Aplicação de Medidas para MassSQUIRM quantitativa da actividade demetilase Lisina

O protocolo de contorção de massa visa quantificar a atividade da lisina desmetilase usando metilação isotópica e a espectrometria de massa maldi primeiro realiza reações de desmetilação catalisada por enzima em peptídeos contendo lisina metilada. Os resíduos então metilam quimicamente os produtos peptídicos da reação da desmetilase com formaldeído deuterado para produzir peptídeos uniformemente metilados que ionizam da mesma maneira pelo maldi e quantificam cada espécie de peptídeo com espectrometria múltipla a de massa e contabilizam a sobreposição isotópica. A fim de identificar quantidades relativas de peptídeos metilados un mono dye e trimm, os resultados de contorção de massa determinam quantidades relativas de cada produto de reação de desmetilase com base nas mudanças na massa.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a espectrometria de massa mofada de rotina, é que a pontuação de massa é responsável pelas diferenças na ionização entre peptídeos metilados de forma diferente. Tivemos a ideia para essa abordagem quando desenvolvemos um método para medir os níveis de acetilação de histonas usando anidrido acético isotopicamente pesado. O desafio para esta técnica é extrair dados da área de pico, o que pode ser complicado pela sobreposição de envelopes isotópicos de peptídeos.

Para a reação de desmetilase combinou 125 nanogramas de enzima desmetilase específica de lisina recombinante com 0,25 microgramas de peptídeo dimetil histona H três biotinilado em um volume final de 20 microlitros de tampão desmetilase. Prepare também uma amostra de controle contendo 0,25 microgramas de peptídeo sem a enzima LSD uma incubar os tubos de reação e controle por duas horas a 37 graus Celsius. Em seguida, para preparar R, dois grânulos porosos de 20 mícrons misturam volumes iguais de grânulos e metanol.

Em seguida, adicione 10 volumes de ácido fórmico TFA, adicione oito microlitros de esferas porosas a cada amostra e agite por 15 minutos em temperatura ambiente. Enquanto isso, condicione duas pontas de zíper C 18. Pipetagem duas vezes com 20 microlitros de 0,1% TFA quatro vezes com 70% aceto nitrilo 0,1% TFA e quatro vezes novamente com 0,1% TFA.

Em seguida, carregue as duas amostras nas pontas do zíper condicionadas. Com um pipetador, empurre o volume através da resina C 18. Repita até que o volume total de ambas as amostras tenha sido empurrado através das pontas do zíper.

Em seguida, lave as pontas do zíper duas vezes com 20 microlitros de amostras de eluição de 0,1% TFA em um tampão de ilusão de 40 microlitros, continue a secar completamente com um concentrador de velocidade aspirante. Primeiro, ressuspenda a amostra em 100 microlitros de tampão fosfato 50 milimolar pH 7,4. Em seguida, adicione oito microlitros de dimetilamina e 16 microlitros de formaldeído reduzido.

Incube a quatro graus Celsius por duas horas. Repetir a metilação redutora adicionando dimetillamina e formaldeído deuterado e incubar durante duas horas. Na terceira vez, adicione dimetillamina e incube a quatro graus Celsius por 15 horas.

Extinguir a reação com 12,5 microlitros de um molar tris. pH 7,4 prossiga para secar completamente com um concentrador de vácuo rápido. Primeiro Resus, suspender as amostras de controle e reação de desmetilase em 100 microlitros de tampão fosfato 50 milimolar pH 7,4.

Agora adicione oito microlitros de esferas porosas às amostras de controle e reação de desmetilase e colete nas pontas do zíper, conforme mostrado anteriormente. Evite volumes de dois microlitros em uma placa de amostra MALDI e deixe secar à temperatura ambiente até a cristalização. Prossiga para analisar as amostras por espectrometria de massa.

Abra os arquivos do espectro no software de trabalho e exporte para o software M sobre Z. Verifique ainda mais os produtos de reação por espectrometria de massa em tandem. Primeiro, determine a razão da área de pico dos isótopos de carbono 13 C dois e carbono 13 C quatro em relação ao pico monoisotópico para a amostra de controle.

Use essas proporções calculadas para quantificar a quantidade relativa de peptídeo existente em cada modificação. Estado da amostra da reacção da desmetilase. A enzima LSD um pode ser efetivamente usada na quantificação de contorções em massa da desmetilação da lisina.

Como a reação de controle não sofre metilação redutiva, ela indica o envelope isotópico típico para este peptídeo As áreas de pico resultantes determinam as proporções de fundo do peptídeo existente no carbono 13 C dois e no carbono 13 C quatro. Estados isotópicos, áreas de pico do espectro de massa para a reação de controle permitem a quantificação da quantidade relativa de peptídeo existente em cada estado de modificação. Na reação de desmetilase, as áreas de pico dessas reações de controle e desmetilase determinam 33,7% de dimetil lisina 4 42 0,3% monometil lisina quatro e 24% de lisina não metilada quatro.

Essa abordagem de squam em massa oferece informações importantes sobre o campo da epigenética de histonas, como a desmetilação de resíduos de histona lisina contribui para várias doenças. Embora este ensaio de metilação tenha sido aplicado para estudar desmetilases, ele também pode ser usado para estudar metiltransferases.