Name: Transplante de Células-tronco em um In vitro Modelo de isquemia / reperfusão Simulated (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprenda a realizar transplante de células-tronco mesenquimais em modelo in vitro de isquemia/reperfusão cardíaca. Este protocolo padronizado permite avaliar viabilidade celular e interações terapêuticas por microscopia confocal e citometria de fluxo.

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Este trabalho foi financiado pela OTKA (Hungarian Fundo de Investigação Científica) D45933, T049621, TET (Hungarian Ciência e Tecnologia Foundation) A4/04, Arg-17/2006 e SIN, Bolyai, Bolsas e Öveges TÁMOP 4.2.2-08 / 1 / KMR-2008-0004 e 4.2.1 / B 09/1/KMR-2010-0001. OTKA 83803. Gostaríamos de agradecer Gesztes William para fornecer a voz-over.

1. Preparando H9c2 células cardiomyoblast H9c2 cardiomyoblasts ratos foram obtidos a partir ATCC (Wesel, Alemanha) e ampliado em glicose (4,5 g / L) DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, 4 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina e estreptomicina 100 mg / ml. O H9c2 linha celular de mioblastos é derivada de coração de rato embrionárias, é usada como um modelo in vitro para ambos os músculos esqueléticos e cardíaco 8,9. Prepare 12 placa bem de H9c2 células: <ol><li> Remova o meio de cultura de Petri prato de H9c2 células. </li><li> Lave as células duas vezes com 5 ml de PBS e digerir com 2-3 ml 0,05% tripsina / EDTA. </li><li> Coloque placa de Petri por 5 minutos nos 37 ° C incubadora. </li><li> Inibir a tripsina com 10 ml meio de cultura DMEM. </li><li> Girar as células a 1200 RPM por 8 minutos. </li><li> Depois de retirar o sobrenadante, ressuspender as células em um meio de cultura DMEM ml e contagem de células com hemocitômetro usando Trypan coloração azul.</li><li> Semente H9c2 30.000 células em 2 ml DMEM por bem em uma placa de 12 poços. </li><li> Coloque a placa no 37 ° C incubadora de CO 2 por 24 horas. </li></ol> 2. Isquemia simulada / reperfusão Isquemia / reperfusão foi simulada in vitro através da realização de privação de oxigênio glicose (OGD) em H9c2 culturas de células. Este procedimento foi realizado no palco do microscópio confocal Zeiss com o sistema de incubação de células Pecon (Erbach, Alemanha), permitindo a observação das células durante OGD. <ol><li> Remova o meio por aspiração de 12 placa bem de H9c2 células. </li><li> Lave as células duas vezes com PBS. </li><li> Adicionar 3 ml de glicose livre médio por poço. </li><li> Coloque a placa no sistema de incubação de células. </li><li> Iniciar gás nitrogênio para purgar o oxigênio do sistema de incubação. </li><li> Aguarde até que o nível de oxigênio atinge 0,5%, em seguida, iniciar o temporizador. De oxigênio de 0,5% significa aproximadamente 3 mmHg de tensão parcial. Células sujeitas a uma50 minutos de isquemia simulada. </li><li> No final da isquemia simulada, remova a mídia de glicose livre das células. </li><li> Pipetar 2 ml meio de cultura normal para os poços. </li><li> Coloque a placa de 12 poços por 30 minutos nos 37 ° C incubadora de CO 2, este é o &quot;período de reperfusão&quot;. </li></ol> 3. Preparar resgate células-tronco mesenquimais Medula óssea de origem humana foi levada em T75 frascos e diluídas com meio modificado Dulbecco Águia (DMEM) meio de cultura contendo 10% de soro fetal bovino (FCS), 100 U / ml de penicilina e 100 estreptomicina mcg / ml, 4 mM L-glutamina e 1 g / l de glicose. Os frascos foram incubados a 37 ° C em uma atmosfera totalmente umidificado de 5% de CO 2 para 3 dias. Após o período de incubação, a BMSCs aderidos à superfície dos frascos e os demais componentes da medula óssea foram eliminados por lavagem com PBS. O BMSCs utilizadas foram entre 1 e 5 passagens nos experimentos. A identidade de células foi confirmada pela presença de marcadores de linhagem específica de superfície celular por citometria de fluxo. Marcadores de linhagem hematopoiéticas específicos de superfície (CD34, CD45) e marcadores de superfície mesenquimais (CD73, CD90, CD105 e CD166) foram investigados. Durante a isquemia simulada, preparar resgate de células-tronco mesenquimais para transplante. <ol><li> Diluir o corante fluorescente Vybrant fez em razão de 1:200 em meio de cultura DMEM. </li><li> Aspirar médio das células de resgate e adicionar 300 mL com DMEM Vybrant DiD. </li><li> Prato de Petri lugar por 30 minutos nos 37 ° C incubadora de CO 2. </li><li> Remova o meio de cultura de Petri prato de células-tronco mesenquimais. </li><li> Lave as células duas vezes com 5 ml de PBS e digerir com 2-3 ml 0,05% tripsina / EDTA. </li><li> Coloque placa de Petri por 5 minutos nos 37 ° C incubadora. </li><li> Inibir a tripsina com 10 ml meio de cultura DMEM. </li><li> Girar as células a 1200 RPM por 8 minutos. </li><li> Depois de retirar o supernatant, ressuspender as células em um meio de cultura DMEM ml e contagem de células com hemocitômetro usando Trypan coloração azul. </li><li> Depois de 30 minutos no final da reperfusão adicionar 20.000 células-tronco mesenquimais por bem ao pós-isquêmica H9c2 mioblastos cardíacos. </li><li> Lugar de co-cultura de células para a 37 ° C incubadora de CO 2 por 24 horas. </li></ol> 4. Análise com microscopia confocal Após a lesão de isquemia / reperfusão simulados, as células são incubadas em meio de cultura normal para 24 horas. <ol><li> Após 24 horas de lavagem células duas vezes com PBS. </li><li> Mancha as células em 500 solução vivo / morto mL de corante por 30 minutos (5 nM e 400 nM calceína etídio-homodímero-2 em PBS) (5x10 4 células / ml). </li></ol> A avaliação das imagens confocal para as células vivas e mortas selecionados pela morfologia e de fluorescência pode ser realizada com o software ImageJ (National Institutes of Health, EUA). Em caso de co-culturas, MSCs pode ser distinguido do H9c2 células, devido à sua rotulagem célula Vybrant DiD. A proporção de células mortas pode ser avaliada em 4 campos independentes de vista (objetiva de 10x) para cada cultura de uma forma cega 10. H9c2 cardiomyoblasts cultivadas em lamínulas de vidro 42 mm, podem também ser investigado com o tempo de vídeo microscopia de lapso durante e depois da isquemia / reperfusão usando o sistema de incubação de células do microscópio confocal. Célula a célula-interações como a fusão celular e formação de nanotubos intercelular pode ser estudada ao longo do tempo. 5. A análise por citometria de fluxo Após a lesão de isquemia / reperfusão simulados, as células são incubadas em meio de cultura normal para 24 horas. <ol><li> Após 24 horas, colher os meios de cultura. É muito importante recolher o meio de cultura também, porque algumas células mortas poderiam ter separado da superfície da placa de cultura durante a incubação 24 horasção. </li><li> Lave as células duas vezes com PBS e digerir com 0,05% de tripsina-EDTA. </li><li> Inibir a tripsina com meio de cultura DMEM. </li><li> Girar as células eo meio de cultura colhida em 1200 RPM (aproximadamente 150-200g) por 8 minutos. </li><li> Desprezar o sobrenadante. </li><li> Suspender as células em 500 solução vivo / morto mL de corante por 30 minutos (5 nM e 400 nM calceína etídio-homodímero-2 em PBS) (5x10 4 células / ml). </li><li> Transferência de células para citometria de fluxo de tubos. </li><li> Inicie o software Pro CellQuest. </li><li> Para configurar o citômetro de fluxo para medição, controle de preparar amostras de células vivas e mortas. <ol class="lalpha"><li> Placa H9c2 células a uma densidade de 3x10 4 em 12 placas bem como descrito no ponto 1. </li><li> Prepare viver controles célula com trypsinisation única como descrito no ponto 1. </li><li> Prepare os controles de células mortas através de tratamento com 10 mM H 2 O 2 por 1 hora. </li><li> Depois trypsinisation, resuspend viver e controles de células mortas em 500 mL de solução de corante ao vivo / morto (5 nM calceína-AM e 400 nM de etídio-homodímero-2 em PBS). </li></ol></li><li> As configurações de instrumento deve ser ajustado de modo que as células vivas são calceína positivo e de etídeo homodímero negativo, enquanto as células mortas são calceína negativos e de etídeo homodímero positivo. </li><li> A porcentagem dessas populações pode ser expressa como barras em um gráfico e análise estatística podem ser realizadas sobre esses valores. </li><li> Medir os diferentes grupos experimentais. </li></ol> 6. Resultados representativos: Nossos resultados mostraram que acrescentou células-tronco mesenquimais pode melhorar a sobrevivência de células cardíacas pós-isquêmica. Imagens de microscopia confocal revelou direta célula-célula para interações, como a ligação da membrana parcial ou nanotubos intercelular, o que provavelmente desempenham um papel importante na proteção observada 10. Esses nanotubos decorrerá ao longo de distâncias de várias células diameters, e seus diâmetros foram entre 200 e 500 nm (setas brancas). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Formação de nanotubos entre as células. Nanotubos de formação (seta branca) foi observada entre cardiomyoblasts Vybrant Dio rotulados e DiD Vybrant rotulados células-tronco mesenquimais. Citometria de fluxo mostraram as populações de sobreviver e cardiomyoblasts necrótico e células-tronco mesenquimais. Curiosamente, também observamos uma terceira, &#39;feridos&#39; população de células que continha cardiomyoblast calceína mas também continha o indicador das células mortas, homodímero de etídio (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Representante dot-plot dos diferentes populações de células após a isquemia simulada. A avaliação de vários experimentos showed que a adição de células-tronco mesenquimais para cardiomyoblast H9c2 pós-isquêmica aumentou significativamente a percentagem de células vivas em comparação com os mioblastos cardíacos cultivadas somente após a isquemia (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. . Efeito do tratamento com células-tronco em cardiomyoblasts pós-isquêmica Percentagem de células vivas foi significativamente reduzida após isquemia simulada em relação ao controle (controle versus modelo de IR: 90,36 ± 2,60 vs 10,52 ± 0,48, *** p &lt;0,001), que aumentou após a adição de células-tronco mesenquimais (IR modelo vs IR + BMSC: 10,52 ± 0,48 vs 25,21 ± 2,13, *** p &lt;0,001). Os dados representam média ± SEM. Análise estatística dos dados foi realizada utilizando uma forma de análise de variância com pós Tukey de comparações múltiplas hoc teste.

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<li>Lim, Y. J., Zheng, S., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+Preconditions+Purkinje+Cells+against+Cell+Death+under+In+Vitro+Simulated+Ischemia%2FReperfusion+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Morphine Preconditions Purkinje Cells against Cell Death under In Vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Conditions.</a> Anesthesiology. 100, 562-562 (2004).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo demonstrado in vitro é uma abordagem para a questão muito mais complexa da terapia com células-tronco em infarto do miocárdio, com todas as vantagens e desvantagens de tal modelo. Obviamente, ele não pode refletir a complexa (imunológica, por exemplo) eventos que ocorrem durante e após infarto do miocárdio, mas pode se concentrar sobre os efeitos diretos das células adicionado nas células pós-isquêmica. Os efeitos da isquemia simulada sobre H9c2 cardiomyoblasts depende muito do tempo de OGD, sobre o número p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> calceína-AM </td><td> Sondas moleculares </td><td> L3224, C3099 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr><tr><td> homodímero de etídio-2 </td><td> Sondas moleculares </td><td> L3224, E3599 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr><tr><td> Vybrant DiD </td><td> Sondas moleculares </td><td> V22887 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Reagentes. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do equipamento </td><td> Companhia </td><td> Comments (opcional) </td></tr><tr><td> Pecon sistema de incubação de células para microscópios Zeiss </td><td> Pecon GmbH </td><td> <a href="http://www.pecon.biz/">www.pecon.biz/</a> </td></tr></tbody></table> Equipamentos tabela 2..

transplante de células-tronco em um in vitro modelo de isquemia / reperfusão simulated

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Protocolos de transplante de células-tronco estão encontrando seu caminho na prática clínica 1,2,3. Obter melhores resultados, fazendo com que os protocolos mais robustos, e encontrar novas fontes de células implantáveis ​​são o foco de pesquisas recentes 4,5. Investigar a eficácia de terapias celulares não é uma tarefa fácil e novas ferramentas são necessários para investigar os mecanismos envolvidos no processo de tratamento 6. Nós projetamos um protocolo experimental de isquemia / reperfusão, a fim de permitir a observação de conexões celulares e mecanismos subcelulares mesmo durante a isquemia / reperfusão e após o transplante de células-tronco e para avaliar a eficácia da terapia celular. H9c2 cardiomyoblast células foram colocadas em placas de cultura de células 7,8. Isquemia foi simulado com 150 minutos em um meio de glicose livre com nível de oxigênio abaixo de 0,5%. Então, a mídia normal e os níveis de oxigênio foram reintroduzidos para simular reperfusão. Após a privação de glicose oxigênio,as células danificadas foram tratados com transplante de medula óssea humana rotulados derivados de células-tronco mesenquimais, adicionando-os à cultura. Células-tronco mesenquimais são as preferidas em ensaios clínicos, porque eles são facilmente acessíveis com cirurgia minimamente invasiva, facilmente expansível e autólogo. Após 24 horas de co-cultivo, as células foram coradas com calceína e de etídeo-homodímero de diferenciar entre células vivas e mortas. Esta configuração permitiu investigar as conexões intercelulares por microscopia de fluorescência confocal e quantificar a taxa de sobrevivência de células pós-isquêmica por citometria de fluxo. Microscopia confocal mostrou as interações das duas populações de células, tais como fusão celular e formação de nanotubos intercelular. Citometria de fluxo revelou três grupos de células danificadas que podem ser plotados em um gráfico e analisados ​​estatisticamente. Essas populações podem ser investigados separadamente e conclusões podem ser tiradas destes dados sobre a eficácia do simuladoabordagem terapêutica.

Demonstramos como configurar um<em&gt; In vitro</em&gt; Isquemia / reperfusão modelo e como avaliar o efeito da terapia com células-tronco em células cardíacas pós-isquêmica.

Transplante de Células-tronco em um In vitro Modelo de isquemia / reperfusão Simulated

Os protocolos de transplante de células-tronco estão sendo incorporados à prática clínica1,2,3. Obter melhores resultados, tornar os protocolos mais robustos e...

Células derivadas do coração são colocadas em placas de cultura celular para simular isquemia. O modelo de reperfusão é obtido com 150 minutos em meio sem glicose, enquanto o nível de oxigênio permanece abaixo de 0,5%. Esse período isquêmico leva à contração e formação de bolhas na maioria das células. Em seguida, os níveis normais de meio e de oxigênio são reintroduzidos para simular a reperfusão.Células-tronco mesenquimais são adicionadas e cultivadas juntamente com as células danificadas. Após 24 horas de cocultivo, as células são coradas com cálcio e etídio homodímero para diferenciar células vivas de mortas. A microscopia confocal mostra claramente as duas populações celulares e suas interações. A análise por citometria de fluxo revela três agrupamentos de células danificadas, que podem ser representados em um gráfico e analisados estatisticamente. O transplante de células-tronco. Protocolos estão sendo incorporados à prática clínica, obtendo melhores resultados, tornando os protocolos mais robustos e buscando novas fontes para células implantáveis, sendo o foco das pesquisas recentes.Investigar a eficácia de terapias celulares não é uma tarefa fácil e são necessárias novas ferramentas para estudar os mecanismos envolvidos no processo de tratamento. Desenvolvemos um protocolo experimental com o objetivo de permitir a observação de conexões celulares e até mesmo mecanismos subcelulares durante a isquemia, a lesão por reperfusão e após o transplante de células-tronco. Nossos critérios de design, nosso sistema totalmente in vitro, mas apenas as células hospedeiras e as células doadoras estão presentes.Assim, é isolada do tecido circundante. Medição contínua da viabilidade celular antes, durante e após a lesão, por até 24 horas. E identificação clara de ambas as populações celulares, para que o destino das células enxertadas possa ser rastreado.Para alcançar este objetivo, estabelecemos um protocolo de privação de oxigênio e glicose, comumente abreviado como OGD, seguido por um período de reoxigenação. Nossa escolha de células hospedeiras foi a linhagem celular de mioblastos cardíacos conhecida como células C2C12. Após o OGD, as células danificadas foram auxiliadas pelo transplante de células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea, adicionando-as ao cultivo.Essa configuração permitiu-nos investigar as conexões intercelulares utilizando microscopia confocal e quantificar a taxa de sobrevivência de células danificadas por citometria de fluxo. Vamos começar e ver como fazemos isso. Remova o meio de cultura das células H nine C two.Lave as células duas vezes com PBS e faça a digestão com tripsina 0,05% EDTA em placas de Petri por cinco minutos. Em um incubador a 37 graus, iniba a tripsina com meio de cultura DMEM. Centrifugue as células a 1200 RPM por oito minutos.Após remover o sobrenadante, ressuspenda as células em um mililitro de meio de cultura DMEM, conte as células com o citômetro utilizando coloração com azul de tripano: 30.000 células H9C2 por poço. Em uma placa de 12 poços, coloque a placa na incubadora de dióxido de carbono a 37 graus por 24 horas. Remova o meio por aspiração e lave as células duas vezes com PBS.Adicione três milímetros de meio sem glicose. Coloque a placa no sistema de incubação celular. Inicie o gás nitrogênio para remover o oxigênio do sistema de incubação.Aguarde até que o nível de oxigênio atinja 0,5%. Em seguida, inicie o cronômetro. Um oxigênio de 0,5% corresponde a aproximadamente três milímetros de mercúrio de pressão parcial. Submeta as células a 150 minutos de isquemia simulada. Durante a isquemia, as células começam a se destacar da superfície e suas membranas iniciam a formação de bolhas. Descobrimos que cada população necessita de tempos ligeiramente diferentes para atingir uma imagem celular de 60 a 80%.Por isso, sugerimos começar com a incubação de duas R. E se isso não for suficiente, aumentar o tempo de DGO. Em nosso caso, as células C2 de nove dias de idade normalmente precisam de 150 a 70 minutos de DGO ao final da isquemia simulada.Remova o meio sem glicose das células e pipete o meio de cultura normal para os poços. Coloque uma placa de 12 poços por 30 minutos no incubador de dióxido de carbono a 37 graus. Este é o período de reperfusão.Durante a isquemia simulada, prepare as células de resgate para transplante. Dilua a dieta fluorescente, vibrant DID, na proporção de um para 200 em meio de cultura DMEM. Aspire o meio das células de resgate e adicione 300 microlitros de DMEM provenientes dos discos de Petri vibrant Brent Place, incubando por 30 minutos no incubador de dióxido de carbono a 37 graus.Após 30 minutos, no final da reperfusão, adicione mil células-tronco mesenquimais por poço aos mioblastos cardíacos H nine C two pós-isquêmicos. Os passos iniciais são os mesmos de semeadura H nine C two, lavagem duas vezes com PBS, tripsinização e contagem. Incube o cultivo celular em co-cultivo no incubador de dióxido de carbono a 37 graus por 24 horas.Após 24 horas, colete o meio de cultura e as células aderentes dos poços com ization. É muito importante coletar também o meio de cultura, pois algumas células mortas podem ter se destacado da superfície da placa de cultivo durante a incubação de 24 horas.Suspenda as células em 500 microlitros de solução viva, morta, moribunda, cinco NMO de cálcio e 400 NMO de homodímero de etanolamina em PBS com cinco vezes 10 à potência de quatro células por mililitro. No caso de culturas co, as células-tronco mesenquimais são diferenciadas das células H nine C dois pela marcação fluorescente específica de cada tipo celular. Dessa forma, é possível detectar fusão celular e locais de contato célula a célula.A proporção de células mortas pode ser avaliada em quatro campos independentes de visão, utilizando uma objetiva de 10 vezes para cada cultura de forma cega, o que fornece um resultado reprodutível da contagem celular. Transfira as células para tubos de citometria de fluxo. Inicie o software Cell Quest Pro para configurar o citômetro de fluxo para a medição.Prepare amostras controle de células vivas e mortas. As células vivas são cultivadas na mesma densidade, em condições normais, e coradas com cálcio. As células mortas são preparadas com tratamento de uma hora com 10 micromoles de peróxido de hidrogênio, coradas com etídio, homodímero, e colhidas da mesma maneira; as configurações do instrumento devem ser ajustadas de modo que as células vivas sejam positivas para cálcio e negativas para o homodímero de etídio.Embora as células mortas sejam negativas para cálcio e positivas para homodímero de etéreo, a porcentagem dessas populações pode ser expressa em barras em um gráfico e uma análise estatística pode ser realizada sobre esses valores. Descobrimos que a adição de células-tronco saudáveis aumenta a proporção de células sobreviventes na população. Curiosamente, também observamos que as células que foram salvas após a lesão podem ser separadas daquelas que estavam mortas, mas também daquelas que permaneceram vivas.Acreditamos que esta população justifica investigações adicionais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como conduzir experimentos de isquemia simulada com transplante de células-tronco in vitro de maneira padronizada. É isso então.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos. Caso tenha alguma dúvida técnica, não hesite em nos contatar. Estaremos à disposição para ajudar.

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