Transplante de Células-tronco em um In vitro Modelo de isquemia / reperfusão Simulated

Células derivadas do coração são colocadas em placas de cultura celular para simular isquemia. O modelo de reperfusão é obtido com 150 minutos em meio sem glicose, enquanto o nível de oxigênio permanece abaixo de 0,5%. Esse período isquêmico leva à contração e formação de bolhas na maioria das células. Em seguida, os níveis normais de meio e de oxigênio são reintroduzidos para simular a reperfusão.

Células-tronco mesenquimais são adicionadas e cultivadas juntamente com as células danificadas. Após 24 horas de cocultivo, as células são coradas com cálcio e etídio homodímero para diferenciar células vivas de mortas. A microscopia confocal mostra claramente as duas populações celulares e suas interações. A análise por citometria de fluxo revela três agrupamentos de células danificadas, que podem ser representados em um gráfico e analisados estatisticamente. O transplante de células-tronco. Protocolos estão sendo incorporados à prática clínica, obtendo melhores resultados, tornando os protocolos mais robustos e buscando novas fontes para células implantáveis, sendo o foco das pesquisas recentes.

Investigar a eficácia de terapias celulares não é uma tarefa fácil e são necessárias novas ferramentas para estudar os mecanismos envolvidos no processo de tratamento. Desenvolvemos um protocolo experimental com o objetivo de permitir a observação de conexões celulares e até mesmo mecanismos subcelulares durante a isquemia, a lesão por reperfusão e após o transplante de células-tronco. Nossos critérios de design, nosso sistema totalmente in vitro, mas apenas as células hospedeiras e as células doadoras estão presentes.

Assim, é isolada do tecido circundante. Medição contínua da viabilidade celular antes, durante e após a lesão, por até 24 horas. E identificação clara de ambas as populações celulares, para que o destino das células enxertadas possa ser rastreado.

Para alcançar este objetivo, estabelecemos um protocolo de privação de oxigênio e glicose, comumente abreviado como OGD, seguido por um período de reoxigenação. Nossa escolha de células hospedeiras foi a linhagem celular de mioblastos cardíacos conhecida como células C2C12. Após o OGD, as células danificadas foram auxiliadas pelo transplante de células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea, adicionando-as ao cultivo.

Essa configuração permitiu-nos investigar as conexões intercelulares utilizando microscopia confocal e quantificar a taxa de sobrevivência de células danificadas por citometria de fluxo. Vamos começar e ver como fazemos isso. Remova o meio de cultura das células H nine C two.

Lave as células duas vezes com PBS e faça a digestão com tripsina 0,05% EDTA em placas de Petri por cinco minutos. Em um incubador a 37 graus, iniba a tripsina com meio de cultura DMEM. Centrifugue as células a 1200 RPM por oito minutos.

Após remover o sobrenadante, ressuspenda as células em um mililitro de meio de cultura DMEM, conte as células com o citômetro utilizando coloração com azul de tripano: 30.000 células H9C2 por poço. Em uma placa de 12 poços, coloque a placa na incubadora de dióxido de carbono a 37 graus por 24 horas. Remova o meio por aspiração e lave as células duas vezes com PBS.

Adicione três milímetros de meio sem glicose. Coloque a placa no sistema de incubação celular. Inicie o gás nitrogênio para remover o oxigênio do sistema de incubação.

Aguarde até que o nível de oxigênio atinja 0,5%. Em seguida, inicie o cronômetro. Um oxigênio de 0,5% corresponde a aproximadamente três milímetros de mercúrio de pressão parcial. Submeta as células a 150 minutos de isquemia simulada. Durante a isquemia, as células começam a se destacar da superfície e suas membranas iniciam a formação de bolhas. Descobrimos que cada população necessita de tempos ligeiramente diferentes para atingir uma imagem celular de 60 a 80%.

Por isso, sugerimos começar com a incubação de duas R. E se isso não for suficiente, aumentar o tempo de DGO. Em nosso caso, as células C2 de nove dias de idade normalmente precisam de 150 a 70 minutos de DGO ao final da isquemia simulada.

Remova o meio sem glicose das células e pipete o meio de cultura normal para os poços. Coloque uma placa de 12 poços por 30 minutos no incubador de dióxido de carbono a 37 graus. Este é o período de reperfusão.

Durante a isquemia simulada, prepare as células de resgate para transplante. Dilua a dieta fluorescente, vibrant DID, na proporção de um para 200 em meio de cultura DMEM. Aspire o meio das células de resgate e adicione 300 microlitros de DMEM provenientes dos discos de Petri vibrant Brent Place, incubando por 30 minutos no incubador de dióxido de carbono a 37 graus.

Após 30 minutos, no final da reperfusão, adicione mil células-tronco mesenquimais por poço aos mioblastos cardíacos H nine C two pós-isquêmicos. Os passos iniciais são os mesmos de semeadura H nine C two, lavagem duas vezes com PBS, tripsinização e contagem. Incube o cultivo celular em co-cultivo no incubador de dióxido de carbono a 37 graus por 24 horas.

Após 24 horas, colete o meio de cultura e as células aderentes dos poços com ization. É muito importante coletar também o meio de cultura, pois algumas células mortas podem ter se destacado da superfície da placa de cultivo durante a incubação de 24 horas.

Suspenda as células em 500 microlitros de solução viva, morta, moribunda, cinco NMO de cálcio e 400 NMO de homodímero de etanolamina em PBS com cinco vezes 10 à potência de quatro células por mililitro. No caso de culturas co, as células-tronco mesenquimais são diferenciadas das células H nine C dois pela marcação fluorescente específica de cada tipo celular. Dessa forma, é possível detectar fusão celular e locais de contato célula a célula.

A proporção de células mortas pode ser avaliada em quatro campos independentes de visão, utilizando uma objetiva de 10 vezes para cada cultura de forma cega, o que fornece um resultado reprodutível da contagem celular. Transfira as células para tubos de citometria de fluxo. Inicie o software Cell Quest Pro para configurar o citômetro de fluxo para a medição.

Prepare amostras controle de células vivas e mortas. As células vivas são cultivadas na mesma densidade, em condições normais, e coradas com cálcio. As células mortas são preparadas com tratamento de uma hora com 10 micromoles de peróxido de hidrogênio, coradas com etídio, homodímero, e colhidas da mesma maneira; as configurações do instrumento devem ser ajustadas de modo que as células vivas sejam positivas para cálcio e negativas para o homodímero de etídio.

Embora as células mortas sejam negativas para cálcio e positivas para homodímero de etéreo, a porcentagem dessas populações pode ser expressa em barras em um gráfico e uma análise estatística pode ser realizada sobre esses valores. Descobrimos que a adição de células-tronco saudáveis aumenta a proporção de células sobreviventes na população. Curiosamente, também observamos que as células que foram salvas após a lesão podem ser separadas daquelas que estavam mortas, mas também daquelas que permaneceram vivas.

Acreditamos que esta população justifica investigações adicionais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como conduzir experimentos de isquemia simulada com transplante de células-tronco in vitro de maneira padronizada. É isso então.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos. Caso tenha alguma dúvida técnica, não hesite em nos contatar. Estaremos à disposição para ajudar.