Name: Um Sistema de 3D para condrócitos Cultivar Humanos Articular no líquido sinovial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprenda a cultivar condrócitos articulares humanos em sistema 3D usando fluido sinovial. Este método permite análise de viabilidade, proliferação e expressão de matriz cartilaginosa em condições fisiológicas naturais.

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Gostaríamos de agradecer a Robin Nye (Tufts Medical Center), Tomoya Uchimura e Dana Cairns (Tufts University) para a prestação de ajuda com o armazenamento de líquido sinovial e centrifugação. Este trabalho foi financiado pelo NIH (1R01AR059106-01A1) para LZ

Um sistema 3D para cultivo de condrócitos articular humana em líquido sinovial Neste trabalho, nós encapsulado condrócitos articular humana em esferas de alginato modificado usando um protocolo de produção, sugeriu o encapsulamento (Lonza, e 31). Usando essas construções em 3D, nós desenvolvemos um sistema para a cultura de células em meio de cultura contendo percentuais variaram de líquido sinovial humana e avaliaram estas construções em 3D para a cartilagem da expressão gênica. 1. Prepare condrócitos articular humana (HAC) por três-dimensional encapsulamento (3D) <ol><li> Descongelar um frasco (1 ml) de condrócitos articular humana (HAC) (Lonza) (Passage 2) em 37 ° C banho-maria por 1 min. </li><li> Misture com 1 ml de meio de crescimento de condrócitos (Lonza) e centrifugar a 3000 rpm por 3-5 min para coletar as células. Desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender celular em meio de crescimento de condrócitos (Lonza). </li><li> Células da placa em um tecido de 10 cmplaca de cultura (BD Biosciences), e cultura em meios de crescimento de condrócitos (Lonza) até as células são confluentes. HACS deve ser usado em um número passagem não superior a 3 ou 4 (P3 ou P4). </li><li> Lavar HACS na placa com 155mm NaCl em vez do PBS padrão, seguido de trypsinzation para coletar células para encapsulamento de alginato talão. Uma vez que as células são separadas, spin para baixo as células a 3000rpm por 5min. As células estão agora prontos para encapsulamento 3D. </li></ol> 2. Encapsular HACS em grânulos 3D Ressuspender o HACS em solução de alginato de 1,2% (Sigma) a uma densidade de 8x10 5 células / ml. Número de células foram determinados antes de encapsulamento, utilizando um contador de células padrão. É muito importante para misturar bem para garantir uma distribuição uniforme das células as contas. <ol><li> Pipetar os HAC / mistura solução de alginato em uma seringa 12 ml conectada a uma agulha de calibre 22 (Tyco Healthcare, Inc.). </li><li> Enquanto isso, prepare um copo de 50 mL com 102 mM CaCl 2 em um volume 5 vezes maior do que a solução HAC / aginate. Coloque uma barra de agitação no interior do copo e agitar a 102 mM CaCl 2 solução lentamente (aproximadamente a 150 rpm). </li><li> Segure a ponta da seringa cerca de 6 centímetros acima da superfície da solução de CaCl 2 e adicione a mistura HAC / alginato na solução de CaCl 2 gotas. Em geral, os grânulos de alginato resultantes são dois milímetros de diâmetro, com uma densidade de encapsulamento de cerca de 10 4 células / talão. Nota: A altura da seringa sobre a solução CaCl 2 é importante. Distância mais curta irá resultar em gota em forma esférica, em vez de contas em forma, fazendo com que a integridade mecânica irregular e encapsulamento de células. </li><li> Vamos agitar as contas na solução CaCl 2 por 20-25 min. Enquanto outros protocolos de encapsulamento alginato indicam um tempo de incubação mais curto de 10 minutos, descobrimos que o tempo de incubação com a solução de CaCl 2 maior a integridade do seranúncios. </li><li> Remover a solução CaCl 2, lavar as contas em 2-3, 2-3 vezes volumes de NaCl, e depois uma vez em meio de diferenciação dos condrócitos (Lonza). Enquanto outros alginato de protocolos de encapsulamento envolvem o uso de talão de um filtro para os procedimentos de lavagem acima, descobrimos que os grânulos de alginato, muitas vezes ficam presas no filtro para fora e seca, reduzindo assim a eficiência de encapsulamento. Encontrámo-lo mais eficiente para permitir que os grânulos se depositem no fundo do copo antes de descartar a solução. </li><li> Use uma espátula padrão para transferir as contas em placas de cultura. Nós cultura normalmente de 12 contas por três centímetros bem para dois dias em meio de crescimento de condrócitos para permitir que os condrócitos se ajustar ao processo de encapsulamento no meio em que foram cultivadas em meio antes de mudar para a diferenciação de condrócitos (Lonza) com líquido sinovial. </li></ol> 3. Condrócitos cultura em meio de cultura líquido sinovial <ol><li> Líquido sinovial fresco pode ser obtido a partir de um oclínica utpatient (Obtivemos líquido sinovial de Tufts Medical Center). O líquido sinovial pode ser transferido em tubos de 15ml falcon para o laboratório, e imediatamente centrifugadas a 3000 rpm por 15 min para remover restos celulares. Alíquota livre de células do líquido sinovial em tubos de 1,5 mL de microcentrífuga, para evitar repetidos de congelamento-descongelamento. Sobrenadante pode ser armazenada a -80 ° C até o uso. </li><li> Antes de cultivo, misture o líquido sinovial com meio de diferenciação dos condrócitos (CDM, Lonza) em diferentes proporções volumétricas, com uma concentração constante de ácido ascórbico 100mM e 9 mM CaCl 2 (esta quantidade traço de CaCl 2 é garantir a integridade do alginato esferas). </li><li> Manter a placa em uma plataforma de balanço em uma incubadora de 37 ° C (freqüência de balanço: cerca de 75 vezes / min) para ajudar a distribuição de nutrientes dentro do alginato, e para reduzir a aglutinação das contas. Isto é especialmente importante à medida que a cultura destes condrócitos por um período prolongado de tempo (até 4 semanas). Nota: Embora o crescimento de condrócitos e mídia diferenciação (Lonza) contêm dois antibióticos comumente utilizados gentamicina e anfotericina, não tínhamos qualquer suplemento de antibióticos quando usamos diferentes percentuais de líquido sinovial para cultura de condrócitos. Nenhuma contaminação foi já observado. </li><li> Alterar media misturas cada 2-3 dias. A viscosidade do líquido sinovial tem sido um grande obstáculo em condrócitos cultura encapsulado em grânulos de alginato durante a longo prazo culturas. Encontrámo-lo mais eficaz para diluir meio fluido sinovial suplementado com 102mm CaCl 2 (50% V / V), que também fortalece a integridade das esferas de alginato. Desta forma, o meio pode lentamente ser removido com uma pipeta, sem prejudicar as contas. </li></ol> 4. HACS colheita em grânulos de alginato para a análise de expressão gênica Cuidados especiais devem ser tomados quando a colheita da HACS dos grânulos de alginato para a análise da expressão gênica. <ol><li> Lavar as esferas de alginato 3 times em 102 mM CaCl 2 para cerca de 5 min de cada vez. </li><li> Recuperar os condrócitos, adicionando 55 NaCitrate mM em um volume 4-5 vezes maior do que os grânulos. É importante que os grânulos de alginato são totalmente imersos na solução NaCitrate. Agitar ou rocha por 20-30 min. </li><li> Girar as células e desprezar o sobrenadante. </li><li> RT-PCR para análise, ressuspender o pellet celular em tampão de lise celular (Qiagen RNA isolamento kit), e prosseguir com purificação de RNA. </li></ol> 5. Fix HACS em grânulos de alginato para análise histológica Cuidados especiais devem ser tomados para colher o HACS dos grânulos 3D para análise histológica. <ol><li> Lavar as esferas de alginato de 3 vezes em 102 mM CaCl 2 para cerca de 5 min de cada vez. Completamente lavar o fluido viscoso sinovial, achamos mais eficaz de lavagem com meio de diferenciação dos condrócitos (Lonza) durante a noite, balançando em um 37 ° C incubadora frequência de balanço (: sobre o tempo 75s / min). O meio de crescimento de condrócitos foi usado para garantir a sobrevivência de condrócitos neste lavagem prolongada e para permitir a máxima penetração do agente de fixação. </li><li> Corrigir as contas em etanol 70% durante a noite, e prosseguir com a análise histológica. Para executar a coloração DAPI, incubar alginato com DAPI solução (500ng/ml) para 1hr sob balanço delicado, e lavar por 3 vezes com 102mm CaCl 2 por 15 min a cada vez. DAPI imagens podem ser vistas sob um microscópio fluorescente. As contas também pode ser seccionado para alcian blue e coloração H &amp; E. </li></ol> 6. Resultados representante Nosso método de cultivo em 3D para condrócitos humanos em elevadas percentagens de líquido sinovial é descrita no diagrama esquemático mostrado na Fig.1. Depois de condrócitos humanos foram encapsuladas em esferas de alginato, eles foram autorizados a crescer em meio suplementado com diferentes proporções de líquido sinovial. Por causa da viscosidade do fluido sinovial, é essencialcondrócitos cultura em condições de balanço constante para evitar o acúmulo de construções cartilagem e para assegurar uma distribuição uniforme dos nutrientes. Também é essencial lavar as esferas de alginato extensivamente antes de recuperar os condrócitos, de modo que a fixação ou tampão de lise podem penetrar as esferas (Fig.1). Brilhante campo (BF) imagens de condrócitos na alginato são mostrados na Fig.2. Coloração DAPI foi realizada para confirmar a distribuição usniform das células dentro das contas (Fig. 2). No final do período de cultura de 21 dias, a análise de expressão gênica foi realizada por qRT-PCR. A referência gene GAPDH foi utilizada para a normalização de todos os PCRs, pois estava determinado a ser um dos genes de referência mais confiável para análise de qPCR condrócitos 32. Um exemplo é mostrado na figura. 3, onde foram analisados ​​os resultados de condrócitos articular humana cultivadas no líquido sinovial obtidos a partir de seis pacientes com osteoartrite. Consistente com o fato de que os condrócitos a partirLonza foram expandidos em culturas 2D, o que conduziria inevitavelmente a de diferenciação-33, descobrimos que o Dia 0 condrócitos expressa níveis mínimos de genes matriz da cartilagem (Fig. 3). 3D cultura de condrócitos com meio de diferenciação dos condrócitos (Lonza) ou meio suplementado com líquido sinovial aumentado significativamente cartilagem expressão gênica de colágeno, aggrecan e MMP13, o que indica condrócitos re-diferenciação por Dia 21 (Fig.3) 34. Aumento da percentagem de líquido sinovial na mídia resultou em níveis comparáveis ​​da matriz da cartilagem marcadores de colágeno II e da expressão de mRNA aggrecan (Fig.3 e 3B). Além disso, condrócitos cultivados em 100% fluido sinovial mesmo exibiu uma diminuição na cartilagem degradante expressão do mRNA da enzima MMP13, em comparação com aquelas cultivadas em meio sozinho (Fig.3C). Curiosamente, o nível de expressão de morte celular indicador de caspase 3 diminuiu gradualmente com relações cada vez maior de líquido sinovial, sugerindo que scultura líquido ynovial levou a níveis de apoptose diminuiu (Fig. 3D). Portanto, nossos resultados mostram que os condrócitos articular humana cultivo em altos níveis de líquido sinovial em um ambiente 3D é uma tecnologia viável. Tabelas e Figuras <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3587/3587fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama esquemático do método para a cultura humana condrócitos articular em elevadas percentagens de líquido sinovial em grânulos de alginato 3D. Primeiro, condrócitos e solução de alginato são misturados. Quando aplicado gota a gota, à solução CaCl 2, condrócitos são imobilizadas dentro do reticulado grânulos de alginato-Ca hidrogel. Essas construções 3D são então cultivados em meio de diferenciação dos condrócitos (Lonza) com diferentes proporções de líquido sinovial humana. Após 21 dias de cultivo sob uma condição de balanço, contas de alginato contendo células são lavadas exaustivamente após a qual as células são obtidas para o geneanálise de expressão. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3587/3587fig2.jpg" /> Figura 2. Campo Bright (BF) e imagens DAPI de condrócitos articular humana culturas encapsulado com 0%, 30%, 50%, 70% e 100% líquido sinovial. Condrócitos foram esférico na forma em todas as condições de cultura. Imagens de campo claro (BF) e DAPI foram sobrepostos para confirmar a localização e distribuição dos condrócitos. Inserções, as imagens ampliadas. Pontas de flechas, co-localização de condrócitos em BF e imagens coloração DAPI. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3587/3587fig3.jpg" /> Figura 3. QRT-PCR análise de condrócitos articular humana encapsulado no dia 0 (D0) uma após 21 dias de cultivo (D21), em meio suplementado com proporções variáveis ​​de líquido sinovial (SF) (0%, 30%, 50%, 70 % e 100%). Resultados de quatro amostras independentes são mostrados aqui. GAPDH foi utilizado como referência interna para todos os PCRs. <strong&gt; A. Expressão de mRNA de colágeno II. B. Agrecan expressão mRNA. C. MMP13 expressão mRNA. D. Caspase expressão de RNAm 3. Significância estatística foi avaliada para o Dia 0 Dia amostras e 21 amostras de 0% e 100% líquido sinovial (SF) cultura, utilizando o software Instat. * Indica P &lt;0,05.

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Não temos nada a revelar.

Neste relatório, nós desenvolvemos um método que permite a cultura de condrócitos articular humana em um ambiente 3D em meio que contém altas concentrações de líquido sinovial humana. Líquido sinovial é um dos principais componentes que constituem o ambiente natural na cavidade articular, onde condrócitos articular reside. No entanto, a viscosidade do líquido sinovial tem sido um grande desafio para tridimensional de cultura de longo prazo dos condrócitos. Para superar o desafio de manter uma distribuição uniforme de nu...

Tabela de reagentes e equipamentos específicos: <table border="1"><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número Catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Alginato (sal de sódio de ácido algínico) </td><td> Sigma </td><td> A2158-250G </td><td> Solução 2,4% armazenadas a 40 ° C </td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio dihidratado, Granular </td><td> JT Baker </td><td> A19339 </td><td></td></tr><tr><td width="239" rowspan="2" > Condrogênicos media Crescimento </td><td width="254" rowspan="2" > Lonza </td><td width="182" > CC-3156 (base de mídia) </td><td width="141" rowspan="2" ></td></tr><tr><td width="182" > CC-4409 (suplemento) </td></tr><tr><td width="239" rowspan="2" > Condrogênicos Mídia Diferenciação </td><td width="254" rowspan="2" > LOnza </td><td width="182" > CC-3226 (base de mídia) </td><td width="141" rowspan="2" ></td></tr><tr><td width="182" > CC-4408 (suplemento) </td></tr><tr><td> Humana condrócitos articular </td><td> Lonza </td><td > CC-2550 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole dicloridrato) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td > D9542 </td><td></td></tr><tr><td> RNeasy mini-kit (para extração de RNA) </td><td> Qiagen </td><td > 74104 </td><td></td></tr><tr><td> PCR reagentes: SYBR-verde </td><td> Quanta </td><td > 95053-500 </td><td></td></tr><tr><td> 12 ml da seringa </td><td> Tyco-Kendall-Monoject </td><td > 512852 </td><td></td></tr><tr><td> 22 Gague-Agulha Hipodérmica </td><td> Tyco-Kendall-Monoject </td><td > 8881 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio </td><td> Olimpo </td><td > IX71 </td><td></td></tr><tr><td> Rocker plataforma </td><td> Thermolyne Thermoscientific </td><td > Vari-mix </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td ></td><td></td></tr><tr><td> Seqüências de primers </td><td></td><td ></td><td></td></tr><tr><td> Colágeno IIa-forward </td><td> 5&#39;-CCA CCC TTC ATC TCT CAC AGT-3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> Colágeno IIa-reverse </td><td> 5&#39;-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> MMP13-forward </td><td> 5&#39;-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> MMP13-reverse </td><td> 5&#39;-GAG-AGC GTC TGA AGA CTT ATT CCG-3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> Caspase 3-forward </td><td> 5&#39;-TCA TTC TTA AGG CCT GCC GTG GTA-3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> Caspase 3-reverse </td><td> 5&#39;-TGG ATG AAC GAG CCA CAG TCC -3 TTT &quot; </td><td ></td><td></td></tr></table>

um sistema de 3d para condrócitos cultivar humanos articular no líquido sinovial

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Destruição da cartilagem é uma característica central patológicas da osteoartrose, uma das principais causas de incapacidade em os EUA. Cartilagem no adulto não se regenera de forma muito eficiente in vivo, e como resultado, osteoartrite causa a perda irreversível da cartilagem e é acompanhada por dor crônica e 1,2 imobilidade. Cartilagem engenharia de tecidos oferece grande potencial para regenerar e restaurar a função do tecido. Esta tecnologia envolve tipicamente condrócitos semeadura em andaimes natural ou sintético e cultivar o 3D, resultando em um meio de construir equilibrada ao longo de um período de tempo com um gol de um tecido de engenharia bioquímica e biomecanicamente madura que pode ser transplantado para um local do defeito in vivo 3-6 . Atingir uma condição ideal para o crescimento de condrócitos e deposição de matriz é essencial para o sucesso da cartilagem engenharia de tecidos. Cartilagem na articulação cavidade nativa, na articular superfície do osso é banhada no líquido sinovial. Este líquido claro e viscoso fornece nutrientes para a cartilagem articular avascular e contém fatores de crescimento, citocinas e enzimas que são importantes para o metabolismo dos condrócitos 7,8. Além disso, o líquido sinovial facilita o movimento de baixa fricção entre superfícies cartilaginosas principalmente através de secretar dois componentes-chave, ácido hialurônico e lubricin 9 10. Em contraste, a cartilagem da engenharia de tecidos é mais freqüentemente cultivados em meio artificial. Enquanto esses meios são susceptíveis capaz de proporcionar condições mais definido para o estudo do metabolismo dos condrócitos, líquido sinovial reflete com mais precisão o ambiente natural do qual condrócitos articular residem dentro De fato, o líquido sinovial tem a vantagem de ser fácil de obter e armazenar, e muitas vezes podem ser reabastecidos regularmente pelo corpo. Vários grupos completaram o meio de cultura com líquido sinovial em crescimento humano, coelho, bovinos e cães chondrocytes, mas principalmente utilizados apenas os baixos níveis de líquido sinovial (abaixo de 20%) 11-25. Enquanto condrócitos cavalo, galinha e humanos foram cultivadas em meio com maior percentual de líquido sinovial, estes sistemas de cultura eram bidimensionais 26-28. Aqui apresentamos o nosso método de cultura de condrócitos articular humana em um sistema 3D, com uma alta porcentagem de líquido sinovial (até 100%) durante um período de 21 dias. Ao fazer isso, superamos um grande obstáculo apresentado pela alta viscosidade do fluido sinovial. Este sistema oferece a possibilidade de estudar os condrócitos humanos em líquido sinovial em um ambiente 3D, que pode ainda ser combinado com outros dois fatores importantes (tensão de oxigênio e carga mecânica) 29,30 que constituem o ambiente natural para a cartilagem para imitar o ambiente natural para crescimento da cartilagem. Além disso, este sistema também pode ser utilizada para a dosagem de atividade líquido sinovial em condrócitos e fornecer uma plataforma para o desenvolvimentoregeneração da cartilagem tecnologias e opções terapêuticas para a artrite.

Um sistema 3D de condrócitos articular humana cultivo em altos níveis de líquido sinovial é descrita. Líquido sinovial reflete o microambiente mais natural para a cartilagem articular, e pode ser facilmente obtido e armazenado. Esse sistema, portanto, pode ser usado para estudar a regeneração da cartilagem e para terapêutica de triagem para tratamento da artrite.

Um Sistema de 3D para condrócitos Cultivar Humanos Articular no líquido sinovial

A destruição da cartilagem é uma característica patológica central da osteoartrite, uma das principais causas de incapacidade nos EUA. A cartilagem no adulto não ...

O objetivo geral do experimento a seguir é cultivar condrócitos articulares humanos em fluido sinovial em culturas de longo prazo. Isso é alcançado primeiramente encapsulando condrócitos em microesferas de alginato. Em seguida, os condrócitos são cultivados em fluido sinovial, o que permite que proliferem em um ambiente tridimensional que imita suas condições normais de crescimento.O meio deve ser trocado periodicamente para permitir às células acesso suficiente aos nutrientes. O passo final do procedimento é colher os condrocitos dos microesferas de alginato para análise de expressão gênica e histológica. Essas análises confirmam que os condrocitos cultivados em microesferas de alginato estão viáveis, proliferando e expressando uma quantidade significativa de matriz cartilaginosa.As principais vantagens do uso desta técnica em comparação com os métodos existentes são a análise das células da cartilagem em um ambiente tridimensional, em vez de bidimensional, e o uso do fluido sinovial como meio, em vez de um meio artificial. Assim, a combinação do uso de um constructo tridimensional e do fluido sinovial permite-nos analisá-las em um ambiente mais natural, ao contrário da configuração bidimensional em uma placa e do meio artificial.O método pode ajudar a responder perguntas-chave da área da biologia da cartilagem e engenharia de tecidos. Por exemplo, como as células da cartilagem ou condócitos se comportam no fluido sinovial a longo prazo? Além disso, devemos habituar as células da cartilagem ao fluido sinovial antes de transplantá-las nos hospedeiros?Prepare um frasco de um mililitro de condrocitos articulares humanos ou hacks descongelando-os em água morna por um minuto. Em seguida, misture os hacks em um frasco contendo dois mililitros de meio de crescimento para condrocitos aquecido. Para remover o meio de congelamento, que contém DMSO, centrifugue as células a 3000 RPM durante três a cinco minutos, descarte o sobrenadante e re-suspenda as células em sete mililitros de meio de crescimento para condrocitos.Em seguida, transfira as células para uma placa de 10 centímetros e cultive-as até que as células atinjam confluência. Os hacs devem ser utilizados em número de passagem não superior a três ou quatro. Após atingirem confluência, lave os hacs com uma solução de cloreto de sódio em vez de PBS.Em seguida, recolha as células por tripsinização usando 0,5 mililitros de solução padrão de tripsina-EDTA. Uma vez que as células se destacarem, centrifugue-as e elas estarão prontas para a encapsulação tridimensional. Partindo das células peletizadas, remova o sobrenadante e, em seguida, suspenda-as em uma solução de alginato 1,2% na densidade de 800.000 células por mililitro.Agora prepare uma solução de cloreto de cálcio com cinco vezes o volume da solução de alginato hack. Mantenha a solução sob leve agitação enquanto a solução de alginato hack estiver sendo preparada. Pipete a solução de alginato hack para dentro de uma seringa de 12 mililitros acoplada a uma agulha de 22 gauge.Quando o cloreto de cálcio estiver pronto, mantenha a ponta da seringa cerca de quinze centímetros acima da superfície da solução de cloreto de cálcio. A altura da seringa é excessiva. A solução de cloreto de cálcio é realmente importante.Se você não mantiver a altura suficiente, as esferas não ficarão esféricas nem bem moldadas. Em seguida, adicione a mistura de alginato hack gota a gota. Normalmente, as esferas resultantes têm dois milímetros de diâmetro, com cerca de 10 à quarta células por esfera.Para aumentar a integridade das esferas, deixe-as sob agitação na solução por 20 a 25 minutos. Após a agitação, permita que as esferas sedimentem e decante a solução de cloreto de cálcio. Em seguida, lave as esferas duas a três vezes com solução de cloreto de sódio, utilizando um volume aproximadamente duas a três vezes maior que o volume das esferas.Em vez de usar filtros, mantenha as esferas úmidas permitindo que elas sedimentem entre as trocas da solução de lavagem. Após as lavagens com cloreto de cálcio, realize uma lavagem com meio de diferenciação de condrocitos. Em seguida, usando uma espátula, transfira as esferas para placas de cultura e cultive-as por 48 horas em meio de crescimento de condrocitos antes de mudá-las para o meio de condrocitos.Meio de diferenciação com líquido sinovial, o líquido sinovial deve ser preparado logo após sua coleta. Transfira o líquido sinovial fresco para tubos de 15 mililitros e centrifugue imediatamente a 3000 RPM por 15 minutos. Para remover detritos celulares, o sobrenadante é o líquido sinovial limpo; alíquota o fluido em tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro para ser armazenado a menos 80 graus Celsius até que uma concentração ideal de líquido sinovial seja determinada.Utilize diferentes meios de cultura compostos por fluido sinovial e meio de diferenciação de condrocitos, em proporções volumétricas variáveis, com uma concentração constante de ácido ascórbico e cloreto de cálcio no meio de cultura. Incube as placas em uma plataforma oscilante em um incubador a 37 graus Celsius. Troque o meio a cada dois ou três dias antes de remover o meio antigo.Dilua-o com solução de cloreto de cálcio para reduzir sua viscosidade e, coincidentemente, fortalecer a integridade das esferas. Em seguida, pipete lentamente a partir das placas. As esferas podem ser cultivadas por até quatro semanas antes da colheita, dependendo da produção da matriz de proliferação e dos objetivos do experimento.Ao colher os fragmentos dos grânulos de alginato para análise de expressão gênica ou análise histológica, lave os grânulos de alginato três vezes em solução de cloreto de cálcio sem utilizar filtro para análise de expressão gênica. Isole os condrócitos imergindo-os em citrato de sódio em um volume quatro a cinco vezes maior que o dos grânulos. Agite a mistura por 20 a 30 minutos e, em seguida, centrifugue as células em tubos de 15 mililitros.Descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet celular e o tampão de lise celular de um kit convencional, e prossiga com o protocolo padronizado de purificação de RNA para preparar as esferas lavadas para fixação. Após as lavagens com cloreto de cálcio, utilize um meio de diferenciação para condrócitos da Wash Inc. durante a noite.Fixe as esferas em dois mililitros de etanol 70% por mais de 15 minutos a quatro graus Celsius e prossiga com a análise histológica para coloração dappy. Incube as esferas de alginato em solução de DAPI por uma hora sob agitação suave. Em seguida, lave as esferas três vezes com solução de cloreto de cálcio antes de visualizá-las em microscópio fluorescente.As microesferas também podem ser seccionadas para coloração histológica com Azul de Ian e hematoxilina e eosina; o seccionamento de microesferas de alginato coradas com DAPI, sobreposto a imagens de campo claro, mostrou distribuição uniforme das células dentro das microesferas cultivadas em todas as condições, desde meios sem fluido sinovial até meios baseados inteiramente em fluido sinovial. Ao final do período de cultivo de 21 dias, a expressão gênica foi medida em condrocitos articulares humanos cultivados em fluido sinovial, proveniente de seis pacientes com osteoartrite, o que está de acordo com relatos anteriores. Os condrocitos do dia zero expressaram níveis mínimos de genes da matriz cartilaginosa; o cultivo tridimensional de condrocitos com meio de diferenciação de condrocitos ou meio suplementado com fluido sinovial aumentou significativamente a expressão gênica cartilaginosa de colágeno tipo II, ACAN e MMP-13, o que indica rediferenciação dos condrocitos.No dia 21, o aumento da porcentagem de líquido sinovial no meio resultou em níveis comparáveis de marcadores da matriz cartilaginosa. Condrócitos cultivados em 100% de líquido sinovial apresentaram até mesmo uma diminuição na expressão de mRNA da enzima de degradação da cartilagem MMP-13, em comparação com aqueles cultivados apenas em meio convencional. Curiosamente, o nível de expressão da caspase três, indicadora de morte celular, diminuiu gradualmente com o aumento das proporções de líquido sinovial, sugerindo que o cultivo com líquido sinovial levou a níveis reduzidos de apoptose.Assim, o cultivo de condrocitos articulares humanos e altos níveis de fluido sinovial em um ambiente tridimensional é uma tecnologia viável. Após dominada, a técnica de encapsulação pode levar menos de uma hora para ser concluída. É importante garantir que as microesferas sejam lavadas completamente entre as trocas de meio.E também é preciso ter cuidado para não danificar as perolas ao usar a pipeta.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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