.8 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig1Blarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar a figura em tamanho maior</a>.
<img alt="Interface do sistema GeneXpert Dx, resultado do ensaio Xpert MTB-RIF, gráfico de PCR mostrando ciclo de detecção de MTB." src="/files/ftp_upload/3547/3547fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. O DNA alvo de MTB não foi detectado; ambos os controles, SPC e PCC, atendem aos critérios de aceitação estabelecidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar a figura em tamanho maior</a>.
<img alt="Interface do sistema GeneXpert Dx; diagrama de análise de PCR com dados de fluorescência nos resultados do teste." src="/files/ftp_upload/3547/3547fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figura 3"> 
Figura 3. Resultado de teste inválido, ou seja, a presença ou ausência de MTB não pode ser determinada: o controle de processo de amostra (SPC) não atende aos critérios de aceitação, porque a amostra não foi adequadamente processada ou porque a PCR foi inibida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar a figura em tamanho maior</a>.

<ol><li>Sudre, P., Dam, ten, Chan, G., C,, Kochi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculosis+in+the+present+time%3A+a+global+overview+of+the+tuberculosis+situation%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organisation+Document+WHO%2FTUB%2F91%22%5BJournal%5D)">Tuberculosis in the present time: a global overview of the tuberculosis situation.</a> World Health Organisation Document WHO/TUB/91. 158, 1-47 (1991).</li>
<li>World Health Organisation. Global tuberculosis control: epidemiology, strategy, financing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO+report+2010%22">WHO report 2010</a>. , (2010).</li>
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<li>Morris, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+multiple+drug+resistance+in+clinical+isolates+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of multiple drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Infect. Dis. 171, 954-960 (1995).</li>
<li>Traore, H., Fissette, K., Bastian, I., Devleeschouwer, M., Portaels, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+rifampicin+resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis+isolates+from+diverse+countries+by+a+commercial+line+probe+assay+as+aninitial+indicator+of+multidrug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Tuberc.+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">Detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from diverse countries by a commercial line probe assay as aninitial indicator of multidrug resistance.</a> Int. J. Tuberc. Lung Dis. 4, 481-484 (2000).</li>
<li>Helb, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+and+Rifampin+Resistance+by+Use+of+On-Demand+Near-Patient+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis and Rifampin Resistance by Use of On-Demand Near-Patient Technology.</a> J. Clin. Microbiol. 48, 229-237 (2010).</li>
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<li>Telenti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+rifampicin-resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Detection of rifampicin-resistance in Mycobacterium tuberculosis.</a> Lancet. 341, 647-650 (1993).</li>
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<li>Foundation for new innovative diagnostics [Internet]. , Geneva, Switzerland. Available from: 
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<li>Boehme, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Molecular+Detection+of+Tuberculosis+and+Rifampin+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid Molecular Detection of Tuberculosis and Rifampin Resistance.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).</li>
<li>Marlowe, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Cepheid+Xpert+MTB%2FRIF+assay+for+the+Direct+Detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+Complex+from+Respiratory+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Cepheid Xpert MTB/RIF assay for the Direct Detection of Mycobacterium tuberculosis Complex from Respiratory Specimens.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 1621-1623 (2011).</li>
<li>El-Hajj, H. H., Marras, S. A. M., Tyagi, S., Kramer, F. R., Alland, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+rifampin+resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis+in+a+single+tube+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis in a single tube with molecular beacons.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 4131-4137 (2001).</li>
<li>Hillemann, D., Ruesch-Gerdes, S., Boehme, C., Richter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+molecular+detection+of+extrapulmonary+tuberculosis+by+automated+GeneXpert+MTB%2FRIF+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid molecular detection of extrapulmonary tuberculosis by automated GeneXpert MTB/RIF system.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 1202-1205 (2011).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesses declarado.

O ensaio Xpert MTB/RIF integra descontaminação da amostra, operação sem contato manual, processamento automático da amostra e PCR hemi-aninhada ultra-sensível para a detecção simultânea de MTB e resistência à RIF, seja em escarro expelido ou em sedimentos concentrados, em um único sistema de fácil utilização. O limite analítico de detecção do ensaio foi determinado em 131 UFC/ml de escarro.6 A relação log-linear entre os valores de Ct e o número de células de MTB presentes é válida de 102 a 107 UFC/ml de escarro. Como as concentrações clínica relevantes de MTB estão todas dentro da faixa linear do ensaio, este fornece estimativas semi-quantitativas da carga bacteriana.7 O ensaio exige apenas infraestrutura laboratorial moderada e treinamento básico. O limite de detecção é pelo menos duas ordens de magnitude inferior ao da microscopia convencional.6 A especificidade é excelente. Além disso, a detecção simultânea de MTB resistente à RIF representa uma vantagem significativa no contexto de testes realizados no local de atendimento, na era da tuberculose resistente a medicamentos.3
Até o momento, existem apenas dados publicados limitados sobre o desempenho do ensaio no diagnóstico da tuberculose pulmonar em ambientes clínicos.12; 13 A sensibilidade clínica geral do ensaio Xpert MTB/RIF na detecção de MTB em escarro de pacientes com suspeita de tuberculose pulmonar foi de 97,6% quando comparada à cultura como referência. Esses foram os resultados de um estudo prospectivo multicêntrico que envolveu cinco locais de pesquisa (Lima, Peru; Baku, Azerbaijão; Cidade do Cabo e Durban, África do Sul; Mumbai, Índia) e um total de 1462 pacientes. A probabilidade pré-teste geral de tuberculose confirmada por cultura na população estudada foi de 50,7%. A sensibilidade foi de 99,8% para casos positivos ao baciloscópico e à cultura e de 90,2% para casos negativos ao baciloscópico, mas positivos à cultura. Entre pacientes HIV-positivos com tuberculose pulmonar, a sensibilidade do teste MTB/RIF foi de 93,9%, comparada a 98,4% em pacientes HIV-negativos.12 Em um contexto de baixa prevalência de tuberculose, a concordância geral para detecção de MTB foi de 89% quando comparada à cultura; a sensibilidade foi de 98% para espécimes positivos ao baciloscópico e de 72% para espécimes negativos ao baciloscópico, respectivamente, e a especificidade foi excelente.13 Não houve diferença significativa na sensibilidade entre testes realizados em escarro não tratado e em sedimentos concentrados.12 No mesmo estudo, o teste MTB/RIF detectou corretamente a resistência à RIF em 209 dos 211 pacientes (sensibilidade de 99,1%) e em todos os 506 pacientes com suscetibilidade à RIF (especificidade de 100%), levando-se em conta os resultados do sequenciamento.12 Os autores constataram que o desempenho tanto na detecção de casos quanto na discriminação da resistência à RIF foi semelhante em diferentes locais, sugerindo que os achados provavelmente sejam amplamente aplicáveis.12 Além disso, sedimentos concentrados de espécimes respiratórios diferentes do escarro, como lavado broncoalveolar e secreções brônquicas, foram testados com sensibilidade e especificidade comparáveis.13 Dados sobre o desempenho do ensaio no diagnóstico da tuberculose extrapulmonar estão surgindo.15
O controle global da tuberculose precisa urgentemente de ferramentas eficazes que permitam o diagnóstico rápido de novos casos de TB e a detecção de MTB resistente à RIF em ambientes universais de atendimento na atenção básica.3 Os métodos atuais de amplificação de ácidos nucleicos utilizados para detectar MTB são complexos, trabalhosos e tecnicamente exigentes. O ensaio Xpert MTB/RIF tem o potencial de levar testes diagnósticos padronizados, sensíveis e altamente específicos para tuberculose e resistência a medicamentos a esses ambientes, desde que possam arcar com os custos. Para facilitar o acesso, a Fundação para Diagnósticos Inovadores (FIND) negociou reduções significativas de preço para o teste Xpert MTB/RIF. Os preços atuais negociados pela FIND, juntamente com a lista de países elegíveis para os descontos, estão disponíveis na web.10

<table><tbody><tr><td>Teste Xpert MTB/RIF</td><td>Cepheid</td><td>GXMTB/RIF-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>86.1172.001</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos, 15 ml, 120 x 17 mm, PS</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>62.553.542</td><td></td></tr></tbody></table>

diagnóstico da tuberculose pulmonar com o teste xpert mtb / rif

Diagnosing Pulmonary Tuberculosis with the Xpert MTB/RIF Test

A tuberculose (TB) causada por Mycobacterium tuberculosis (MTB) continua sendo um importante problema de saúde pública: a infecção afeta até um terço da população mundial1, e quase dois milhões de pessoas morrem de TB a cada ano.2 O acesso universal a um tratamento de alta qualidade centrado no paciente para todos os pacientes com TB é enfatizado pela Estratégia da OMS para Erradicação da TB.3 A detecção rápida de MTB em espécimes respiratórios e a terapia medicamentosa baseada em resultados confiáveis de testes de resistência a medicamentos são pré-requisitos para a implementação bem-sucedida dessa estratégia. No entanto, em muitas regiões do mundo, o diagnóstico da TB ainda depende de métodos de microscopia de escarro insensíveis e pouco padronizados. A detecção ineficaz da TB e o surgimento e a transmissão de cepas de MTB resistentes a medicamentos colocam cada vez mais em risco as atividades globais de controle da TB.2
O diagnóstico eficaz da tuberculose pulmonar exige a disponibilidade em escala global de ferramentas diagnósticas padronizadas, fáceis de usar e robustas, que permitam a detecção direta do complexo MTB e da resistência a antibióticos-chave, como a rifampicina (RIF). Esse último resultado pode servir como marcador para o MTB multirresistente (TB-MR) e tem sido relatado em &gt; 95% dos isolados de TB-MR.4, 5 A disponibilidade rápida de resultados confiáveis de testes provavelmente se traduzirá diretamente em decisões sólidas de manejo do paciente que, em última instância, curarão o paciente individual e interromperão a cadeia de transmissão da tuberculose na comunidade.2
O ensaio Xpert MTB/RIF da Cepheid (Sunnyvale, CA, EUA)6, 7 atende de forma notável às exigências descritas acima. Trata-se de um teste de amplificação de ácidos nucleicos para: 1) a detecção do DNA do complexo MTB em escarro ou sedimentos de escarro concentrado; e 2) a detecção de mutações associadas à resistência à RIF no gene rpoB8. Foi projetado para uso com o sistema GeneXpert Dx da Cepheid, que integra e automatiza o processamento de amostras, amplificação de ácidos nucleicos e detecção de sequências-alvo por meio de PCR em tempo real e PCR com transcriptase reversa. O sistema é composto por um instrumento, um computador pessoal, um leitor de código de barras e um software pré-carregado para execução dos testes e visualização dos resultados9. Utiliza cartuchos descartáveis de uso único Xpert MTB/RIF, que contêm os reagentes de PCR e onde ocorre o processo de PCR. Como os cartuchos são autossuficientes, a contaminação cruzada entre amostras é eliminada6. Os métodos atuais de amplificação de ácidos nucleicos utilizados para detectar MTB são complexos, trabalhosos e tecnicamente exigentes. O ensaio Xpert MTB/RIF tem o potencial de levar testes diagnósticos padronizados, sensíveis e altamente específicos para tuberculose e resistência a medicamentos a ambientes universais de atendimento à beira do leito3, desde que esses locais possam arcar com seu custo. Para facilitar o acesso, a Fundação para Diagnósticos Inovadores (FIND) negociou reduções significativas de preço. Os preços atuais negociados pela FIND, juntamente com a lista de países elegíveis para os descontos, estão disponíveis na web10.

O teste Xpert MTB/RIF integra descontaminação da amostra, operação sem contato manual, processamento da amostra em tempo real e PCR hemi-aninhada ultra-sensível para a detecção simultânea de Mycobacterium tuberculosis e resistência à rifampicina, seja em escarro expelido ou em sedimentos de escarro concentrados, em aproximadamente duas horas. O teste é padronizado e requer apenas infraestrutura laboratorial moderada e treinamento.

Diagnóstico da tuberculose pulmonar com o teste Xpert MTB / RIF

A tuberculose (TB), causada pelo Mycobacterium tuberculosis (MTB), continua a ser um problema grave de saúde pública: a infeção afeta até um terço da população mundial...

O objetivo geral deste procedimento é detectar simultaneamente, em até duas horas, micobactérias, tuberculose e resistência à rifampicina em escarro expelido ou em sedimentos de escarro concentrado. Inicie com um protocolo simples e altamente eficaz de descontaminação da amostra. Em seguida, transfira cada amostra processada para um cartucho descartável de uso único, denominado M-T-B-R-I-F, que contém reagentes para PCR e onde ocorre o processo de PCR.Carregue as cartuchas em um sistema Gene Expert DX e inicie a PCR aninhada ultra sensível HEMI para a detecção simultânea de Mycobacterium tuberculosis e resistência à rifampicina. Por fim, leia os resultados do teste e os comunique ao médico. O ensaio Expert MTPR destina-se ao uso com espécimes de pacientes com suspeita clínica de tuberculose pulmonar e que atendam aos critérios descritos no texto da companhia.Observe que não deve ser utilizado para monitorar os efeitos da terapia medicamentosa. Crystal. Um técnico do meu laboratório demonstrará agora o protocolo conforme o padrão dois das normas internacionais para o tratamento da tuberculose. Colete dois espécimes para exame bacteriológico de cada paciente suspeito de ter tuberculose pulmonar.Atribua um módulo do sistema Gene Expert DX para cada espécime-teste, identificando cada cartucho pelo ID do espécime. Em seguida, para cada ensaio de amostra, transfira um mililitro de escarro para um tubo cônico de 15 mililitros com tampa de rosca, utilizando outra pipeta estéril de transferência. Adicione dois mililitros do reagente de amostra M-T-B-R-I-F.Troque a tampa com vigor. Agite o tubo de 10 a 20 vezes. Em seguida, mantenha o tubo em posição vertical por cinco minutos à temperatura ambiente após agitá-lo vigorosamente.Novamente, equilibre à temperatura ambiente por 10 minutos. Verifique se todas as amostras estão ED, sem grumos visíveis de escarro. Primeiro, rotule os cartuchos com o ID da amostra de cada sedimento de escarro; para cada amostra de sedimento, adicione 1,5 mililitros do reagente para amostra M-T-B-R-I-F e transfira 0,5 mililitros para um tubo cônico de 15 mililitros com tampa de rosca. Substitua a tampa, vortex por 30 segundos e coloque o tubo em posição vertical por cinco minutos após um segundo.Agite por vórtex e mantenha o tubo em posição vertical por 10 minutos. Inspecione as amostras liquefeitas para verificar a ausência de grumos de escarro. Compare o rótulo dos tubos com os cartuchos correspondentes.Não abra o cartucho até que esteja pronto para realizar o teste e utilize o cartucho dentro de 30 minutos após abrir a tampa. Usando a pipeta estéril de transferência, aspire a amostra liquefeita até que o menisco esteja acima da marca mínima. Carregue a amostra lentamente no cartucho.Feche a tampa do cartucho. Inicie o teste dentro de 30 minutos após adicionar a amostra ao cartucho. Primeiro ligue o computador e depois o instrumento na bancada.Duplique o clique no ícone do Gene Expert DX. Faça login no software do sistema. Selecione criar teste para abrir a caixa de diálogo de leitura do código de barras da cartela.Em seguida, digite o ID da amostra e escaneie o código de barras no cartucho. Quando a janela de criação do teste aparecer, clique em iniciar teste e insira a senha na caixa de diálogo. Agora, abra a porta do módulo do instrumento e carregue o cartucho.Feche a porta para iniciar o teste. Quando a luz verde se apagar, o teste estará concluído. Assim que o sistema liberar o travamento da porta, abra a porta do módulo e remova a cartucho.Por fim, descarte os cartuchos usados nos recipientes apropriados para resíduos. Cada cartucho de teste inclui reagentes para a PCR em tempo real do complexo Mycobacterium tuberculosis e resistência à rifampicina, bem como os controles experimentais apropriados. O controle de verificação da sonda verifica a reidratação dos reagentes, o preenchimento do tubo de PCR no cartucho, a integridade da sonda e a estabilidade do corante.A curva de processamento da amostra serve como controle positivo para um processamento adequado das bactérias-alvo e também indica a presença de quaisquer inibidores de PCR. Os iniciadores são projetados para diferenciar entre a sequência selvagem conservada e mutações na região central do gene RPOB associadas à resistência à RIF. Os valores de CT são inversamente proporcionais à concentração do molde de M-T-B-D-N-A-alvo na amostra em teste.A caixa de diálogo do resultado do teste conclui que o DNA alvo de MTB foi detectado e que a resistência à RIF não foi detectada nesta amostra do paciente. O DNA alvo de MTB foi detectado em níveis baixos, com indicação de resistência à rifampicina. Ambos os controles SPC e PCC atendem aos critérios de aceitação estabelecidos.Este resultado do ensaio é considerado inválido, pois o controle positivo de amplificação (SPC) é negativo e não há produtos de PCR. Ocorreu falha no processamento da amostra ou houve inibição da PCR. Repita o ensaio.Como você viu no teste em vídeo, o método é padronizado e requer apenas infraestrutura laboratorial moderada e treinamento. Portanto, acredito que o ensaio especializado M-T-B-R-F tem o potencial de levar testes diagnósticos padronizados, sensíveis e altamente específicos para tuberculose e resistência à rifampicina a ambientes universais de atendimento primário.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A observação microscópica de drogas susceptibilidade-ensaio (MODS) é uma low-cost, low-tech ferramenta de alto desempenho para detecção de tuberculose (TB) e tuberculose multirresistente (TBMR). Este vídeo descreve o MODS líquido método de cultura de mídia.

O método MODS para o diagnóstico da tuberculose e da tuberculose resistente a múltiplas drogas

Testes de susceptibilidade antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis é um desafio, mas fundamental para o atendimento ao paciente. Este formato de placa de microtitulação oferece testes de 12 drogas antimicobacterianos e fornece concentração inibitória mínima (MIC) valores, o que ajudará no tratamento adequado.

Teste de susceptibilidade antimicrobiana do complexo Mycobacterium tuberculosis da Droga primeira e segunda linha de diluição em caldo em um formato de placa de microtitulação

Este vídeo demonstra uma técnica para a detecção de tuberculose extrapulmonar. Nanossondas superparamagnéticas de óxido de ferro (SPIO), conjugadas a anticorpos específicos para Mycobacterium, são injetadas em um camundongo previamente infectado com Mycobacterium bovis BCG, marcando o granuloma e proporcionando um melhor contraste de imagem para sua detecção.

Uma técnica para detectar tuberculose extrapulmonar por meio de nanossondas superparamagnéticas

Um microarray amplificação combina assimétrica PCR amplificação e hibridização microarray em uma única câmara, que simplifica significativamente o fluxo de trabalho microarray para o usuário final. Simplificar o fluxo de trabalho microarray é um primeiro passo necessário para a criação de diagnósticos à base de microarray que podem ser rotineiramente usados ​​em ambientes com recursos mais baixos.

Demonstrando um multi-resistente<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Ampliação Microarray

Para melhorar os testes diagnósticos sorológicos para antígenos de tuberculose mycobacterium, desenvolvemos nanoprobes de óxido de ferro superparamagnético para detectar tuberculose extrapulmonar.

Síntese, Caracterização e Aplicação de Nanoprobes superparamagnéticos de óxido de ferro para detecção de tuberculose extrapulmonar

Descrevemos um teste de ensaio de carga bacteriana molecular de tuberculose realizado após a inativação do calor da escória. A inativação do calor torna as amostras de espelo não infecciosas e evita a necessidade de laboratórios de nível de contenção 3 para testes moleculares de tuberculose.

Um ensaio de carga bacteriana molecular de tuberculose (TB-MBLA)

Apresentamos um método otimizado para extração de DNA de escarro descontaminado usando um método de extração baseado em matriz combinado com uma purificação de esferas magnéticas para sequenciamento de próxima geração direcionado a jusante de Mycobacterium tuberculosis.

Extração de DNA baseada em matriz para sequenciamento de próxima geração direcionado em amostras de escarro descontaminadas

Mycobacterium tuberculosis forma biofilmes de drogas tolerantes quando cultivadas em certas condições. Aqui descrevemos métodos para cultura de M. biofilmes de tuberculose e que determinam a freqüência de persistentes drogas tolerantes. Estes protocolos serão úteis para estudos posteriores sobre os mecanismos de tolerância à droga em M. tuberculose.

Crescimento de Mycobacterium tuberculosis Biofilmes

Um protocolo específico e rápido para pesquisar, simultaneamente, a função cardíaca direita, inflamação pulmonar, e da resposta imunológica é descrito como uma ferramenta de aprendizagem. Vídeo e figuras descrevem fisiologia e técnicas de microdissecção em um grupo organizado abordagem, que é adaptável a ser utilizado para as pequenas e grandes estudos porte.

Sistólica do ventrículo direito Medição de Pressão em combinação com colheita de amostras de tecido pulmonar e imunológica em ratos

Tuberculose e malária são duas das infecções mais prevalentes em seres humanos e as principais causas de morbidade e mortalidade em populações empobrecidas nos trópicos. Nós estabelecemos um sistema de modelo experimental para estudar resultado de malária tuberculose co-infecção em camundongos após o desafio com ambos os patógenos através de sua rota natural de infecção.

Um modelo experimental para estudar a Tuberculose-Malária Coinfection sobre Transmissão Natural de Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Aprenda o teste Xpert MTB/RIF para diagnóstico rápido de tuberculose pulmonar e resistência à rifampicina em amostras de escarro. Este método utiliza PCR ultra-sensível para detecção em duas horas.

Diagnóstico da tuberculose pulmonar com o teste Xpert MTB / RIF

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