Confirmação via metabólica e descoberta através ¹³ C-rotulagem de proteinogénicos Aminoácidos

O objetivo deste protocolo é estudar o metabolismo bacteriano usando análise de metabolismo assistido por carbono 13. Para começar, os micróbios são cultivados na presença de substratos de carbono marcados, que são incorporados às proteínas microbianas. Os micróbios são então colhidos e os aminoácidos são extraídos, hidrolisados e derivatizados.

As amostras são aplicadas a um cromatógrafo gasoso e espectrômetro de massa ou GCMS. Ao traçar os caminhos de transição do átomo entre os metabólitos na rede bioquímica, as vias metabólicas funcionais utilizadas pelo micróbio podem ser determinadas. Eu sou Bert Burla.

O método que apresentamos aqui pode ser usado como um complemento à transcriptômica e proteômica para determinar as vias metabólicas em micróbios. Usamos essa técnica para investigar micróbios fotossintéticos, como cianobactérias, para utilização de carbono miotrófico ou heterotrófico. Neste vídeo, usaremos ANOTHE 5 1 1 42 como uma cepa modelo para demonstrar o uso de substratos de carbono marcados para descobrir novas funções enzimáticas.

Demonstrando o procedimento seremos eu, li Yu e Chu Yang Fang. Comece este procedimento cultivando a bactéria cyana thesei em um meio não rotulado. Quando a bactéria atingir a fase de crescimento logarítmico médio, inocule 3% em volume no meio marcado com carbono 13.

Em seguida, para evitar a introdução de carbono não marcado da subcultura de inóculo inicial no mesmo meio marcado na fase de crescimento do log médio. Quando a bactéria Cy Thesei marcada com carbono 13 atingir a fase intermediária de crescimento logarítmico, colha 10 mililitros por centrifugação. Suspenda novamente o pellet em 1,5 mililitros de ácido clorídrico de seis molares e transfira-o para uma cromatografia gasosa com tampa de rosca de vidro transparente ou frasco para GC.

Tampe os frascos e coloque-os em um forno a 100 graus Celsius por 24 horas para hidrolisar as proteínas da biomassa em aminoácidos. A hidrólise de pellets de biomassa produz 16 dos 20 aminoácidos comuns após a hidrólise, transfira a solução de aminoácidos para dois tubos de microcentrífuga de mililitros e centrifugue a 20.000 Gs por cinco minutos. Após a hidrólise, transferir a solução de aminoácidos para dois tubos de microcentrífuga de mililitros e, em seguida, centrifugar a 20 000 GS durante cinco minutos para depositar as partículas sólidas.

Após a centrifugação, transfira os sobrenadantes para novos frascos de GC para remover partículas sólidas da solução de hidrólise, para que não entrem na coluna de GC. Em seguida, os aminoácidos são dert para processá-los. Volátil para separação por cromatografia gasosa dissolver as amostras secas com 150 microlitros de tetraedrano, THF e 150 microlitros de entrar em silo dimetil butilo e tri fluoro metílico.

O reagente de derivitização T-B-D-M-S incuba todas as amostras em um forno entre 65 e 80 graus Celsius por uma hora. Vortex as amostras ocasionalmente para se certificar de que os metabólitos no frasco para injetáveis estão dissolvidos. Centrifugar as amostras a 20 000 GS durante 10 minutos e, em seguida, transferir o sobrenadante para novos frascos de GC.

O sobrenadante deve ser um programa de solução amarelada clara. As temperaturas do GC são as seguintes, mantendo-se em 150 graus Celsius por dois minutos. Aumente a três graus Celsius por minuto para 280 graus Celsius.

Aumente a 20 graus Celsius por minuto para 300 graus Celsius e segure por cinco minutos. Em seguida, para uma coluna de GC de 30 metros, defina o atraso do solvente para cerca de cinco minutos e a faixa da relação massa/carga entre 60 e 500. Analise as amostras por GCMS usando um volume de injeção de uma a cinco ou de uma a 10 taxas divididas de um microlitro e hélio de gás de arraste de 1,2 mililitros por minuto após a execução.

Analise os dados do GCMS usando o Microsoft Excel. O tempo de retenção de GC e os picos únicos de massa para carga para cada aminoácido são ilustrados nesta figura. T-B-D-M-S. Os aminoácidos derivados são geralmente claramente divididos pelo MS em dois fragmentos carregados: fragmento M menos 57, que contém todo o aminoácido e fragmento M menos 1 59, que não possui o grupo alfa carboxila do aminoácido para leucina e iso leucina.

O pico M menos 57 foi sobreposto por outros fragmentos de picos de massa. N menos 15 pode ser usado para analisar toda a marcação de aminoácidos. Além disso, o grupo F 3 0 2 é freqüentemente detectado na maioria dos aminoácidos e contém apenas o primeiro grupo alfa carboxila e o segundo carbono em uma estrutura de aminoácidos.

No entanto, como este Ms.Peak geralmente tem altas taxas de ruído para sinal, F 3 0 2 não é recomendado para analisar quantitativamente os fluxos metabólicos. A derivitização de aminoácidos ou metabólitos centrais introduz quantidades significativas de isótopos naturalmente marcados, incluindo carbono 13, oxigênio 18, silício 29 e silício 30. O ruído de medição de isótopos naturais no isótopo ou espectro de massa bruta pode ser corrigido usando software publicado.

Os dados finais de marcação isotópica são relatados como frações de massa. Por exemplo, M zero, M1, M dois, M três e M quatro, representando fragmentos contendo zero a quatro carbonos marcados com carbono 13 ciana. Estes 5 1 1 2 não contêm a enzima três anina amônia liase, que catalisa a conversão de três anina em dois ceto butirato na via típica de síntese da ilha.

Portanto, para resolver a via da ilha neste organismo, cyana THESEI 5 1 1 42 foi cultivada em meio ASP dois com glicerol 54 milimolar e analisada por GCMS conforme descrito neste vídeo como mostrado aqui, Cyana Thesei 5 1 1 4 2 utiliza a segunda posição rotulada como glicerol como a principal fonte de carbono, e observamos que a tianina e a alanina cujo precursor é o piruvato, têm um carbono marcado, enquanto a leucina ISO foi marcada com três carbonos. Portanto, síntese e ciana, esses 5 1 1 4 2 não podem ser derivados da rota de tianina empregada pela maioria dos organismos. Por outro lado, a leucina e a leucina ISO têm padrões de marcação idênticos com base no fragmento M menos 15 e no fragmento M menos 1 59.

Por exemplo, o isótopo ou dados de N menos 15 contendo aminoácidos UNFRAGMENTED mostraram marcação idêntica para leucina e leucina ISO. Assim, a leucina e a leucina ISO devem ser sintetizadas a partir dos mesmos precursores, piruvato e acetil-CoA. Esta observação é consistente com a transição de carbono marcada na via do malato de Citra para a síntese da ilha.

Este método pode ser usado para investigar o metabolismo de uma ampla diversidade de micróbios e, uma vez dominado, pode ser realizado do início ao fim em cerca de uma semana.