Construindo um hidrogel de colágeno para a entrega de células-tronco carregado microesferas

Este protocolo oferece uma estratégia in vitro para entregar células-tronco de microesferas de quitosana em um andaime de gel de colágeno, colheita e cultura. As células-tronco primárias dos adipócitos emulsificam e recuperam uma preparação de microesferas de quitosana. Em seguida, semeie as células-tronco nas microesferas de quitosana e cultive-as em uma inserção de placa de cultura de membrana de tamanho de poro de oito mícrons para produzir um CSM carregado com CS, finalmente misture o sistema de entrega de microesferas com um andaime de gel de colágeno tridimensional.

Em última análise, este sistema CSM oferece potencial para uso em medicina regenerativa e administração de medicamentos. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como injeção celular ou microencapsulação, é a capacidade das células de se ligarem a um material transportador e persistirem após a aplicação inicial. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque as microesferas esan têm uma carga estática inerente.

E carregar células sobre um leito de microesferas será um desafio sem perturbá-las. Extirpar e lavar, tecido adiposo perineal e epidérmico de um envoltório picar o tecido e, em seguida, transferir um a dois gramas para 25 mililitros de HBSS contendo 1% de FBS. Após centrifugação, recolher a camada de tecido adiposo flutuante num erlenmeyer de 125 ml.

Adicione 25 mililitros de colagenase tipo dois e incube a reação em um agitador orbital. Agora remova cuidadosamente a fração líquida abaixo da camada de óleo e adiposo e filtre sequencialmente através de filtros de malha de nylon de 170 mícrons. Colher as células por centrifugação após duas lavagens com 25 ml.

HBSS Resus, suspenda o pellet em 30 mililitros de meio de crescimento mesen pro suplementado. Divida as células-tronco derivadas de tecido adiposo purificado em dois frascos de cultura T 75 e amplifique a preparação A SC em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Este protocolo CSM é um processo de emulsificação de água em óleo que utiliza uma técnica de coer iônico.

Emulsione seis mililitros de uma solução aquosa de quitosana em 100 mililitros de uma mistura de fase oleosa usando agitação aérea e magnética simultaneamente em direções opostas por uma hora à emulsão estável de água e óleo, adicione 1,5 mililitros de hidróxido de potássio a 1% em n octal a cada 15 minutos por quatro horas. Após a conclusão da reação de reticulação iônica, decantar lentamente a fase oleosa e adicionar imediatamente as esferas a 100 mililitros de acetona. Lave as esferas com acetona até que a fase oleosa seja completamente removida.

Em seguida, seque as esferas recuperadas no vácuo. Dessecar determinar a área superficial média do tamanho das partículas CSM por miligrama e o volume cúbico unitário usando o analisador de tamanho de partículas. Prossiga para lavar o CSM três vezes com água estéril para remover os sais residuais.

Agora esterilize a preparação CSM com álcool absoluto para uso em experimentos celulares em um tubo de vidro de 50 mililitros, misture cinco miligramas de microesferas com um mililitro de solução de 0,5% TNBS e incube por quatro horas a 40 graus Celsius. Em seguida, adicione três mililitros de seis ácido clorídrico normal e incube a 60 graus Celsius por duas horas. Depois de resfriar as amostras à temperatura ambiente, adicione cinco mililitros de água deionizada e 10 mililitros de éter Ethel.

Para extrair o TNBS livre, remova uma alíquota de cinco mililitros da fase aquosa e aqueça a 40 graus Celsius em banho-maria por 15 minutos para evaporar qualquer éter residual após resfriamento à temperatura ambiente. Diluir com 15 mililitros de água com um espectrofotômetro. Meça a absorbância das microesferas de quitosana preparadas a 345 nanômetros usando TNBS como branco.

Meça também a quitosana usada para a preparação do CSM. Agora, calcule o número de grupos amino livres do CSM em relação ao número total de grupos amino na quitosana. Equilibre cinco miligramas do CSM esterilizado em HBSS estéril durante a noite.

Transfira o CSM para uma inserção de membrana de oito mícrons para placas de cultura de 24 poços. Depois que o CSM estiver assentado, aspire cuidadosamente o HBSS. Agora adicione 300 microlitros de meio de crescimento no interior da pastilha e 700 microlitros de meio de crescimento na parte externa da pastilha. Resus.

Suspenda as células-tronco derivadas do tecido adiposo em 200 microlitros de crescimento, meio e semente sobre o CSM dentro da placa de cultura. Insira incubar por 24 horas em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Transfira o CSM carregado com SC para um tubo de microcentrífuga estéril sem perturbar as células que migraram para a membrana de inserção.

Agora remova o meio residual e adicione 250 microlitros de meio de crescimento fresco a cada tubo. Adicione 25 microlitros de cinco miligramas por mililitro de solução de MTT e incube por quatro horas. Remova o meio e adicione 250 microlitros de vórtice de óxido de dimetilsulfa para solubilizar a forma de uma centrífuga complexa, o CSM a 2.700 G por cinco minutos.

Meça a absorbância do sobrenadante em 570 nanômetros usando 630 nanômetros como referência. Proceder à determinação do número de células associado ao CSM em relação ao valor de absorvência obtido a partir de números conhecidos de A SC viável. Misture cinco miligramas de um CSM carregado com SC com 7,5 miligramas por mililitro. Colágeno tipo um extraído de ratos.

Tendão da cauda, ajuste o pH para 6,8 usando dois hidróxidos de sódio normais e despeje em uma placa de cultura. Insira para fibrilar agora transfira para uma placa de 12 poços e incube por 30 minutos. Continue a atualizar o meio para os géis de colágeno A-S-C-C-S-M a cada dois dias do período de incubação.

Também monitore, libere e migre células do CSM para o gel usando técnicas de microscopia padrão. O exemplo a seguir descreve a estratégia in vitro para fornecer células-tronco derivadas de tecido adiposo de microesferas de quitosana em uma estrutura de gel de colágeno. As imagens de MEV e MET indicam uma preparação de CSM poroso de tamanho uniforme.

A incubação das microesferas com células-tronco derivadas do tecido adiposo primário indica 4.000 células por miligrama de cálcio CSM am. A coloração de um SC mostra espalhamento sobre o MSC com filopódios estendidos para as fendas porosas da microesfera. Quando o CSM carregado com células foi misturado com o gel de colágeno, as células migram para o gel e podem ser acompanhadas ao longo do tempo.

As implicações dessa técnica se estendem imediatamente para a terapia da perda tecidual maciça e crônica. No entanto, este regime de tratamento tem muito mais potencial devido à sua versatilidade para se integrar a uma variedade de células e/ou biomateriais usados para tratar diferentes níveis de perdas de tecidos moles e cardíacos. Duvido que esse método possa fornecer informações sobre a entrega da célula hospedeira.

Também pode ser aplicado a outros sistemas, como injetáveis, administração de medicamentos terapêuticos, desenvolvimento de sistemas híbridos para fornecer células e medicamentos terapêuticos juntos.