Monitoramento adsorção de proteínas com Solid-state Nanoporos

O objetivo geral deste procedimento é criar nanoporos em membranas artificiais para utilização em estudos de absorção de proteínas. Isso é realizado perfurando nanoporos em uma membrana de nitreto utilizando um microscópio eletrônico de transmissão (STEM). Em seguida, o nanoporo é inserido em uma câmara e umedecido com uma solução iônica.

Para que o fluido forme uma ponte de um lado do nanoporo ao outro, preparando-o para experimentos. Uma voltagem é aplicada através dele e pode-se observar uma corrente de íons passando por ele. O passo final é adicionar proteína à câmara do nanoporo.

A observação final de bloqueios de longa duração na corrente iônica através da nanoporosidade revela a absorção de proteínas nas laterais do nanoporo. Olá, sou Dave Wicki. Sou aluno de pós-graduação no Departamento de Física da Universidade de Syracuse.

Embora este método possa fornecer informações sobre a absorção de proteínas em superfícies inorgânicas, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como interações entre proteínas e ácidos nucleicos, espectroscopia de molécula única e o estudo de moléculas em espaços confinados. Comece elevando o microscópio à tensão de aceleração.

Em seguida, carregue uma grade com janela de nitreto de silício SPI no porta-amostras de MET. Limpe a grade com plasma de oxigênio por 30 segundos para remover detritos. Antes de carregar a amostra, coloque o porta-amostras no MET e aguarde a estabilização do vácuo.

No modo de MEV em campo claro, localize a janela de nitreto, um quadrado brilhante no programa bruto. Certifique-se de que o MEV está alinhado corretamente. Em seguida, alinhe e foque a amostra.

Agora coloque o sistema no modo MEV e utilize um detector deslocado para imagens a amostra e verificar seu alinhamento. Se presente, ajuste o monocromador para um valor baixo, permitindo uma corrente mais alta de elétrons disponível para perfuração. Selecione o tamanho de ponto apropriado para perfurar o Nanoporos com base no diâmetro do feixe de elétrons.

Com o estilete alinhado. Utilize o BROGRAM para focar perfeitamente na membrana de nitreto na ampliação requerida. Se houver qualquer movimento da amostra, desligue o feixe de elétrons e aguarde a amostra estabilizar.

Isso pode levar até uma hora. Uma vez estabilizado, coloque a sonda eletrônica sobre a amostra e inicie a perfuração do nanoporo. A perfuração de um nanoporo com um TM exige paciência e precisão.

É um processo no qual o nitreto é gradualmente dissipado sob uma sonda de feixe de elétrons. É importante manter a sonda de elétrons diretamente acima do local de perfuração e confirmar que o nanoporo foi completamente perfurado. Antes de remover a amostra do MET, verifique periodicamente a amostra por meio de varredura com o detector desligado.

Se a amostra deslocar ligeiramente, ajuste a posição do feixe de elétrons para ficar sobre a nanoporosidade. Com o gram da ROI em foco, a película de nitreto cintilante desaparecerá. Quando a nanoporosidade se formar com o gram roky fora de foco, a franja da borda desfiada será visível.

Faça a imagem do nanoporo com o feixe desligado e crie um perfil de intensidade da imagem. O diâmetro do nanoporo pode ser estimado pela região mais escura do perfil. O feixe de elétrons pode ser usado para ampliar o nanoporo, se necessário.

Quando atingir o diâmetro necessário. Mude para o modo TEM com o monocromador na configuração padrão. Utilize o TEM em campo claro para confirmar o tamanho dos poros.

Inicie preparando a solução salina desgaseificada. Submeta a solução a vácuo e sonique em banho por 20 minutos. Coloque delicadamente o Nanoporo frágil contendo o chip de nitreto de silício em um béquer Pyrex de 10 mililitros. Em seguida, em uma capela, coloque o béquer sobre uma placa aquecedora.

Limpe com muito cuidado o chip Nanopore com solução de piranha. Primeiro, adicione três mililitros de ácido sulfúrico ao recipiente usando uma pipeta de vidro. Em seguida, adicione cuidadosamente um mililitro de peróxido de hidrogênio concentrado ao ácido sulfúrico.

Adote todas as precauções. Deixe o chip de nanoporosidade embebido por 10 minutos. Em seguida, utilizando uma pipeta de vidro, remova a solução de piranha do béquer e descarte-a adequadamente.

Em seguida, encha o béquer com água desionizada desgaseificada. Usando uma pipeta de vidro limpa, esvazie o béquer de água e repita essa lavagem pelo menos cinco vezes. Com pinças limpas, remova o chip de nanoporos e seque-o com sucção suave.

Uma vez seco, selle imediatamente o chip de nanoporos na câmara. O chip pode ser fixado na câmara por meio de anéis O ou selante de silicone. Encha a câmara com solução de cloreto de potássio.

Conecte os eletrodos de prata e cloreto de prata à câmara. Os eletrodos podem ser fabricados mergulhando um fio de prata em água sanitária durante a noite. Aplique um potencial transmembrana através dos eletrodos e monitore a resposta de corrente utilizando um amplificador de patch clamp.

No modo de fixação de voltagem, construa uma curva corrente-voltagem a partir das medições. A curva deve ser altamente linear. Ao utilizar cloreto de potássio a um molar, a condutância do nanoporo deve corresponder ao seu diâmetro.

Se o nanoporo não exibir uma curva IV linear, a condutância é muito baixa ou a corrente aberta do nanoporo não é estável. Isso indica que o nanoporo não está adequadamente acoplado e a lavagem piha deve ser repetida. É essencial garantir que haja fluido dentro do nanoporo.

Se esta etapa não for realizada corretamente, a corrente iônica através do nanoporo exibirá ruído muito elevado e a partição de proteínas no nanoporo será drasticamente reduzida. Comece adicionando uma amostra purificada da proteína de interesse na câmara do banho aterrado. Aguarde a difusão completa da amostra.

Aplicar uma polarização de tensão de potencial transmembrana com polaridade oposta à da carga total da proteína em estudo. Um potencial aplicado de 200 milivolts deve ser suficientemente alto para permitir a observação. A maioria dos eventos de analitos proteicos aparecerá como deflexões transitórias da corrente em relação à linha de base.

Se nenhum sinal for observado, aumente a concentração da proteína na câmara. Tensões mais altas melhoram a relação sinal-ruído e o nitreto. As nanoporos podem suportar várias voltagens.

As absorções de proteínas aparecerão como mudanças de longa duração na corrente de base do Nanopor. Os resultados típicos para nanoporos de estado sólido serão os seguintes. A corrente do poro aberto deve ser altamente estável.

As características IV do nanoporo devem ser altamente lineares. Em cloreto de potássio 1 molar, fosfato de potássio 10 molar pH 7,4, a inclinação de um ajuste linear à curva IV fornecerá a condutância unitária do nanoporo. A condutância possui uma relação direta com o diâmetro do nanoporo e deve corresponder à equação.

Esse valor deve corresponder dentro de 30%. Se o valor for muito pequeno, é provável que o poro não esteja associado à adição da proteína. Eventos rápidos devem ocorrer após a absorção da proteína, que se manifesta como uma queda prolongada na corrente. Algumas proteínas são altamente lábeis e sofrem transformação estrutural no interior do poro.

Neste caso, a queda de tensão de longa duração será acompanhada por flutuações rápidas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fabricar nanoporos em estado sólido utilizando um microscópio eletrônico de transmissão com varredura e como utilizar a absorção de proteína SA sintonizada. Não se esqueça de que trabalhar com solução piranha pode ser extremamente perigoso e precauções, como trabalhar em uma capela de exaustão com luvas, um jaleco de laboratório e um avental químico, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.