Monitoramento adsorção de proteínas com Solid-state Nanoporos

O objetivo geral deste procedimento é criar nanoporos em membranas artificiais para uso em estudos de absorção de proteínas. Isso é feito perfurando nanoporos em uma membrana de nitreto usando uma haste. Em seguida, o nanoporo é carregado em uma câmara e é úmido com uma solução iônica.

Assim, esse fluido forma uma ponte de um lado do nanoporo para o outro para deixar o nanoporo pronto para experimentos. Uma tensão é aplicada através dele e uma corrente de íons pode ser observada passando por ele. A etapa final é adicionar proteína à câmara de nanoporos.

Em última análise, a observação de bloqueios de longa duração na corrente iônica através do nanoporo revela a absorção de proteínas para os lados do nanoporo. Olá, sou Dave Wicki. Sou estudante de pós-graduação no Departamento de Física da Universidade de Syracuse.

Embora este método possa fornecer informações sobre a absorção de proteínas em superfícies inorgânicas. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como proteínas, interações de ácidos nucléicos, molécula única para espectroscopia e estudo de moléculas em espaços confinados. Comece elevando a haste a uma tensão de aceleração.

Próxima carga, uma grade de janela de nitreto de silício SPI no suporte de amostra TEM. Limpe a grade com plasma de oxigênio por 30 segundos para limpar os detritos. Antes de carregar a amostra, carregue o porta-amostras no MET e deixe o vácuo bombear.

Usando o modo TEM de campo claro, encontre a janela de nitreto, um quadrado brilhante no rograma bruto. Certifique-se de que o MET esteja alinhado corretamente. Em seguida, alinhe e foque a amostra.

Agora coloque o sistema no modo STEM e use um detector hot off para obter imagens da amostra e verificar seu alinhamento. Defina o monocromador, se presente, para um valor baixo, permitindo uma corrente mais alta de elétrons disponíveis para perfuração. Selecione o tamanho de ponto apropriado para perfurar o Nanopore com base no diâmetro da sonda de elétrons.

Com a haste alinhada. Use o BROGRAM para focar perfeitamente a membrana de nitreto na ampliação necessária. Se houver algum movimento da amostra, em branco, o feixe de elétrons e aguarde a estabilização da amostra.

Isso pode levar até uma hora. Uma vez estabilizado, coloque a sonda de elétrons na amostra e comece a perfurar o nanoporo. Perfurar um nanoporo com uma MT requer infidelidade do paciente.

É um processo no qual o nitreto é gradualmente dissipado sob uma sonda de feixe de elétrons. É importante manter a sonda de elétrons diretamente acima do local de perfuração e confirmar que o nanoporo está completamente perfurado. Antes de remover a amostra do TEM, verifique periodicamente a amostra digitalizando com o detector de desligamento quente.

Se a amostra se desviar ligeiramente, ajuste a posição da sonda de elétrons para ficar sobre o nanoporo. Com o grama ROI em foco, o filme de nitreto cintilante desaparecerá. Quando o nanoporo se forma com o grama fora de foco, a franja da unha desfiada é visível.

Visualize o nanoporo com o hot off e faça um perfil de intensidade da imagem. O diâmetro do nanoporo pode ser estimado pela região mais escura do perfil. A sonda de elétrons pode ser usada para ampliar o nanoporo, se necessário.

Quando tem o diâmetro necessário. Mude para o modo TEM com o monocromador na configuração padrão. Use MET de campo claro para confirmar o tamanho dos poros.

Comece preparando degas di salina. Coloque a solução sob vácuo e em um banho de sonicar por 20 minutos Delicadamente, coloque o frágil nanoporo contendo chip de nitreto de silício em um bico de pirex de 10 mililitros. Em seguida, num exaustor, colocar o copo numa placa de aquecimento.

Limpe com muito cuidado o chip Nanopore com solução de piranha. Primeiro, adicione três mililitros de ácido sulfúrico ao recipiente usando uma pipeta de vidro. Em segundo lugar, adicione cuidadosamente um mililitro de peróxido de hidrogênio alto ao ácido sulfúrico.

Por favor, tome todas as precauções. Deixe o chip de nanoporos de molho por 10 minutos. Em seguida, usando uma pipeta de vidro, remova a solução de piranha do béquer e descarte-a adequadamente.

Em seguida, encha o copo com a água deionizada Degas. Com uma pipeta de vidro limpa, esvazie o copo de água e repita esta lavagem pelo menos cinco vezes. Com uma pinça limpa, remova o chip de nanoporos e seque-o com uma leve sucção.

Depois de seco, sele imediatamente o chip de nanoporos na câmara. O chip pode ser fixado na câmara por anéis de vedação ou selante de silicone. Encha a câmara com solução de cloreto de potássio.

Conecte os eletrodos de prata e cloreto de prata à câmara. Os eletrodos podem ser feitos embebendo fio de prata em alvejante durante a noite. Aplique um potencial transmembrana através dos eletrodos e monitore a resposta de corrente usando um amplificador de patch clamp.

No modo de pinça de tensão, construa uma curva de tensão atual a partir das medições. A curva deve ser altamente linear. Ao usar um cloreto de potássio molar, a condutância do nanoporo deve corresponder ao seu diâmetro.

Se o nanoporo não exibir uma curva IV linear, a condutância é muito baixa ou a corrente aberta do nanoporo não é estável. Isso indica que o nanoporo não está devidamente casado e a lavagem do piha deve ser repetida. Certificar-se de que o fluido está dentro do nanoporo é essencial.

Se esta etapa não for feita corretamente, a corrente iônica através do nanoporo exibirá um ruído muito grande e a partição das proteínas no nanoporo será drasticamente reduzida. Comece adicionando uma amostra purificada da proteína de interesse no banho aterrado da câmara. Aguarde até que a amostra se difunda completamente.

Aplique uma polarização de tensão potencial transmembrana com polaridade oposta à da carga total da proteína que está sendo estudada. Um potencial aplicado de 200 milivolts deve ser grande o suficiente para ser observado. A maioria dos eventos de analitos de proteínas aparecerá como deflexões transitórias de corrente da linha de base.

Se nenhum sinal for observado, aumente a concentração da proteína na câmara. Tensões mais altas melhoram a relação sinal-ruído e nitreto. Os nanoporos podem suportar vários volts.

As absorções de proteínas aparecerão como mudanças de longa duração na corrente de linha de base do Nanopore. Os resultados típicos para nanoporos de estado sólido serão os seguintes. A corrente de poros abertos deve ser altamente estável.

As características IV do nanoporo devem ser altamente lineares. Em um cloreto de potássio molar, fosfato de potássio 10 molar pH 7,4, a inclinação de um ajuste linear à curva IV fornecerá a condutância unitária do nanoporo. A condutância tem uma relação direta com o diâmetro do nanoporo e deve corresponder à equação.

Este valor deve corresponder a 30%Se o valor for muito pequeno, o poro provavelmente não está associado à adição de proteína. Eventos rápidos devem ocorrer absorção de proteína é uma queda de corrente de longa duração. Algumas proteínas são altamente lábeis e sofrem transformação estrutural no interior dos poros.

Nesse caso, a queda de tensão de longa duração será acompanhada por flutuações rápidas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fabricar nanoporos de estado sólido usando um microscópio eletrônico de transmissão de varredura e usando a absorção de proteína SA equilibrada. Não se esqueça que trabalhar com solução de piranha pode ser extremamente perigoso e precauções como trabalhar em uma capela com luvas, um jaleco e um avental químico devem sempre ser tomados ao realizar este procedimento.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.