Confirmação via metabólica e descoberta através ¹³ C-rotulagem de proteinogénicos Aminoácidos

O objetivo deste protocolo é estudar o metabolismo bacteriano utilizando análise metabólica assistida por carbono 13. Para começar, microrganismos são cultivados na presença de substratos de carbono marcados, que são incorporados às proteínas microbianas. Em seguida, os microrganismos são colhidos e os aminoácidos são extraídos, hidrolisados e derivatizados.

As amostras são aplicadas em um cromatógrafo a gás e espectrômetro de massas ou GCMS. Ao rastrear os caminhos de transição dos átomos entre os metabólitos na rede bioquímica, podem ser determinadas as vias metabólicas funcionais utilizadas pelo microrganismo. Eu sou Bert Burla.

O método que apresentamos aqui pode ser usado como um complemento à transcriptômica e proteômica para determinar as vias metabólicas em microrganismos. Utilizamos esta técnica para investigar microrganismos fotossintéticos, como cianobactérias, quanto à utilização de carbono mixotrófica ou heterotrófica. Neste vídeo, usaremos a linhagem modelo ANOTHE 5 1 1 42 para demonstrar o uso de substratos de carbono marcados na descoberta de novas funções enzimáticas.

Para demonstrar o procedimento, estarei acompanhado de Li Yu e Chu Yang Fang. Inicie este procedimento cultivando bactérias de *Cyana thesei* em um meio não rotulado. Quando as bactérias atingirem a fase de crescimento logarítmico média, inocular 3% em volume no meio rotulado com carbono 13.

Em seguida, para evitar a introdução de carbono não marcado do subcultivo inicial do inóculo no mesmo meio marcado durante a fase de crescimento logarítmico médio. Quando as bactérias Cy Thesei marcadas com carbono 13 atingirem a fase de crescimento logarítmico médio, colete 10 mililitros por centrifugação. Re-suspenda o pellet em 1,5 mililitro de ácido clorídrico seis molar e transfira para um frasco de cromatografia gasosa (GC) de vidro transparente com tampa rosqueável.

Tampe os frascos e coloque-os em uma estufa a 100 graus Celsius por 24 horas para hidrolisar as proteínas da biomassa em aminoácidos. A hidrólise de pellets de biomassa produz 16 dos 20 aminoácidos comuns após a hidrólise; transfira a solução de aminoácidos para tubos microcentrífugos de dois mililitros e, em seguida, centrifugue a 20.000 Gs por cinco minutos. Após a hidrólise, transfira a solução de aminoácidos para tubos microcentrífugos de dois mililitros e, então, centrifugue a 20.000 Gs por cinco minutos para depositar as partículas sólidas.

Após a centrifugação, transfira os sobrenadantes para novos frascos de CG para remover as partículas sólidas da solução de hidrólise, evitando que entrem na coluna de CG. Em seguida, os aminoácidos são derivatizados para torná-los voláteis, permitindo sua separação por cromatografia gasosa; dissolva as amostras secas com 150 microlitros de tetrahidrofurano, THF, e 150 microlitros de *tert*-butil-dimetilsilano e metil trifluoro.

Acetamida, reagente de derivação T-B-D-M-S: incubar todas as amostras em estufa entre 65 e 80 graus Celsius por uma hora. Vortexar as amostras ocasionalmente para garantir que os metabólitos no frasco estejam dissolvidos. Centrifugar as amostras a 20.000 ×g por 10 minutos e, em seguida, transferir o sobrenadante para novos frascos de CG.

O sobrenatante deve ser uma solução amarelada clara. As temperaturas do CG são as seguintes: manter a 150 graus Celsius por dois minutos. Aumentar três graus Celsius por minuto até 280 graus Celsius.

Aumente a 20 graus Celsius por minuto até 300 graus Celsius e, em seguida, mantenha por cinco minutos. Em seguida, para uma coluna de CG de 30 metros, ajuste o atraso do solvente para cerca de cinco minutos e a faixa da razão massa/carga entre 60 e 500. Analise as amostras por CG-EM usando um volume de injeção com razão de divisão de um para cinco ou um para 10 de um microlitro e gás de arraste hélio a 1,2 mililitros por minuto, seguindo o ensaio.

Analise os dados de CG-EM utilizando o Microsoft Excel. O tempo de retenção na cromatografia gasosa e os picos únicos de razão massa/carga para cada aminoácido são ilustrados nesta figura. T-B-D-M-S. Os aminoácidos derivados são normalmente claramente divididos pela espectrometria de massas em dois fragmentos carregados: o fragmento M menos 57, que contém o aminoácido inteiro, e o fragmento M menos 159, que carece do grupo carboxila alfa do aminoácido, para leucina e isoleucina.

O pico M menos 57 foi sobreposto por outros fragmentos de picos de massa. N menos 15 pode ser usado para analisar toda a marcação dos aminoácidos. Além disso, o grupo F 3 0 2 é frequentemente detectado na maioria dos aminoácidos e contém apenas o primeiro grupo carboxila alfa e os segundos carbonos na estrutura principal de um aminoácido.

No entanto, como esse pico de Ms.Peak frequentemente apresenta altas razões de ruído em relação ao sinal, F 3 0 2 não é recomendado para analisar quantitativamente os fluxos metabólicos. A derivatização de aminoácidos ou metabólitos centrais introduz quantidades significativas de isótopos naturalmente marcados, incluindo carbono 13, oxigênio 18, silício 29 e silício 30. O ruído de medição proveniente de isótopos naturais na massa bruta ou no espectro pode ser corrigido mediante o uso de software publicado.

Os dados finais de marcação isotópica são relatados como frações de massa. Por exemplo, M zero, M1, M dois, M três e M quatro, representando fragmentos contendo de zero a quatro átomos de carbono marcados com carbono 13 na cianina. Estes 5 1 1 2 não contêm a enzima trianina amônia liase, que catalisa a conversão de trianina em dois ceto butirato na via típica de síntese do isle.

Portanto, para elucidar a via do isle neste organismo, Cyana THESEI 5 1 1 42 foi cultivada em meio ASP dois com glicerol 54 milimolar e analisada por GCMS conforme descrito neste vídeo, conforme mostrado aqui. Cyana Thesei 5 1 1 4 2 utiliza glicerol marcado na segunda posição como fonte principal de carbono, e observamos que a tirosina e a alanina, cujo precursor é o piruvato, possuem um carbono marcado, enquanto a ISO leucina foi marcada com três carbonos. Portanto, a síntese em Cyana, estas 5 1 1 4 2 não pode ser derivada da rota da tirosina empregada pela maioria dos organismos. Por outro lado, a leucina e a ISO leucina apresentam padrões de marcação idênticos com base no fragmento M menos 15 e no fragmento M menos 1 59.

Por exemplo, o isótopo ou os dados de N-15 provenientes de aminoácidos não fragmentados mostraram marcação idêntica para leucina e isoleucina. Assim, a leucina e a isoleucina devem ser sintetizadas a partir dos mesmos precursores, piruvato e acetil-CoA. Essa observação é consistente com a transição de carbono marcado na via do citramalato para a síntese de isoleucina.

Este método pode ser utilizado para investigar o metabolismo de uma grande diversidade de microrganismos e, uma vez dominado, pode ser realizado do início ao fim em cerca de uma semana.