Name: Dissecção e Cultura do Gânglio pintainho Statoacoustic e Explantes da Medula Espinhal em géis de colágeno para Ensaios crescimento de neuritos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Aprenda a dissecar e cultivar gânglios statoacústicos e medula espinhal de embriões de pintainho em géis de colágeno 3D. Este método permite avaliar o crescimento de neuritos em resposta a fatores de crescimento, essencial para pesquisas em neurociência e biologia celular.

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grant RO1DC002756 ea Purdue Research Foundation. Agradecemos a Doris Chang Wu e Wiese para o conselho com experimentos e McPhail Rodney para ajudar com números.

Receitas Pinto Ringers <table border="1"><tbody><tr><td> 7,2 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 0,23 g </td><td> CaCl 2 + 2H 2 O </td></tr><tr><td> 0,37 g </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 0,115 g </td><td> Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 900 ml </td><td> Água (grau de cultura de tecidos) </td></tr></tbody></table> Nota: Ajustar o pH para 7,4. Trazer um volume final de 1000 ml com água. PBS 10X <table border="1"><tbody><tr><td> 40 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 1 g </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 7 g </td><td> Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1,2 g </td><td> KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 450 ml </td><td> Água DEPC </td></tr></tbody></table> Nota: Ajustar o pH para 7,4. Traga finaisvolume para 500 ml com água. Concentração de trabalho (1X) é feita por diluição de 1 parte de ações 10x com 9 partes de cultura de tecidos de água de grau, como o obtido com um sistema de irradiação UV Millipore para gerar água com 18 cm de condutividade mohms. SAG médio explante segurando <ul><li> DMEM/F12 com L-glutamina, 10 mM Hepes </li><li> Insulina 10%, transferindo, Selenium (ITS +1) </li><li> 1% pen-strep </li></ul> Explante meio de cultura <ul><li> SAG médio explante segurando </li><li> 10 ng / ml neurotrofina-3 (NT-3) </li><li> 10 ng / ml fator neurotrófico ciliar (CNTF) </li></ul> Dissecção da medula espinhal e médias empresas holding <ul><li> L-15 </li><li> 10% de soro fetal bovino </li><li> 1% pen-strep </li></ul> Ovos incubar a 37-38 ° C. Esterilizar ferramentas e dissecar prato Sylgard dissecar em etanol 70%. Dissecando pratos e ferramentas também podem ser esterilizados UV durante a noite. <ol><li> Coloque as contas em um microtubo com 1 ml estéril PBS, misturar, e esperar que os grânulos se depositem no fundo do tubo. </li><li> Lave as contas várias vezes através da remoção do sobrenadante após as contas se instalaram e ressuspender em PBS. </li><li> Incubar as contas em proteína purificada (diluído em PBS) ou PBS sozinho (Control) por 1 hora em temperatura ambiente. </li><li> Lave as contas em PBS e armazenar em uma placa de 24 poços com 1ml de PBS até à sua colocação em colágeno. </li></ol> 2. Dissecção ganglionar Statoacoustic <ol><li> E4 em remover o embrião do ovo e coloque-o em um prato com solução de Ringer pinto para remover membranas embrionárias. </li><li> Coloque o embrião numa placa de Petri forrada Sylgard © preenchido com HBSS frio e posição do embrião em seu lado com a vesícula ótica voltada para cima. Pin o embrião para o prato utilizando os pinos de dissecação. </li><li> Usando dois pinos de dissecação, faça um corte horizontal através da pele imediatamente ventral aobolsas canal, aproximadamente onde se encontra com o ducto coclear. Faça um corte vertical anterior e posterior ao SAG. Use uma pinça ou um pino de dissecação para levantar e remover o retalho de pele fronteira com os três cortes. Nota: O SAG está localizado na borda do anteroventral otocyst, a meio caminho entre a bolsa dorsal que é facilmente visível com iluminação brightfield base, eo ducto coclear ventral quais projetos ventromedially e é obscurecido pelos arcos da faringe. O ducto coclear se alonga para sua dimensão dorsoventral aumentará progressivamente em E4 entre Hamburger-Hamilton estágios 23-25 ​​setembro. </li><li> Puxe a otocyst em uma direção posterior para separá-lo do SAG. Deslocar o tecido ao redor da SAG com pinos de dissecção e remova cuidadosamente o SAG do embrião usando # 55 fórceps. Remover grandes pedaços de tecido mesenquimal e feixes de nervos que se projeta da SAG. </li><li> Usando a ponta da pipeta wide-boca, a transferência do explante a um24 poços da placa com 0,5 ml explante SAG segurando médio. Mantenha explantes no gelo ou em temperatura ambiente por até 4 horas. </li></ol> 3. Dissecção da medula espinhal <ol><li> Remover o embrião E6 do ovo e coloque-o em um prato contendo solução de Ringer com pinto. Retire a cabeça e as membranas embrionárias. </li><li> Colocar o corpo em um prato Sylgard © dissecar contendo meio de dissecção fria da medula espinhal. Posição e pin o embrião &quot;para baixo ventral&quot; e caudal de frente para o experimentador. Coloque os pinos de dissecação através de cada membro e até o final anterior. </li><li> Utilizando uma pinça e / ou dissecar pinos, remova cuidadosamente a pele e tecido, se movendo em uma direção ventral, até que a superfície dorsal da medula espinhal é visível. </li><li> Cortar a linha média dorsal da medula espinhal com um pino de dissecação, em uma posterior à direção anterior, em todo o comprimento da medula espinhal. Isso cria um &quot;livro aberto&quot;, como os lados direito e esquerdo da medula espinhal em separado. </li><li&gt; Remover o tecido circundante, lateralmente, para isolar a medula espinhal e expor o gânglio da raiz dorsal (DRG). Remover o DRG e meninges, esfregando um pino de dissecação ou fórceps entre a medula espinhal e DRG. </li><li> Remover a medula espinhal do corpo, segurando a extremidade caudal-a maior parte da medula espinhal com uma pinça e levantando-o e longe do experimentador. Remover DRG restantes e meninges. </li><li> Segure uma das extremidades do cabo da coluna vertebral com uma pinça (ou fixá-lo ao prato) e usar a tesoura para cortar Vannas ao longo da linha média ventral, a bissetriz da medula espinhal. </li><li> Segure uma das extremidades do explante com uma pinça para imobilizar o tecido e usar a tesoura para cortar Vannas explantes pequenos (100-500 hm de comprimento) ao longo do comprimento do tecido. A placa de piso pode ser reconhecido como um espessamento do tecido claro ao longo de uma borda explante. </li><li> Use a ponta da pipeta de boca larga para transferir explantes a uma placa de 24 poços com 0,5 ml de médio dissecção fria. Mantenha explantes no gelo para manter a viabilidade do tecido, fou até 4 horas. </li></ol> 4. Explante cultura com proteínas purificadas para testar capacidade de resposta neurite <ol><li> Prepare uma solução de colágeno 1,5 mg / ml em um tubo de 15 ml cônico, no gelo, de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Verificar a solução de colágeno tem um pH de 7-7,4 papel usando indicador de pH. Ajustar o pH pela adição de NaOH em volumes de 1 mL. </li><li> Transferência de explantes a uma placa de 24 poços usando uma pipeta de boca larga e excesso de líquido aspirado. Explantes múltiplas podem ser cultivadas em um bem, mas deve ser colocada, pelo menos, 500 mm afastados uns dos outros. </li><li> Adicionar 0,5 ml de colágeno para o bem que contém o explante. Posição do explante sobre a superfície inferior do poço. Certifique-se de definir cada cultura completamente antes de prosseguir com o bem próxima, pois o colágeno começa a polimerizar em temperatura ambiente. </li><li> Coloque a placa de cultura sobre a 37 ° C mais quente deslizar por 30-45 min para polimerizar o colágeno. Quando o colágeno tem Polymeterizada ele vai se assemelhar a um gel. </li><li> Adicionar 0,5 ml de meio de cultura morno explante, suplementada com proteínas purificadas (diluído em PBS) ou PBS (controle) e incubar a 37 ° C CO, 5% 2. Efeitos sobre o crescimento de neuritos deve ser visível por 24 horas. NOTA: Nós temos utilizado o mesmo protocolo para explantes SAG cultura até 42 horas. </li></ol> 5. Explante co-cultura com proteína revestido contas para testar crescimento de neuritos direcional <ol><li> Comece com as etapas da cultura explante 4,1-4,4. </li><li> Usando uma pipeta, transferir 1-5 grânulos de PBS para o bem que contém a solução de colágeno e explante. </li><li> Use uma pinça para posicionar contas 5-50 mM a partir da borda do explante. </li><li> Coloque o prato sobre a 37 ° C mais quente deslizar por 30-45 min para polimerizar o colágeno. O tecido ou talão pode tornar-se deslocado à medida que o colágeno sofre polimerização. Verifique as culturas e re-posição tecido e miçangas durante primeiros 5 min. </li><li> Adicionar 0,5 ml SAG mídia para cada poço e incubar por 24 horas. </li></ol> 6. Visualização do crescimento de neuritos por imuno-histoquímica <ol><li> Enxágüe em PBS culturas e correção para uma hora em temperatura ambiente em paraformaldeído 4% em PBS. </li><li> Solte o gel das paredes dos poços, traçando em torno da borda dos géis com a ponta arredondada de uma espátula micro teflon. Executar a immunostain com o gel nos poços. Lavar diversas vezes em PBS. </li><li> Incubar em 0,5 ml de solução de bloqueio (10% soro bovino, 0,1% Triton X-100, azida de sódio a 0,1% em PBS) durante a noite a 4 ° C. </li><li> Incubar em 0,5 ml do anticorpo primário (anti-β-tubulina anticorpo diluído 1:500 em solução de bloqueio) overnight a 4 ° C. </li><li> Lavar diversas vezes em PBS. Incubar em 0,5 ml de anticorpo secundário (Alexa flúor 488 cabra anti-camundongo IgG 2b diluído 1:500) durante a noite a 4 ° C. A partir deste passo em frente, manter as placas no escuro ou embrulhe em papel alumínio, devido à sensibilidade à luz deanticorpos secundários. </li><li> Lavar diversas vezes em PBS e armazenar a 4 ° C em PBS por até uma semana. </li></ol> 7. Resultados representante <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3600/3600fig1.jpg" /> Figura 1. Resultados representativos dos efeitos de promoção de neurite purificada NT-3 e NT-3-revestido contas em explantes SAG E4 pinto. SAG corpos de neurônios e células neurites foram imunocoloração com β-tubulina e fotografada com a objetiva de 10x em um microscópio confocal. Após 24 horas in vitro, explantes SAG exibido conseqüência maior neurite na presença de 100 ng / ml humano purificado NT-3 adicionado ao meio de cultura celular (1B), comparados aos controles (1A). Neurônios SAG foram co-cultivados com contas embebido em 100 ng / ml NT-3 para demonstrar que uma fonte pontual de NT-3 pode promover localmente crescimento de neuritos. Explantes exibidos mais longos e mais densos conseqüência neurite do lado daexplante de frente para o talão em comparação com o lado oposto (1D) e comparados com controle de culturas com contas embebido em PBS (1C). Barra de escala = 200 mM. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3600/3600fig2.jpg" /> Figura 2. Resultados representativos dos efeitos de promoção de neurite purificada Wnt5a e Wnt5a revestido contas em E6 cabo pinto espinhal. Explantes medula espinhal foram imunocoloração com β-tubulina e fotografada com um microscópio confocal. Após 24 horas de crescimento na presença de purificada do mouse Wnt5a (400ng/ml), crescimento de neuritos a partir de explantes medula espinhal pintinho foi aumentada (2B) comparados aos controles cultivados sem Wnt5a (2A). Contas embebido em 500 ng / ml Wnt5a, colocado 300-500 mM a partir da borda de explantes da medula espinhal, também promoveu crescimento de neuritos (2D) em relação ao controle de culturas (2C). Similar co-cultura resultados foram publicados anteriormente com Wnt5a células que expressam 8. Barra de escala = 200mM.

<ol><li>Fekete, D. M., Campero, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Axon guidance in the inner ear.</a> Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).</li>
<li>Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+inner+ear+afferent+connections%3A+forming+primary+neurons+and+connecting+them+to+the+developing+sensory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia.</a> Brain Res. Bull. 60 (5-6), 423-423 (2003).</li>
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<li>Tessarollo, L., Coppola, V., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NT-3+replacement+with+brain-derived+neurotrophic+factor+redirects+vestibular+nerve+fibers+to+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NT-3 replacement with brain-derived neurotrophic factor redirects vestibular nerve fibers to the cochlea.</a> J. Neurosci. 24 (10), 2575-2575 (2004).</li>
<li>Avila, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+support+the+survival+and+neuritogenesis+response+of+developing+cochleovestibular+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons.</a> Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).</li>
<li>Bianchi, L. M., Cohan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+neurotrophins+and+CNTF+on+developing+statoacoustic+neurons%3A+comparison+with+an+otocyst-derived+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor.</a> Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).</li>
<li>Juurlink, B. ernhardH. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+Spinal+Somatic+Motoneurons+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Protocols+for+Neural+Cell+Culture.%22%5BJournal%5D)">Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture.</a> Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).</li>
<li>Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnts+and+Wnt+inhibitors+do+not+influence+axon+outgrowth+from+chicken+statoacoustic+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons.</a> Hear. Res. , (2011).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).</li>
<li>Bourikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+guides+commissural+axons+along+the+longitudinal+axis+of+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord.</a> Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).</li>
<li>Charron, F., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+brain+wiring+functions+for+classical+morphogens%3A+a+role+as+graded+positional+cues+in+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance.</a> Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).</li>
<li>Augsburger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).</li>
<li>Lyuksyutova, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior-posterior+guidance+of+commissural+axons+by+Wnt-frizzled+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling.</a> Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós apresentamos um método para dissecar e cultura SAG E4 e E6 explantes medula espinhal, de bico, sob soro livre de condições. Este procedimento é usado atualmente em nosso laboratório para estudar os efeitos de vários ligantes secretada na sobrevivência SAG neurônio e crescimento de neuritos. Aspectos inovadores deste protocolo incluem o uso de um sistema isento de soro, para explantes cultura eo uso de contas embebido em fatores de crescimento para estudar os efeitos sobre crescimento de neuritos SAG. Um método semel...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> Equipamento </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de dissecção </td><td></td><td></td><td> Nós usamos uma Leica M80 estereomicroscópio com brightfield base de iluminação </td></tr><tr><td> Deslize mais quentes </td><td> CS &amp; E. </td><td></td><td> Colágeno polimerização </td></tr><tr><td> Frango ovo incubadora </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C / 5% CO 2 umidificado de cultura de células incubadora </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Materiais dissecção </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard &amp;cópia; placa de Petri revestidas </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 24 poços da placa de cultura de células </td><td> Corning </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Dumont forceps </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr><tr><td> # 55 Dumont forceps </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr><tr><td> Pinos de aço inoxidável de dissecação </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 26002-10 </td><td> Embrião pinagem, dissecção fina </td></tr><tr><td> Moria colher perfurada </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 10370-17 </td><td> Colheita de embriões / transferência </td></tr><tr><td> 200 mL pontas de pipeta de boca larga </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 118-96R </td><td> Transferência de explante </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E4 e E6 ovos de galinha </td><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Pinto solução de Ringer </td><td></td><td></td><td> Colheita de embriões </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264 </td><td> SAG dissecção </td></tr><tr><td> L15 médio </td><td> Sigma </td><td> L5520 </td><td> Médio dissecção da medula espinhal </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td> Médio dissecção da medula espinhal </td></tr><tr><td> Vannas Tesoura </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> 501778 </td><td> Dissecção da medula espinhal </td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Preparação de colágeno </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rat-tail colágeno tipo I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354249 </td><td> Cultura de explantes </td></tr><tr><td> PBS 10X (estéril) </td><td></td><td></td><td> Para neutralize colágeno </td></tr><tr><td> NaOH 1N (estéril) </td><td></td><td></td><td> Para neutralizar colágeno </td></tr><tr><td> Água destilada (estéril) </td><td></td><td></td><td> Para neutralizar colágeno </td></tr><tr><td> pH papéis indicador (6,0-8,1) </td><td> Whatman </td><td> 2629-990 </td><td> Para verificar o pH colágeno </td></tr><tr><td> 15 ml tubos cônicos </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 818-PG </td><td></td></tr><tr><td> 500 mL pontas de pipeta de boca larga </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 119-R100 </td><td> Ao colágeno pipeta </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cultura de explantes </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 médio </td><td> Sigma </td><td> D8437 </td><td> Explante meio de cultura </td></tr><tr><td> ITS 1 </td><td> Sigma </td><td> I2521 </td><td> Suplemento médio </td&gt; </tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> Suplemento médio </td></tr><tr><td> CNTF (rato) </td><td> Sigma </td><td> C3835 </td><td> Suplemento médio </td></tr><tr><td> NT-3 (humano) </td><td> Sigma </td><td> N1905 </td><td> Suplemento médio </td></tr><tr><td> Purificada do mouse Wnt5a </td><td> R &amp; D Systems </td><td> WN-645-010 </td><td></td></tr><tr><td> Affi-gel gel contas azuis </td><td> Bio-Rad </td><td> 153-7302 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Imuno-histoquímica </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td> Fixação </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> Lavagens </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td><td> Solução de bloqueio </td></tr><tr><td> Sódioazida </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td> Solução de bloqueio </td></tr><tr><td> Soro bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td><td> Solução de bloqueio </td></tr><tr><td> Monoclonal anti-tubulina IgG2b β 1 + anticorpo II </td><td> Sigma </td><td> T8535 </td><td> Etiquetas corpos celulares e neurites </td></tr><tr><td> Alexa flúor 488 cabra anti-rato IgG2 de anticorpos b </td><td> Invitrogen </td><td> A21141 </td><td> Detecta anticorpos β tubulina </td></tr><tr><td> Teflon micro espátula </td><td> VWR </td><td> 57949-033 </td><td> Géis de colágeno liberação do bem </td></tr></tbody></table>

dissecção e cultura do gânglio pintainho statoacoustic e explantes da medula espinhal em géis de colágeno para ensaios crescimento de neuritos

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

Os órgãos sensoriais do ouvido interno de frango são inervados pelos processos periféricos do gânglio statoacoustic (SAG) neurônios. Inervação órgão sensorial depende de uma combinação de pistas de orientação axônio 1 e fatores de sobrevivência duas localizadas ao longo da trajetória de axônios em crescimento e / ou dentro de seus alvos órgão sensorial. Por exemplo, interferência funcional com uma via clássica de sinalização de orientação do axônio, Semaforina-neuropilin, gerado misrouting de axônios ótica 3. Além disso, vários fatores de crescimento expressos nas metas sensoriais do ouvido interno, incluindo Neurotrofina-3 (NT-3) e Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), têm sido manipulados em animais transgênicos, mais uma vez levando a misrouting de axônios SAG 4. Essas mesmas moléculas promover a sobrevivência e crescimento de neuritos de neurônios SAG pinto in vitro 5,6. Aqui, descrevemos e demonstrar o método in vitro estamos atualmente ucantar para testar a capacidade de resposta do neurites SAG pinto de proteínas solúveis, incluindo morfogenes conhecido como o Wnts, bem como fatores de crescimento que são importantes para promover o crescimento SAG neurite e sobrevivência dos neurônios. Usando este sistema modelo, esperamos tirar conclusões sobre os efeitos que ligantes secretados podem exercer sobre a sobrevivência SAG neurônio e crescimento de neuritos. Explantes SAG são dissecados no dia embrionárias 4 (E4) e cultivadas em géis tridimensionais de colágeno sob condições sem soro por 24 horas. Primeiro, a capacidade de resposta neurite é testada por explantes de cultura suplementado com proteína-médio. Então, perguntar se fontes pontuais de ligantes secretada pode ter efeitos direcionais no crescimento de neuritos, são explantes co-cultivados com proteína revestido contas e ensaiadas para a capacidade do talão até localmente promovem ou inibem a conseqüência. Nós também incluímos uma demonstração da dissecção (protocolo modificado 7) e cultura de explantes E6 medula espinhal. Nósrotineiramente usam explantes medula espinhal para confirmar bioatividade das proteínas e proteína-embebido contas, e verificar as espécies reatividade cruzada com tecido de bico, nas condições mesma cultura como explantes SAG. Estes ensaios in vitro são convenientes para a rápida triagem para as moléculas que exercem tróficos (sobrevivência) ou trópico (direcional) efeitos sobre os neurônios SAG, especialmente antes de realizar estudos in vivo. Além disso, este método permite que o teste de moléculas individuais sob condições sem soro, com alta sobrevivência dos neurônios 8.

Demonstramos como dissecar e cultura pinto gânglio statoacoustic E4 e E6 explantes medula espinhal. Explantes são cultivados sob condições sem soro em gel de colágeno 3D por 24 horas. Neuritos resposta é testado com o meio do fator de crescimento suplementado com proteína e revestido contas.

Dissecção e Cultura do Gânglio pintainho Statoacoustic e Explantes da Medula Espinhal em géis de colágeno para Ensaios crescimento de neuritos

Os órgãos sensoriais da orelha interna do frango são inervados pelos processos periféricos dos neurônios do gânglio statoacústico (SAG). A inervação dos órgãos sensoriais...

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar o crescimento de neuritos em neurônios do gânglio estatoacústico cultivados em meio quando diversos fatores de crescimento são adicionados ao meio de cultura. Isso é realizado primeiramente pela dissecação do gânglio estatoacústico e das medulas espinhais controle do embrião, a fim de criar X explantes para cultura. Como segundo passo, os explantes X são colocados em colágeno, seja com proteínas solúveis para testar o crescimento geral, seja com microesferas revestidas com proteínas para testar o crescimento direcional.Próximos X explantes são marcados com anticorpo anti-tubulina beta e analisados em microscópio confocal. Para visualizar os neuritos emergindo do gânglio, são obtidos resultados que mostram os efeitos que ligantes secretados podem exercer sobre a sobrevivência neuronal e o crescimento de neuritos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da pesquisa auditiva, como quais moléculas são importantes para a sobrevivência dos neurônios oticos e o direcionamento axonal enquanto os órgãos sensoriais são inervados.Para iniciar este procedimento, coloque as esferas em um tubo microcêntrifuga com um mi

dissection-culture-chick-statoacoustic-ganglion-spinal-cord-explants

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Neurociência

Este vídeo demonstra como visualizar caminhos axonal de grupos geneticamente definido de neurônios na medula espinhal utilizando pinto...

Decifrando Pathways Axonal dos Grupos geneticamente definidos de neurônios no tubo Neural Utilizando Pintainho In ovo Eletroporação

Este ensaio avalia a capacidade de uma molécula de sinalização, aqui proteína morfogenética óssea 7 (BMP7), para reorientar axônios comissurais. Um explante da medula espinhal dorsal embrionárias cultivadas é adjacente a um agregado de células secretoras de COS os fatores de crescimento candidato. Reorientou axônios comissurais crescendo dentro do explante são visualizados através da imuno-histoquímica.

Doseamento do Capacidade de difusíveis moléculas sinalizadoras para Reorientar embrionárias Spinal Axônios comissural

Explantes a partir do sistema de dopamina mesencéfalo e corpo estriado são utilizados num ensaio de matriz de colagénio para...

Dissecção e Cultura do mouse e dopaminérgico do estriado explantes em três dimensões Ensaios matriz de colágeno

Este vídeo demonstra o processo de isolamento de explantes de gânglios espirais do ouvido interno e co-cultura com o órgão de Corti em uma matriz de multieletrodos. Os gânglios espirais são cuidadosamente extraídos e seccionados em seções de tecido menores ou explantes. Esses explantes são cultivados na área ativa da matriz de multieletrodos para promover o crescimento do processo neuronal.

Cultura de explantes de neurônios do gânglio espiral murino em matrizes de multieletrodos

Este vídeo demonstra a construção de um sistema de cultura de células de três compartimentos usando colágeno e graxa não reativa. Este sistema é usado para observar as interações entre células de glioma e axônios em tempo real.

Preparação de placas de cultura compartimentadas revestidas de colágeno para cultura de células neuronais

Este vídeo demonstra o modelo de cocultura de um explante de gânglio da raiz dorsal e células de Schwann. Em condições de cocultura, o ácido ascórbico promove a diferenciação das células de Schwann em formas mielinizantes. As células mielinizantes de Schwann envolvem os axônios várias vezes para criar uma bainha de mielina, que é essencial para a função nervosa.

Co-cultura de um explante de gânglio da raiz dorsal com células de Schwann para mielinização de neurônios

Aqui descrevemos uma célula de Schwann (SC) ensaio de migração em que SCs são capazes de desenvolver ao longo dos axônios estendem.

Analisando o desenvolvimento de células de Schwann Murino Junto axônios em crescimento

Modelos de cultura celular proporcionar um controle detalhado sobre as condições ambientais e, assim, proporcionar uma plataforma poderosa para elucidar vários aspectos da biologia celular neuronal. Nós descrevemos um método rápido, barato e confiável para isolar, dissociar e cultura neurônios sensoriais a partir de embriões de galinha. Os detalhes da preparação substratos e imunocitoquímica também são fornecidos.

Isolamento e Cultura de Dissociated neurônios sensoriais de Chick Embriões

Apresentamos um protocolo para cultivar explantes primários de neurônios do gânglio espiral murino em matrizes de múltiplos eletrodos para estudar perfis de resposta neuronal e otimizar parâmetros de estimulação. Tais estudos visam melhorar a interface neurônio-eletrodo do implante coclear para beneficiar a audição dos pacientes, bem como o consumo de energia do dispositivo.

Do gânglio espiral Neuron Explant Cultura e Eletrofisiologia em multi-eléctrodos Arrays

As gânglios ciliares filhotes (CG) fazem parte do sistema nervoso parassimpático. Culturas neuronais de neurônios CG foram mostrados como modelos celulares eficazes no estudo das interações musculares nervosas. Descrevemos um protocolo detalhado para a dissecação, dissociação e cultura in vitro de neurônios CG de embriões de filhotes.

Isolamento e Cultura de Chick Ciliary Ganglion Neurons

No sistema de cocultura dos gânglios da raiz dorsal e células de Schwann, a mielinização do sistema nervoso periférico pode ser estudada. Este modelo oferece oportunidades experimentais para observar e quantificar a mielinização periférica e estudar os efeitos de compostos de interesse sobre a bainha de mielina.

Mielinização in vitro de axônios periféricos em cocultura de explantes de gânglios dorsais de rato e células de Schwann

Aprenda a dissecar e cultivar gânglios statoacústicos e medula espinhal de embriões de pintainho em géis de colágeno 3D. Este método permite avaliar o crescimento de neuritos em resposta a fatores de crescimento, essencial para pesquisas em neurociência e biologia celular.

Dissecção e Cultura do Gânglio pintainho Statoacoustic e Explantes da Medula Espinhal em géis de colágeno para Ensaios crescimento de neuritos (Vídeo) | JoVE Journal

Dissecção e Cultura do Gânglio pintainho Statoacoustic e Explantes da Medula Espinhal em géis de colágeno para Ensaios crescimento de neuritos

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