Detecção e isolamento de células de melanoma circulantes usando Fluxometria Fotoacústica

O objetivo do experimento a seguir é detectar a presença de câncer antes da formação de tumores secundários. Isso é conseguido primeiramente obtendo e separando amostras de sangue de pacientes com melanoma em estágio quatro. Como segundo passo, o sangue é introduzido em uma câmara de fluxo fotoacústica, o que permite a detecção e o isolamento de células de melanoma.

Em seguida, as células capturadas são submetidas à imagem para confirmar a presença de melanoma detectado. Os resultados demonstram a capacidade do sistema em detectar e isolar células de melanoma com precisão e rapidez, com base nas formas de onda fotoacústicas e nas técnicas de imagem celular. A principal vantagem do nosso método em comparação com métodos existentes de detecção de células de melanoma circulantes, como R-T-P-C-R, biomes Magnetic Cell Sorting e outros métodos, é que o nosso método é livre de marcadores e permite a captura de células de melanoma circulantes sem alterar sua superfície ou fixá-las a um substrato.

Para preparar uma amostra para a detecção de câncer metastático, comece coletando aproximadamente 10 mililitros de sangue total de um paciente com câncer em estágio quatro. Em dois tubos vacutainer de cinco mililitros, centrifugue as amostras por 10 minutos a 3000 RPM. A amostra de sangue se separará em três camadas distintas. A camada inferior é composta pelos eritrócitos.

A camada intermediária, também chamada de camada de buffy coat, contém leucócitos e células de melanoma, e a camada superior contém plasma e plaquetas. Remova o máximo de plasma possível sem perturbar o buffy coat. Adicione 250 microlitros de his opaco 10 77 a tubos de 2 mililitros.

Utilizando uma pipeta de pastel de nove polegadas, extraia o plasma remanescente, todo o coágulo de buffy coat e a camada superior de eritrócitos, certificando-se de coletar menos de 500 microlitros. Transfira a solução para os tubos wind Trobe previamente preparados.

O sangue irá separar novamente, mas desta vez os eritrócitos serão separados pelo hispa, permitindo a extração fácil da camada de buffy coat. Use uma pipeta Pesa de nove polegadas para isolar todo o buffy coat e coloque-o em um tubo eppendorf de dois mililitros. Em seguida, suspenda-o em 1,5 mililitro de PBS com 2% volume por volume entre 20.

Para construir uma câmara de fluxo, comece com um cilindro de acrílico de oito milímetros de comprimento, com diâmetro externo de 20 milímetros e diâmetro interno de 17 milímetros. Em seguida, faça três furos de cinco milímetros de diâmetro através da lateral do cilindro, em ângulos de 90 graus entre si. Depois, corte três pedaços de tubo polimérico e insira-os nos furos feitos.

Estique o filme para- para cobrir a parte inferior do anel de acrílico, formando um selo impermeável. O filme para- formará uma espécie de bacia rasa com o anel de acrílico e conterá a solução de acrilamida que formará a câmara de fluxo. Suspenda um fio com diâmetro de 1,6 milímetro através das peças de tubo diretamente opostas uma à outra, certificando-se de que apenas o fio seja visível pelo centro do anel e dentro da terceira peça de tubo.

Insira um fio com diâmetro de 1,6 milímetro e posicione o tubo a um milímetro de distância do fio suspenso. Esses fios impedem que a acrilamida entre nos tubos. Prepare cinco mililitros de acrilamida.

Em seguida, despeje rapidamente a mistura no anel de acrílico, preenchendo-o até o topo. Após alguns segundos, a solução formará um gel. Para fabricar um molde de câmara de fluxo, retire cuidadosamente os fios, certificando-se de não perturbar o gel de acrilamida, deixando um caminho de fluxo cilíndrico e um local para posicionar uma fibra óptica focalizada sobre o caminho de fluxo.

A câmara de fluxo agora está pronta para uso com gel de ultrassom acusticamente. Acople um transdutor acústico piezoelétrico de fluoreto de polivinilideno a uma câmara de fluxo diretamente acima do caminho de fluxo. Usando um cabo bayonet neo cons ou BNC, conecte o transdutor à entrada de um receptor de banda larga.

Conecte a saída do filtro ao osciloscópio para disparar o equipamento. Posicione um fotodiodo próximo ao transdutor e utilize um cabo B NNC para conectá-lo ao osciloscópio. Retire o tubo pequeno da câmara de fluxo até que se forme um pequeno bolha de ar e acople-o ao transdutor.

Em seguida, insira a fibra óptica e preencha o compartimento com água para reduzir os sinais de interface e aumentar a quantidade de luz laser aplicada ao percurso de fluxo. Devido à abertura numérica da fibra óptica e à curta distância até o percurso de fluxo, o laser irradiará apenas um segmento da amostra por vez, garantindo que a amostra diretamente à frente do laser seja a mesma que gera os sinais fotoacústicos.

Em seguida, conecte um conector em T a um braço da câmara de fluxo e dois bombas de seringa aos outros ramos do conector. Uma seringa contém ar, enquanto a outra conterá a suspensão celular previamente preparada. Em seguida, inicie ambas as bombas de seringa.

Quando os dois fluidos admissíveis atingirem a junção em T, eles serão particionados em glóbulos homogêneos e fluirão passando pelo transdutor. Irradie a amostra em fluxo com um laser de pulso nanossegundo para gerar ondas fotoacústicas nas células de melanoma. Como a melanina é um absorvedor óptico de banda larga, qualquer comprimento de onda de laser visível pode ser utilizado.

Um sinal que aparece no osciloscópio quando um coágulo está sobre o transdutor indica que o coágulo contém melanoma. Acompanhe-o pelo sistema antes de depositá-lo em um frasco de coleta. Para preparar amostras para imunocitoquímica, coloque lâminas de vidro nos funis citológicos e carregue-os na citocentrífuga para centrifugação, a fim de ajudar as células capturadas a aderirem às lâminas de vidro.

Coloque 100 microlitros de BSA 1% em PBS em cada funil. Em seguida, centrifugue a 600 RPM por três minutos. Após a centrifugação, adicione as amostras celulares aos funis do CyTOF e, então, centrifugue a 600 RPM por três minutos.

Pulverize as lâminas com um fixador à base de etanol. Em seguida, lave as lâminas em PBS por 10 minutos, duas vezes, para bloquear a ligação não específica. Incube cada lâmina com uma mistura de 10 microlitros de soro de cabra e 90 microlitros de PBS por uma hora à temperatura ambiente.

Após a incubação, despreze o líquido das lâminas e adicione a solução de anticorpo primário. Cada lâmina deve conter 1% de anticorpo de coelho, 1% de anticorpo de rato anti-CD45 e 10% de soro de cabra em PBS, e deve ser incubada por uma hora em câmara umidificada à temperatura ambiente. Em seguida, lave as lâminas em PBS por 10 minutos, três vezes.

Em seguida, incube as lâminas com os anticorpos secundários fluorescentes apropriados no escuro por uma hora à temperatura ambiente e despreze o líquido das lâminas. Lave-as então em PBS por cinco minutos, três vezes, para colorar os núcleos; incube as células com 0,1 microgramas por mililitro de DPI por um minuto. Em seguida, despreze o líquido das lâminas e lave em PBS.

Por fim, utilizando um meio de montagem à base de resina, monte uma lamela sobre a amostra celular, selando-a com esmalte incolor e realize a imagem com um microscópio fluorescente. As formas de onda fotoacústicas provenientes de células brancas do sangue e células de melanoma são mostradas aqui à esquerda. As células brancas do sangue, que não possuem pigmentação inerente, não produzem ondas fotoacústicas e se manifestam como uma linha plana de ruído eletrônico à direita.

No entanto, as células de melanoma pigmentadas produzem uma onda fotoacústica intensa. Após a imunocitoquímica, coloração química, células de melanoma cultivadas apresentam sinais pontilhados em azul, sendo que uma célula marcada é destacada em verde sobrepondo as imagens de DPI e mart-1 com CD45 como indicador de leucócitos. Esta figura mostra células de melanoma entre vários glóbulos brancos após seu desenvolvimento.

Nossa técnica abrirá caminho para pesquisadores na área de detecção de câncer explorarem o fenômeno da metástase, a fim de aprimorar a detecção do câncer e, em última instância, curar sua disseminação fatal.